Bản thảo được chấp nhận

Nhan đề: Một quy trình phân hủy sinh học hoàn toàn chất thải
tôm bằng một phân lập biển mới Paenibacillus sp. AD với việc
sản xuất đồng thời chitinase và chitin oligosacarit

Tác giả: Aditya Kumar, Deepak Kumar, Nancy George,

Hoàng tử Sharma, Naveen Gupta

PII: S0141-8130(17)34341-6
DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2017.12.024
Tham khảo: BIOMAC 8685 ·

Để xuất hiện trong: Tạp chí quốc tế về đại phân tử sinh học

Ngày nhận: 7-11-2017

Ngày sửa đổi: 22-11-2017
Ngày được chấp nhận:4-12-2017

Xin trích dẫn bài viết này như: Aditya Kumar, Deepak Kumar, Nancy George, Prince
Sharma, Naveen Gupta, Một quy trình phân hủy sinh học hoàn toàn chất thải tôm
bằng một phân lập biển mới Paenibacillus sp. AD với việc sản xuất đồng thời
chitinase và chitin oligosacarit, Tạp chí Quốc tế về Đại phân tử Sinh học
https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2017.12.024

Đây là tệp PDF của một bản thảo chưa chỉnh sửa đã được chấp nhận để xuất bản.
Như một dịch vụ cho khách hàng của chúng tôi, chúng tôi đang cung cấp phiên bản
đầu tiên của bản thảo. Bản thảo sẽ trải qua quá trình sao chép, sắp chữ và xem xét
bằng chứng kết quả trước khi nó được xuất bản ở dạng cuối cùng. Xin lưu ý rằng
trong quá trình sản xuất, các lỗi có thể được phát hiện có thể ảnh hưởng đến nội dung
và tất cả các tuyên bố từ chối trách nhiệm pháp lý áp dụng cho tạp chí đều liên quan.
Một quá trình phân hủy sinh học hoàn toàn chất thải tôm bằng một phân lập biển mới

Paenibacillus sp. AD với việc sản xuất đồng thời chitinase và chitin oligosacarit

Aditya Kumar, Deepak Kumar, Nancy George, Hoàng tử Sharma, Naveen Gupta

ACCEPTED
* Khoa Vi sinh, Đại học Panjab Chandigarh 160014

MANUSCRIPT

Thư từ nên được gửi đến ai, Tiến sĩ Naveen Gupta

Khoa Vi sinh, BMS Block, South Campus Đại học Panjab,

Chandigarh, Ấn Độ

Thư điện tử: ng.puchd@gmail.com

Đám đông: + 91-9872692680, 9041062680

Số fax.: +91- 172-2541770

Trừu tượng

Xử lý chất thải chitinaceous là một vấn đề lớn của ngành thủy sản. Hầu hết các sinh vật
chitinolytic được biết đến đã được nghiên cứu liên quan đến chitin tinh khiết làm chất nền. Việc
sử dụng các sinh vật này để phân hủy chất thải hải sản chưa được khám phá nhiều. Trong
nghiên cứu hiện tại, một loại vi khuẩn biển có khả năng phân hủy thành thạo chất thải tôm bằng

ACCEPTED
cách đồng sản xuất các sản phẩm giá trị gia tăng như chitinase và chitin oligosacarit đã được
phân lập từ các bãi chứa chất thải hải sản. Trên 16s rRNA và vi khuẩn phân tích sinh hóa đã
được tìm thấy là một loài mới thuộc chi Paenibacillus.Trong điều kiện tối ưu, sự phân hủy chất

MANUSCRIPT
thải tôm hoàn toàn (99%) đã đạt được cùng với năng suất chitinase là 20,01IUml-1. SEM và
FTIR cho thấy những thay đổi cấu trúc và phá vỡ các liên kết điển hình cho chitin, điều này chỉ
ra rằng quá trình này cũng có thể được sử dụng để phân hủy các vật liệu chitinaceous khác. Sắc
ký lớp mỏng cho thấy sự hiện diện của chitin oligosacarit ở mức độ trùng hợp khác nhau trong
thủy phân. Phân hủy hoàn toàn chất thải tôm bởi Paenibacillus sp. AD làm cho nó trở thành một
ứng cử viên tiềm năng cho việc xử lý sinh học chất thải hải sản ở quy mô lớn. Sản xuất đồng thời
chitinase và chitin oligosacarit tiếp tục làm cho quá trình này trở nên kinh tế và khả thi về mặt
thương mại.

