BÀO CHẾ THUỐC CÓ NGUỒN GỐC

PEPTID VÀ PROTEIN

1
 THUỐC CÓ NGUỒN GỐC PEPTID VÀ PROTEIN DÙNG
TRONG ĐIỀU TRỊ

MỤC TIÊU:
• Hiểu được tầm quan trọng của thuốc có nguồn gốc peptid
và protein sử dụng trong điều trị.
• Phân tích một số công thức thuốc (dùng theo đường
uống, tiêm) sử dụng nguyên liệu có nguồn gốc peptid và
protein .

2
 THUỐC CÓ NGUỒN GỐC PEPTID VÀ PROTEIN DÙNG
TRONG ĐIỀU TRỊ

Ajay K. Banga (2015), Therapeutic Peptides and Proteins Formulation, Processing, and Delivery Systems, Third Edition
 THUỐC CÓ NGUỒN GỐC PEPTID VÀ PROTEIN DÙNG
TRONG ĐIỀU TRỊ

Thuốc có nguồn gốc peptid

Điều trị bệnh tiểu đường: insulin

CÊu tróc c¬ b¶n insulin

 THUỐC CÓ NGUỒN GỐC PEPTID VÀ PROTEIN DÙNG
TRONG ĐIỀU TRỊ

Thuốc có nguồn gốc peptid

Điều trị bệnh loãng xương: calcitonin

CÊu tróc c¬ b¶n calcitonin

C145H240N44O48S2
 THUỐC CÓ NGUỒN GỐC PEPTID VÀ PROTEIN DÙNG
TRONG ĐIỀU TRỊ

Thuốc có nguồn gốc peptid

Điều trị: Interferon-

Các chuỗi acid amin có trong IFN-α

(trong đó với các ký hiệu của các acid amin là Ala: A, Cys: C, Asp: D, Glu: E, Phe: F, Gly: G, His: H, Ile: I, Lys:
L; Met: M; Asn: N; Pyl: O; Pro: P, Gln: Q, Arg: R, Ser: S, Thr: T, Sec: U, Val: V, Trp: W, Tyr: Y)
THUỐC CÓ NGUỒN GỐC PEPTID VÀ PROTEIN DÙNG
TRONG ĐIỀU TRỊ

• Tiêm
• Uống
• Xông hít
• Qua da
• Niêm mạc mũi
• Niêm mạc miệng
• Đường khác: mắt
THUỐC CÓ NGUỒN GỐC PEPTID VÀ PROTEIN DÙNG
TRONG ĐIỀU TRỊ

Hàng rào sinh học hấp thu thuốc peptid

ĐẶC TÍNH ĐƯỜNG DÙNG THUỐC CÓ NGUỒN GỐC PEPTID
ĐỘ ỔN ĐỊNH THUỐC CÓ NGUỒN GỐC PEPTID & PROTEIN
 ĐỘ ỔN ĐỊNH THUỐC CÓ NGUỒN GỐC PEPTID &
PROTEIN
PHYSICAL INSTABILITY - Denaturation

▪ Denaturation refers to a disruption of the higher-order

structure, such as secondary and tertiary structure of a

protein.

▪ Denaturation, which may be reversible or irreversible, can be

caused by thermal stress, extremes of pH, or denaturing

chemicals. Denaturation typically involves unfolding of the
protein.

11
Ajay K. Banga (2015), Therapeutic Peptides and Proteins Formulation, Processing, and Delivery Systems, Third Edition
ĐỘ ỔN ĐỊNH THUỐC CÓ NGUỒN GỐC PEPTID
& PROTEIN
Aggregation
▪ Protein molecules can often undergo self-association by physical
or chemical forces to form dimers, trimers, tetramers, or higher
oligomers.

▪ This self-association or aggregation is a common problem during

formulation development and pharmaceutical processing.

▪ Aggregation may occur due to intrinsic factors related to structure

or due to extrinsic factors related to processing stress or
environmental changes, and it may occur at any point throughout
the lifetime of a protein.