Từ khóa: Paenibacillus sp. AD, Chitinase, Suy thoái chất thải tôm, Tối ưu hóa, Chitin

oligosacarit, Sắc ký lớp mỏng.

1. Giới thiệu

Ngành thủy sản thế giới đóng một vai trò quan trọng trong việc nuôi sống một bộ phận đáng kể

dân số thế giới. Ước tính tổng nhu cầu hải sản sẽ là 183 triệu tấn vào năm 2030 [1]. Với nhu cầu

ACCEPTED
ngày càng tăng đối với các sản phẩm thủy sản Ấn Độ trên toàn thế giới, việc kinh doanh thủy

sản ở Ấn Độ đang tăng lên nhanh chóng.

Các hoạt động chế biến thủy sản tạo ra một lượng lớn chất thải tiềm tàng như vỏ tôm, vỏ cua,

MANUSCRIPT
chất thải tôm và vảy cá từ các bộ phận cá không ăn được và các bộ phận vỏ nội xương từ quá

trình lột vỏ giáp xác. Nói chung, 50 đến 70 phần trăm nguyên liệu thủy sản đi như chất thải.

Quản lý chất thải khổng lồ này là một vấn đề cho sự bền vững của ngành chế biến thủy sản [2].

Phần chính của chất thải được tạo ra bởi ngành công nghiệp thực phẩm biển là chất thải

chitinaceous [3]. Người ta đã phát hiện ra rằng chất thải phát sinh trong quá trình chế biến tôm

và cua chứa tới 50% chitin theo trọng lượng khô [4, 5]. Chitin, một polyme sinh học không hòa

tan cao, là một trong những hợp chất hữu cơ phong phú nhất trong tự nhiên (sau cellulose).

Chitin bao gồm các chuỗi tuyến tính của dư lượng ß-1, 4 liên kết N-acetyl D-glucosamine được

liên kết chéo cao bởi các liên kết hydro.

Phương pháp thông thường để xử lý chất thải hải sản bao gồm đổ thải đại dương, đốt rác và lấp

đất dẫn đến ô nhiễm môi trường và ô nhiễm sinh học. Tính không hòa tan của chitin và tính trơ

của nó đối với hầu hết các tác nhân hóa học đã làm tăng việc tìm kiếm các phương pháp xử lý

thay thế như xử lý sinh học. Hơn nữa, sau khi xử lý sinh học chất thải thực phẩm biển, các sản

phẩm phụ của nó có thể được sử dụng cho các mục đích khác nhau, ví dụ như điều chế chitin

oligosacarit quan trọng về mặt dược phẩm, N-Acetyl –D –glucosamine [6], sản xuất protein tế

bào đơn [7] ethanol [8], v.v. Ngoài ra, chitinase được sản xuất trong quá trình chế biến này có

thể được sử dụng cho các ứng dụng công nghệ sinh học khác nhau, ví dụ như để kiểm soát nấm

gây bệnh, phân lập protoplast từ nấm, nấm men và tổng hợp các hợp chất dược phẩm quan

trọng, v.v. [9]. Do đó, xử lý sinh học chất thải thủy sản không chỉ là một bước tiến tới
Bảo vệ môi trường nhưng cũng có tiềm năng kiếm tiền khổng lồ thông qua việc sử dụng sản

phẩm phụ / s của nó.

Một số vi sinh vật bao gồm vi khuẩn [10, 11, 12] cũng như nấm [7, 13, 14] đã được báo cáo là

ACCEPTED
sản xuất chitinase nhưng các ứng dụng thương mại của chúng bị hạn chế do năng suất enzyme

thấp, chi phí sản xuất cao và kém ổn định của enzyme. Hơn nữa, hầu hết các sinh vật này đã

được báo cáo sử dụng chitin tinh khiết làm nguồn carbon [15, 16]. Một số sinh vật đã được báo

MANUSCRIPT
cáo sản xuất chitinase [17, 18] và chitin oligosacarit [19, 20, 10] bằng cách sử dụng chất thải hải

sản. Nhưng không có nghiên cứu có hệ thống nào được thực hiện để tối ưu hóa các điều kiện

cho sự phân hủy hiệu quả chất thải thực phẩm biển và phát triển một chiến lược xử lý sinh học

bằng cách sử dụng các sinh vật phân giải chitinolytic.

Theo quan điểm này, nghiên cứu hiện tại đã được thực hiện để phân lập một loại vi khuẩn

chitinolytic mạnh có thể làm suy giảm chất thải hải sản một cách hiệu quả. Các biến số quan

trọng ảnh hưởng đến suy thoái chất thải tôm và sản xuất chitinase đã được xác định bằng cách

sử dụng thiết kế Plackett-Burman (PB). Mức độ của các biến số quan trọng đã được tối ưu hóa

hơn nữa bằng cách sử dụng Thiết kế tổng hợp trung tâm (CCD) để phát triển một quy trình phân

hủy tối ưu chất thải tôm và sản xuất đồng thời chitinase ngoại bào và chitin oligosacarit hoạt

tính sinh học quan trọng trong công nghiệp. Hơn nữa, hiệu quả thủy phân của chitinase được

đánh giá bằng cách phân tích chất thải tôm bị thoái hóa và thủy phân bởi SEM, FTIR và TLC.

2 Vật liệu và phương pháp

2.1 Chất nền và hóa chất

Mảnh tôm, nước dùng dinh dưỡng, chiết xuất men, chiết xuất thịt bò, agar agar NH4NO3,

gelatin, urê, tinh bột, D-glucose, fructose, galactose, sucrose, Thuốc thử Ehrlich A.R. (p-Di-

methyl aminobenzaldehyde, A.R.), được mua từ HIMEDIA (Ấn Độ), Kali tetraborate được mua

từ Sigma và các thuốc thử khác cần thiết cho xét nghiệm enzyme tức là NaH2PO4,
 Na2HPO4, K2HPO4, KH2PO4, MgSO4 FeSo4.7H2O, MnCl2, ZnSO4, HCl và axit axetic băng

được mua từ Fisher Scientific UK. Tiêu chuẩn Chitin oligosacarit được mua từ Qingdao BZ

Oligo Biotech Co., Ltd. Trung Quốc

ACCEPTED
2.2 Chuẩn bị chitin keo

Chitin keo được điều chế theo phương pháp sửa đổi như được mô tả bởi [21]. Mảnh chitin được

nghiền nát và 5g bột chitin được thêm vào 60 ml HCl đậm đặc và ủ trong 2 đến 3 giờ ở 28- 30 °

MANUSCRIPT
C với khuấy liên tục. Sau đó, 200ml nước cất đá lạnh được thêm vào và giữ để ủ qua đêm ở

4°C. Kết tủa thu được được rửa nhiều lần bằng nước cất cho đến khi độ pH của nó trở thành 7.

2.3 Phân lập và sàng lọc vi khuẩn sản xuất chitinase

Vi khuẩn sản xuất chitinase được phân lập trên môi trường tối thiểu được báo cáo bởi HSU và

Lockwood, 1975 [22]. Các mẫu đất từ các khu vực ven biển của Chennai, Ấn Độ và các bãi rác

thải thực phẩm biển của Kerala, Ấn Độ đã được thêm vào môi trường tối thiểu có chứa chất thải

tôm (1%) để làm giàu, sau 5 ngày pha loãng thích hợp được mạ trên các tấm trung bình tối thiểu

có chứa chitin keo (0,5%). Các tấm được ủ ở 37 độ C trong 72 giờ. Các vi khuẩn cho thấy hình

thái khuẩn lạc khác nhau và vùng thủy phân đã được đưa vào danh sách rút gọn.