12
Ajay K. Banga (2015), Therapeutic Peptides and Proteins Formulation, Processing, and Delivery Systems, Third Edition
KHẢ NĂNG BIẾN TÍNH VÀ KẾT TỤ

▪ Khả năng biến tính là quá trình tháo cuộn xoắn của các

protein, thường là quá trình thuận nghịch hoặc không, và

được gây ra bởi các yếu tố như stress nhiệt, pH quá mức,
hoặc các hóa chất gây biến tính.

13
KHẢ NĂNG BIẾN TÍNH VÀ KẾT TỤ

▪ Các phân tử protein thường xảy ra quá trình tự tập hợp bởi

các yếu tố vật lý hay hóa học để hình thành các dime,
trime, tetrame, hoặc các oligome.

▪ Quá trình tự tập hợp hay kết tụ: thường gặp trong quá trình

phát triển công thức và quy trình bào chế: sự gia nhiệt,
năng lượng tia xạ, siêu âm hoặc các nguồn năng lượng
khác, thay đổi của môi trường pha chế protein như thay đổi
về pH, nồng độ muối, hay thành phần dung môi.

→ làm giảm hoạt tính hay gây ra ADR.

14
KHẢ NĂNG BIẾN TÍNH VÀ KẾT TỤ - GIẢI PHÁP

- Dùng các chất chống biến tính như guanidin hydrochlorid

hoặc ure được thẩm tích để phục hồi trạng thái ban đầu
của các protein bị gấp cuộn.
- Sử dụng các protein có khả năng tháo cuộn xoắn thuận

nghịch: protein nhỏ (<30 kDa), loãng (<1mg/mL) và khả

năng tích điện cao để ức chế quá trình kết tụ.
- Giảm Cprotein: giảm tốc độ, mức độ kết tụ gây ra do nhiệt.

- PEG trợ giúp quá trình cuộn lại của các protein, ngăn cản

kết tụ; giảm hình thành các tinh thể lỏng peptid.
15
ĐỘ ỔN ĐỊNH THUỐC CÓ NGUỒN GỐC PEPTID
& PROTEIN
Adsorption

▪ As discussed in Chapter 2, although the folded protein is

hydrophilic, it does have hydrophobic residues that lie in the

interior of the molecule. At a hydrophobic interface, the
polypeptide chain can unfold to allow the hydrophobic part of the
molecule to interact with the surface, leading to adsorption.

▪ The surface activity of proteins due to their being amphiphilic

polyelectrolytes is largely responsible for adsorption to surfaces.

16
Ajay K. Banga (2015), Therapeutic Peptides and Proteins Formulation, Processing, and Delivery Systems, Third Edition
ĐỘ ỔN ĐỊNH THUỐC CÓ NGUỒN GỐC PEPTID
& PROTEIN

Oxidation

▪ Oxidation is one of the major degradation pathways of

peptides, both in solution and lyophilized formulations.

Amino acids that may undergo oxidation include methionine,
cysteine, histidine, tryptophan, and tyrosine.

▪ Most oxidation reactions commonly encountered in

therapeutic proteins under normal storage conditions involve
methionine and/or cysteine residues.

17
Ajay K. Banga (2015), Therapeutic Peptides and Proteins Formulation, Processing, and Delivery Systems, Third Edition
QUÁ TRÌNH OXY HÓA

▪ Con đường phân hủy chính của các peptid, cả ở dạng dung

dịch lẫn dạng đông khô.

▪ Liên quan đến tỉ lệ methionin và/hoặc cysteine.

▪ Các phản ứng tự oxy hóa thường bị gây ra bởi các lượng

dạng vết của peroxid, các ion kim loại, ánh sáng, môi trường
kiềm, các gốc tự do.

18
QUÁ TRÌNH OXY HÓA – GIẢI PHÁP

- Thiết kế công thức và đóng gói trong điều kiện có khí nitơ.

- Tiến hành đông khô.

- Dùng các chất chống oxy hóa hay các tác nhân khử

hoặc dùng các chất chelat hóa.

- Dùng nhiệt độ thấp trong quá trình bào chế và bảo quản.

- Tránh ánh sáng, điều chỉnh pH.