2.4 Lựa chọn phân lập trên cơ sở năng suất chitinase và sự phân hủy chất thải của tôm Các

phân lập vi khuẩn trong danh sách rút gọn đã được sàng lọc sự thoái hóa chất thải tôm và sự

hiện diện của chitinase ngoại bào. 20 ml nước dùng môi trường tối thiểu chứa 1% chất thải tôm

được cấy 1% tế bào nuôi qua đêm và ủ ở 37°C trong 96 giờ. Sau đó, nuôi cấy được ly tâm ở

10000 vòng / phút trong 15 phút ở 4 ° C và supernatant được sử dụng như một enzyme ngoại bào. Viên nén được rửa kỹ và sấy khô ở 80°C
để xác định
trọng lượng chất thải tôm còn sót lại. Chủng thể hiện sự thoái hóa chất thải tôm tối đa và

hoạt tính chitinase ngoại bào cao đã được chọn để nghiên cứu thêm.
2.5 Quy trình xét nghiệm Chitinase

Hoạt tính của chitinase được xác định bằng cách sử dụng chitin keo (1%) làm chất nền ở 45 ° C

trong 5 phút trong dung dịch đệm phốt phát 0,1 M (pH 7) và sau đó ly tâm ở 5.000 vòng / phút

trong 10 phút. Chất siêu nhiên được sử dụng thêm để phân tích khử đường amin bằng phương

ACCEPTED
pháp Reesieg [23]. Một đơn vị (IU) hoạt động chitinase được định nghĩa là lượng enzyme cần

thiết để giải phóng một micromole N-acetyl D-glucosamine (GlcNAc) mỗi phút bởi một ml

MANUSCRIPT
enzyme trong điều kiện xét nghiệm tiêu chuẩn.

2.6 Xác định chủng đã chọn

Hình thái tế bào của phân lập vi khuẩn đã được kiểm tra bằng cách nhuộm Gram. Đặc tính sinh

lý và sinh hóa được thực hiện theo Cẩm nang vi khuẩn xác định của Bergey [24]. Việc xác định

thêm vi khuẩn được thực hiện bằng trình tự 16S rRNA trong đó DNA bộ gen được phân lập và

đoạn rRNA 16S được khuếch đại. Sản phẩm được giải trình tự bằng cách sử dụng mồi phổ quát

và phân tích trình tự đã được thực hiện. Cây phát sinh chủng loài được xây dựng với 1000 bản

sao bootstrap sử dụng phần mềm MEGA 7 [25].

2.7 Tối ưu hóa sản xuất chitinase và phân hủy chất thải tôm trong quá trình lên men chìm

(SmF)

2.7.1 Tối ưu hóa bằng một biến tại một phương pháp thời gian (OVAT)

Ảnh hưởng của các yếu tố hóa lý khác nhau đối với suy thoái chất thải tôm và sản xuất chitinase

được phân tích bằng cách thay đổi một yếu tố tại một thời điểm, giữ cho các yếu tố khác không

đổi. Các thông số khác nhau đã được tối ưu hóa bao gồm thời gian ủ, môi trường khác nhau,

pH, nhiệt độ, nguồn carbon, nguồn nitơ và ion kim loại. Tất cả các thí nghiệm được thực hiện

trong triplicates.
2.7.2 Lựa chọn các yếu tố quan trọng của Plackett-burman (PB)

Trên cơ sở kết quả của một biến tại một thời điểm nghiên cứu và dữ liệu có sẵn trong tài liệu, 11

thông số khác nhau viz.: A: NaCl, B: Casein, C: Chiết xuất nấm men, D: Kích thước tiêm

chủng, E: Glucose, F: KCl, G: MgSO4, H: MgCl2, J: Ammonium Sulfate, K: Fructose, L: Di-

ACCEPTED
Sodium hydrogen phosphate đã được chọn và thiết kế được sử dụng để chọn các thông số quan

trọng trong số đó.