- Dùng serin để thay thế cystein vì serin là chất có kích

thước và độ phân cực tương tự cystein và vẫn giữ được

đầy đủ đặc tính sinh học.
19
ĐỘ ỔN ĐỊNH THUỐC CÓ NGUỒN GỐC PEPTID
& PROTEIN

Hydrolysis

▪ The peptide bond can undergo hydrolysis, resulting in

peptide degradation in a formulation.

▪ The Asp-Pro peptide bonds are known to be most

susceptible to hydrolytic breakdown. However, the peptide
bond is otherwise fairly unreactive, except at extremes of
pH.

20
Ajay K. Banga (2015), Therapeutic Peptides and Proteins Formulation, Processing, and Delivery Systems, Third Edition
ĐỘ ỔN ĐỊNH THUỐC CÓ NGUỒN GỐC PEPTID
& PROTEIN

Deamidation

▪ Another common hydrolytic reaction responsible for

degradation of peptides and proteins is the nonenzymatic
deamidation of Asn and Gln residues.

▪ The amide groups of asparaginyl or glutaminyl (Asn and

Gln) residues are labile at extremes of pH and may be

hydrolyzed easily to a free carboxylic acid (Asp and Glu,
respectively).

21
Ajay K. Banga (2015), Therapeutic Peptides and Proteins Formulation, Processing, and Delivery Systems, Third Edition
QUÁ TRÌNH DEAMID HÓA

▪ Phản ứng thủy phân thường gặp do các hợp phần Asn và

Gln có trong phân tử IFN-α.

▪ Các amid này không bền ở pH quá mức và dễ dàng bị thủy

phân thành các acid carboxylic tự do là Asp và Glu.

▪ Ảnh hưởng đáng kể đến hoạt tính, thời gian bán hủy, hình

thể, sự kết tụ và/hoặc tính sinh miễn dịch của protein.

▪ Tốc độ quá trình deamid hóa phụ thuộc cấu trúc của

protein, nhiệt độ, pH, loại đệm, cường độ ion và các tương
tác nội phân tử đặc biệt.
22
QUÁ TRÌNH DEAMID HÓA – GIẢI PHÁP

- pH 6 được cho là pH đạt được ổn định cao nhất đối với các

phản ứng deamid hóa.

- Giảm hàm lượng ẩm và/hoặc nhiệt độ bảo quản của công

thức đông khô.

- Sử dụng kỹ thuật di truyền, tái tổ hợp DNA để thay thế hợp

phần Asn như dùng hợp phần Ser.

23
ĐỘ ỔN ĐỊNH THUỐC CÓ NGUỒN GỐC PEPTID
& PROTEIN

β-Elimination and Disulfide Exchange

▪ Under thermal stress, a protein will often undergo a

destruction of the disulfide bonds by β-elimination from

cystine residues, resulting in thiols that may contribute to
other degradation pathways (Manning et al., 1989).

24
Ajay K. Banga (2015), Therapeutic Peptides and Proteins Formulation, Processing, and Delivery Systems, Third Edition
ĐỘ ỔN ĐỊNH THUỐC CÓ NGUỒN GỐC PEPTID
& PROTEIN

Racemization

▪ All amino acids (except glycine) are chiral at the carbon

bearing the side chain and may undergo base-catalyzed

racemization. Racemization will generate d-enantiomers that
may result in loss of bioactivity.

25
Ajay K. Banga (2015), Therapeutic Peptides and Proteins Formulation, Processing, and Delivery Systems, Third Edition
ĐỘ ỔN ĐỊNH THUỐC CÓ NGUỒN GỐC PEPTID
& PROTEIN
Thermal Stability

▪ Storage at normal refrigeration temperatures (5°C) may not be

enough to prevent the pathways of physical and chemical
degradation of peptides and proteins.

▪ For example, storage of bovine insulin at −20°C is necessary to

prevent deamidation and polymerization reactions.

▪ Thermal stress to a protein will often induce denaturation,

aggregation, or deamidation reactions, as already discussed.
Freezing also produces stress to a protein by a different
mechanism.