MANUSCRIPT
Mỗi yếu tố được nghiên cứu ở hai cấp độ cao (+) và thấp (-). Một thiết kế của tổng số 12 thí

nghiệm đã được tạo ra bằng cách sử dụng phần mềm Design Expert 8.0.7.1 (Bảng 2). Ảnh

hưởng của các yếu tố riêng lẻ đến hoạt động của enzyme được tính theo phương trình sau:

∑ Pi+ – ∑ Pi— .............. Câu 1

E =i N

Trong đó Ei là ảnh hưởng của tham số i đang nghiên cứu, Pi + và Pi- là phản ứng của các thử

nghiệm mà tại đó tham số ở mức cao và thấp tương ứng, và N là tổng số phép thử. Từ biểu đồ

Pareto, các yếu tố cho thấy hiệu ứng tích cực tối đa đã được chọn.

2.7.3 Thiết kế composite trung tâm (CCD)

Các biến số cho thấy tác động tích cực (amoni sunfat, natri clorua, magiê sunfat và kali clorua)

đối với sự thoái hóa chất thải tôm cũng như sản xuất chitinase đã được tối ưu hóa bằng CCD.

Phạm vi tối thiểu và tối đa của các biến được chọn, tức là amoni sunfat (0,2-0,5g), natri clorua

(0,2-0,5g), magiê sunfat (0,05-0,1g) và kali clorua (0,0002-0,0005g) đã được sử dụng trong 30

kết hợp (Bảng S1). Mô hình RSM đã được xác nhận thêm cho các phản ứng dự đoán so với

thực tế.

BẢNG S1
2.8 Phân tích cấu trúc chất thải tôm và thủy phân sau khi xử lý bằng

Paenibacillus sp. QUẢNG CÁO

2.8.1 Skönnun rafeindasmásjá (SEM)

SEM được sử dụng để xác định tác dụng của Paenibacillus sp. AD trên vảy tôm suy thoái. Các

ACCEPTED
mẫu vảy tôm chưa được xử lý và xử lý bằng Paenibacillus sp. AD được cố định bằng 10%

glutaraldehyd và khử nước bằng gradient ethanol và hexamethyl disilazane (HMDS). Các mẫu

MANUSCRIPT
sau đó được phủ vàng và quan sát theo SEM.

2.8.2 Phân tích phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR)

Paenibacillus sp. Các mẫu mảnh tôm đã qua xử lý và chưa qua xử lý AD được nhúng vào đĩa

KBr bằng máy ép thủy lực Perkin Elmer và được FTIR sử dụng máy quang phổ Perkin Elmer-

400 FT-IR / FT-FIR ở nhiệt độ phòng.

2.8.3 Phân tích các sản phẩm thủy phân bằng sắc ký lớp mỏng (TLC)

Các sản phẩm thủy phân được TLC phát hiện bằng cách sử dụng các tấm silica gel 60 F 254.

Tất cả các mẫu được áp dụng với số lượng bằng nhau (2 μl) và được phân giải bằng cách sử

dụng N- Butanol: Ethanol: nước (2: 1: 1) vì pha di động và các đốm được phát hiện bằng cách

phun thuốc thử axit photphoric diphenylamine anilin trộn trong ethanol sau đó đun nóng ở 100 °

C trong 5 phút [26]. Một hỗn hợp bao gồm monome, dimer, trimer và tetramer của N-acetyl D-

glucosamine đã được sử dụng làm tiêu chuẩn.

3. Kết quả và thảo luận

3.1 Phân lập, sàng lọc và lựa chọn vi khuẩn sản xuất chitinase

Các mẫu đất được thu thập từ các khu vực ven biển của Chennai và các khu vực đổ chất thải

thực phẩm biển của Kerala, Ấn Độ. Các mẫu được làm giàu với chất thải tôm (1%) và vi khuẩn

chitinolytic được phân lập trên cơ sở vùng giải phóng mặt bằng trên các đĩa thạch chitin keo.

Trong số này
Các chủng Isolate AD đã được chọn để nghiên cứu sâu hơn do khả năng phân hủy hiệu quả chất

thải của tôm và tạo ra năng suất cao của chitinase ngoại bào.

3.2 Xác định AD cô lập

ACCEPTED
Sinh vật được xác định trên cơ sở hình thái, hóa sinh và phân tích 16S rRNA (Số gia nhập.

MG183682). Phân tích đã chứng minh rằng Isolate AD là tiểu thuyết, chỉ cho thấy sự tương

MANUSCRIPT
đồng trình tự 95,79% với chủng loại Paenibacillus chitinolyticus NBRC 15660 (Hình 1). Phân

lập mới này cũng có thể được phân biệt trên cơ sở phân tích sinh hóa; vì nó khác với

Paenibacillus chitinolyticus NBRC 15660 liên quan đến catalase, giảm lactose và thủy phân

casein [27] (Bảng 1). Rõ ràng từ phân tích rằng Isolate AD có thể được phân loại là đại diện của

một loài mới thuộc chi Paenibacillus mà tên Paenibacillus sp. AD đã được chỉ định. Chủng

này đã được gửi trong Bộ sưu tập nuôi cấy vi sinh vật (MTCC), Chandigarh Ấn Độ (MTCC số

12619).

HÌNH 1

BẢNG 1

3.3 Tối ưu hóa phân hủy sinh học chất thải tôm và sản xuất chitinase

3.3.1. Tối ưu hóa các yếu tố hóa lý bằng phương pháp một biến tại một thời điểm

(OVAT)

Phương pháp OVAT cổ điển được sử dụng để tối ưu hóa quá trình phân hủy chất thải tôm và

sản xuất enzyme. Tăng lần lượt 3 lần và 4 lần phân hủy chất thải tôm và năng suất chitinase, đạt

được trong các điều kiện tối ưu sau, thời gian ủ 96h, môi trường tối thiểu [22] bổ sung 1% chất

thải tôm, pH 7, nhiệt độ 37°C và 0,5% amoni sunfat (Bảng S2). Sự gia tăng tối đa về sự thoái

hóa và năng suất enzyme

đã đạt được trong môi trường tối thiểu với việc bổ sung amoni sunfat. Ammonium sulfate đã

được báo cáo là làm tăng năng suất chitinase trong trường hợp Serratia marcescens và

Aspergillus sp. SL-13 cũng [28, 29].

BẢNG S2

ACCEPTED
3.3.2. Tối ưu hóa bằng phương pháp thống kê

3.3.2.1 Sàng lọc các thành phần quan trọng bằng cách sử dụng thiết kế Plackett-Burman (PB)

MANUSCRIPT
Hiệu quả của 11 thông số khác nhau được ước tính đối với sự suy thoái chất thải tôm và sản

xuất chitinase. Sự thoái hóa chất thải tôm dao động từ 10% đến 69% và năng suất enzyme dao

động từ 3,84 IUml-1 đến 5,28 IUml-1 đã được quan sát thấy (Bảng 2). Ảnh hưởng của các thông

số khác nhau đến suy thoái chất thải tôm và sản xuất chitinase đã được thể hiện trong biểu đồ

pareto (Hình 2). Trong số 12 yếu tố, amoni sunfat, natri clorua, magiê sunfat, disodium

hydrogen orthophosphate, kali clorua và kích thước cấy cho thấy tác dụng tích cực trong trường

hợp phân hủy chất thải tôm (Hình 2A) trong khi trong trường hợp chitinase mang lại amoni

sunfat, natri clorua, kali clorua, magiê sunfat và disodium hydro orthophosphate cho thấy tác

dụng tích cực (Hình 2B). Trong số tất cả các yếu tố tích cực này, amoni sunfat, natri clorua,

magiê sunfat và kali clorua là những yếu tố phổ biến có ảnh hưởng tích cực cao đến suy thoái

chất thải tôm cũng như sản xuất chitinase.

Ammonium sulfate đã được báo cáo để tăng cường sản xuất chitinase trong trường hợp

Serratia marcescens XJ-01 và Serratia marcescens JPP [30, 28].