26
Ajay K. Banga (2015), Therapeutic Peptides and Proteins Formulation, Processing, and Delivery Systems, Third Edition
FORMULATION DEVELOPMENT OF BIOLOGICS

Nicholas W. Warne, Hanns-Christian

Mahler (2018), Challenges in Protein
Product Development, Springer. 27
FORMULATION DEVELOPMENT OF BIOLOGICS

Nicholas W. Warne, Hanns-Christian Mahler (2018), Challenges in Protein Product 28

Development, Springer.
FORMULATION DEVELOPMENT OF BIOLOGICS

29
Nicholas W. Warne, Hanns-Christian Mahler (2018), Challenges in Protein Product Development, Springer.
FORMULATION DEVELOPMENT OF BIOLOGICS

30
FORMULATION DEVELOPMENT OF BIOLOGICS

31
FORMULATION DEVELOPMENT OF BIOLOGICS

32
ẢNH HƯỞNG CỦA TÁ DƯỢC VÀ ĐỘ ẨM TỚI ĐỘ ỔN ĐỊNH
INSULIN
ẢNH HƯỞNG CỦA ĐỘ ẨM TỚI ĐỘ ỔN ĐỊNH
ALPHA-CHYMOTRYPSIN
ẢNH HƯỞNG CỦA LACTOSE VÀ ĐỘ ẨM TỚI ĐỘ ỔN ĐỊNH
ALPHA-CHYMOTRYPSIN
ẢNH HƯỞNG CỦA DC CYCLODEXTRIN TỚI ĐỘ ỔN ĐỊNH ALPHA-
CHYMOTRYPSIN
ẢNH HƯỞNG CỦA DUNG MÔI TỚI ĐỘ ỔN ĐỊNH
INSULIN ĐÔNG KHÔ
ẢNH HƯỞNG CỦA TÁ DƯỢC TRONG THÀNH PHẦN ĐÔNG KHÔ TỚI ĐỘ
ỔN ĐỊNH R-HA (RECOMBINANT HUMAN ALBUMIN)
 BIỆN PHÁP TĂNG ĐỘ ỔN ĐỊNH THUỐC CÓ NGUỒN GỐC
PEPTID & PROTEIN

1. Công thức
• Tá dược (tạo phức, chất diện hoạt, acid min, chất chống
oxy hóa...)
• pH...
2) Kỹ thuật
• Lựa chọn dạng bào chế thích hợp (hỗn dịch, đông khô,
vi cầu, nano, liposome...), bao kháng dịch vị.
• Hạn chế tác động nhiệt, nước trong QT bào chế-sản
xuất
• Bao bì (chống ẩm, ánh sáng, oxy)

3) Bảo quản
• Điều kiện môi trường phù hợp (nhiệt độ, độ ẩm không
khí, ánh sáng)
THUỐC TIÊM CHỨA DƯỢC CHẤT NGUỒN GỐC
PEPTID & PROTEIN
THUỐC TIÊM CHỨA DƯỢC CHẤT NGUỒN GỐC
PEPTID & PROTEIN
THUỐC TIÊM TÁC DỤNG KÉO DÀI HORMON TĂNG
TRƯỞNG NGƯỜI (HUMAN GROWTH HORMON-HGH)
THUỐC TIÊM TDKD TRIPTORELIN-POLYME (HEX-PLA)

47
 THUỐC DÙNG THEO ĐƯỜNG UỐNG
CHỨA DƯỢC CHẤT NGUỒN GỐC PEPTID & PROTEIN

Đặc điểm:
• Dược chất nguồn gốc peptid & protein kém bền vững do bị phân
hủy bởi dịch vị, hệ men.
• Sinh khả dụng thấp.
• Dễ sử dụng, ít tai biến

Biện pháp tăng sinh khả dụng:

• Sử dụng các chất làm tăng tính thấm qua màng sinh học.
• Hạn chế tác động của men phân hủy DC, ví dụ; protease phân
hủy insulin...

48
ANALYTICAL METHODS
Several analytical techniques:
- electrophoresis, spectroscopy, chromatography, thermal
analysis, immunoassays, and bioassays.
A second analytical technique: to confirm the conclusions
made by a first technique:
- the combined use of differential scanning calorimetry (DSC)
and circular dichroism (CD) spectroscopy: about the heat-
induced denaturation of proteins.

49
ANALYTICAL METHODS

50
CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TIÊU CHUẨN CHẤT
LƯỢNG

• Phổ huỳnh quang.