Tuy nhiên, Jholopara et al, 2013 đã báo cáo rằng các nguồn nitơ hữu cơ như peptone đóng vai

trò là nguồn nitơ tốt hơn để sản xuất chitinase so với amoni sunfat trong trường hợp Bacillus

spp.[31]. Tương tự, NaCl đã được báo cáo là có tác động tích cực đến việc sản xuất chitinase từ

Aeromonas hydrophila SBK1 và Lysinibacillus fusiformis B-CM18 [19, 32]. Này

có thể là do yêu cầu của các ion Na + để vận chuyển axit amin và cũng để duy trì nồng độ chất

tan nội bào trong vi khuẩn biển [33].

Sản xuất chitinase bị ảnh hưởng bởi sự hiện diện của các nguyên tố vi lượng như khoáng chất

trong môi trường sản xuất. Các ion Mg 2+ được biết là đóng một vai trò quan trọng trong sự tăng

ACCEPTED
trưởng tế bào, sản xuất và ổn định enzyme. Tăng cường năng suất chitinase của Paenibacillus

sp. AD đồng ý với Jholapara et al. 2013 và Kumar et al. 2017 [31, 34] đã báo cáo ảnh hưởng

MANUSCRIPT
tích cực của MgSO4 và KCl đối với sản xuất chitinase của Bacillus spp. và Humicola grisea

tương ứng. Một báo cáo khác nói rằng nồng độ MgSO4 có thể làm tăng sản xuất chitinase là

trong trường hợp Bacillus pumilus [35]. Không có báo cáo nào cho thấy các thông số khác nhau

đã được phân tích và tối ưu hóa cho sự suy thoái chất thải tôm. Do đó, để đạt được sự phân hủy

chất thải tôm tối đa và sản xuất enzyme, nồng độ tối ưu của các thông số này đã được nghiên

cứu bằng Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM).

BẢNG 2

HÌNH 2

3.3.2.2 Thiết kế composite trung tâm (CCD) trong phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM)

Một CCD đã được xây dựng và phân hủy chất thải tôm tối đa (99%) và năng suất chitinase

(20,01IUml-1) thu được khi 0,35% amoni sunfat, 0,35% natri clorua, 0,075% magiê sunfat và

0,00035% kali clorua được thêm vào môi trường. Phản ứng đối với sự thoái hóa chất thải tôm

và năng suất enzyme được thể hiện trong (Bảng 3). Bằng cách áp dụng nhiều phân tích hồi quy

trên dữ liệu thực nghiệm, các phương trình đa thức bậc hai dự đoán (Eq.2, Eq.3) đã được xây

dựng để mô tả mối tương quan giữa các đáp ứng và các tham số.

BẢNG 3
Phương trình mô hình

R1= +98,50 +4,87* A +6,12* B +0,29* C -0,71* D +1,69*A*B +0,56*A*C

+2,94* A* D -0,69* B* C -1,81*B*D +2,06 *C* D -3,80 * A2 -2,68* B2 -1,80* C2 -6,68* D2 Eq. 2

R2 = +19,43 +0,77*A +0,80* B -0,065* C -0,13* D +0,38 * A * B -0,031 * A * C -0,048 * A * D

ACCEPTED
+5.625E-003 * B * C -0,44 * B * D +0,026 * C * D -2,26 * A2 -1,49 * B2 -1,95 * C2 -2,44 * D2 .......... Eq. 3

Trong đó, R1 là phản ứng 1 (Suy thoái chất thải tôm, % tuổi) và R2 là phản ứng 2 (năng suất

MANUSCRIPT
Chitinase, IUml-1). A, B, C và D là các giá trị được mã hóa của amoni sunfat, natri clorua,

magiê sunfat và kali clorua tương ứng.

Phân tích phương sai cho mô hình bậc hai bề mặt đáp ứng đã được tóm tắt trong (Bảng 4, 5).

Các giá trị p < 0,0001 chỉ ra rằng các thuật ngữ tuyến tính, tương tác và bình phương đều có ảnh

hưởng khá đáng kể đến cả hai câu trả lời. Các giá trị p cho sự thiếu phù hợp lần lượt là 0,0725

và 0,0731 đối với suy thoái chất thải tôm và năng suất chitinase, cho thấy mô hình bậc hai này

phù hợp với dữ liệu. Các hệ số xác định R1, 2, 0, 9960 và R22, 0, 9774 chỉ ra rằng các giá trị dự

đoán và thực nghiệm có sự gắn kết hoàn hảo với nhau.