• Quang phổ lưỡng sắc tròn xa và gần vùng tử ngoại khả kiến
(far and near UV circular dichroism spectroscopy).
• Kỹ thuật phân đoạn dòng trường thủy lưu (asymmetrical
field flow fractionation-AF4).
• Sắc ký lỏng cao áp rây phân tử (size-exclusion high-
performance liquid chromatography) với detector huỳnh
quang

51
CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TIÊU CHUẨN CHẤT
LƯỢNG

• Sắc ký rây phân tử kết nối với tán xạ ánh sáng laser nhiều
góc (size exclusion chromatography coupled to multiangle
laser light scattering - SEC-MALLS).
• Điện di trên gel polyacrylamid có SDS (sodium
dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis - SDS-
PAGE) hoặc kết hợp với Western blotting.
• Giải trình tự protein (Peptide mapping) hoặc kết nối với sắc
ký khối phổ (PM/MS).

52
CÁC SẢN PHẨM CHỨA INTERFERON ALPHA
TRÊN THỊ TRƯỜNG
Loại IFN/Hàm
Đường
Biệt dược lượng/Hình Tá dược/Vai trò
dùng
thức
Dung dịch 3-18 MIU IFN-α- Amoni acetat, acid acetic/đệm acetat SC, IM
Roferon-A 2a/Vial 1mL hoặc NaCl/chất đẳng trương hóa, điều chỉnh cường
18 MIU/Vial 3 mL độ ion
3-9 MIU IFN-α- Polysorbat/chất ổn định SC, IM
2a/Syringe 0,5 NaOH/chất điều chỉnh pH 5,0
mL Benzyl alcol/chất sát khuẩn
Nước pha tiêm/dung môi
Bột đông 10-50 MIU IFN-α- 20 mg glycin/tá dược tạo khung IM, SC, IV
khô Intron A 2b/1mL nước cất 2,3 mg Na phosphat dibasic, 0,55 mg Na
pha tiêm phosphat monobasic/đệm phosphat, pH 7,0-8,0
1,0 mg human albumin/tá dược hỗ trợ đông khô,
ổn định
Bột đông Interferon alfa-2b 0,7 ml chứa: SC
khô PEG hóa (74- 1,11 mg Na phosphat dibasic anhydrous, 1,11
PEGIntron 222μg mg Na phosphat monobasic dihydrat/đệm
PEGIntron)/0,7 phosphat pH 7,0-8,0
mL nước cất pha 59.2 mg sucrose/tá dược tạo khung
tiêm 0,074 mg polysorbate 80/chất ổn định
53
CÁC SẢN PHẨM CHỨA INTERFERON ALPHA
TRÊN THỊ TRƯỜNG
Loại IFN/Hàm
Đường
Biệt dược lượng/Hình Tá dược/Vai trò
dùng
thức
Dung dịch 18 MIU IFN-α- 1mL dung môi chứa: IM, SC
Intron A 2b/3,8mL 1,8 mg Na phosphat dibasic, 1,3 mg Na
25 MIU IFN-α- phosphat monobasic/đệm phosphat pH
2b/3,2mL 7,0-8,0
7,5 mg NaCl/ chất đẳng trương hóa, điều
chỉnh cường độ ion
0,1 mg EDTA/chất chelat hóa
0,1 mg polysorbate 80/chất ổn định
1,5 mg m-cresol/chất bảo quản
Dung dịch Interferon alfa- 1,0 mL chứa: SC
PEGASYS 2a PEG hóa 8,0 mg NaCl/chất đẳng trương hóa, điều
(216 μg IFN-α- chỉnh cường độ ion
2a)/Vial 1,2mL 0,05 mg polysorbate 80/chất ổn định
10,0 mg benzyl alcohol/chất bảo quản
2.62 mg Na acetat trihydrat, và 0,05 mg
acid acetic/đệm acetat
54
pH 6.0 ± 0.01
CÂU HỎI
▪ Trình bày các yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định của
thuốc có nguồn gốc peptid và protein. Đề xuất một
số giải pháp về công thức, kỹ thuật và bảo quản
nhằm tăng cường độ ổn định của các chế phẩm này.

55