Các giá trị của R12 và R22 được điều chỉnh (Bảng 4, 5) cho thấy sự thay đổi trong các phản hồi

được quy cho các biến độc lập và chỉ có 3,92% và 3,9% tổng số biến thể không thể được giải

thích bởi các mô hình. Do đó, mô hình này có thể được sử dụng để dự đoán sự phân hủy chất

thải tôm và năng suất chitinase từ Paenibacillus sp. QUẢNG CÁO.

Các đường cong hình cầu trong hình 3 và hình 4 chỉ ra rằng sự tương tác giữa amoni sunfat,

natri clorua, magiê sunfat và kali clorua là đáng kể và các phản ứng tối đa được đặt bên trong

ranh giới thiết kế, xác nhận phạm vi tham số được thử nghiệm. Theo hình 4 và hình 5, ý nghĩa

tương đối của tác động của các thông số đối với suy thoái chất thải tôm cũng như năng suất

enzyme theo thứ tự sau:

amoni sunfat> natri clorua> magiê sunfat> kali clorua phù hợp với kết quả.

3.3.2.3 Xác nhận mô hình thử nghiệm

Việc xác nhận mô hình thống kê và phương trình hồi quy được thực hiện bằng cách nuôi cấy

ACCEPTED
Paenibacillus sp. AD trong điều kiện tối ưu dự đoán trong triplicate. Các giá trị thí nghiệm quan

sát được lần lượt là 99% và 20,56 IUml-1 đối với phân hủy chất thải tôm và sản xuất chitinase.

Mối quan hệ chặt chẽ giữa các giá trị dự đoán (98,5% và

MANUSCRIPT
19,43 IUml-1) và các giá trị phản hồi thực nghiệm từ thí nghiệm xác nhận cho thấy tính hợp lệ

và khả năng chấp nhận của mô hình thống kê để tối ưu hóa. Sau khi tối ưu hóa, sự phân hủy

chất thải tôm và năng suất chitinase được tăng lần lượt 8,25 và 45,6 lần so với các điều kiện

không được tối ưu hóa.

Không có nghiên cứu tối ưu hóa chi tiết nào được báo cáo về suy thoái chất thải tôm. Trong một

số báo cáo sơ bộ, chỉ có sự xuống cấp 20 - 25% đã được báo cáo trong 5 ngày với Bionectria

CBNR BKRR spp. [5] và Fusarium solani sps. [17]. Sự phân hủy hiệu quả của chất thải tôm đã

được báo cáo với Bacillus licheniformis SSCL10 và Bacillus subtilis SSCL 14, tuy nhiên thời

gian để đạt được sự phân hủy này là rất dài 12- 15 ngày [18] trong khi trong nghiên cứu hiện tại

sự phân hủy hoàn toàn chất thải đã đạt được chỉ trong 4 ngày.

Trong khi trong hầu hết các báo cáo có sẵn về sản xuất chitinase của vi khuẩn, năng suất

enzyme rất thấp đã đạt được ngay cả sau khi tối ưu hóa. Trong trường hợp Bacillus pumilus

[35] Chitiolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1 [36] và Humicola grisea [34] chỉ có 0,9IU,

5,17IU và 0,172IU năng suất chitinase tương ứng đã được báo cáo sau khi tối ưu hóa thống kê

bởi RSM. Tương tự, tối ưu hóa sản xuất chitinase trong trường hợp Humicola grisea chỉ dẫn

đến

Tăng cường gấp 1,43 lần [34] Năng suất chitinase tương đương với nghiên cứu hiện tại đã được

báo cáo từ Aeromonas hydrophila SBK1 [19].

BẢNG 4

BẢNG 5

HÌNH 3

HÌNH 4
ACCEPTED
3.4 Phân tích cấu trúc chất thải tôm và thủy phân sau khi xử lý bằng

MANUSCRIPT
Paenibacillus sp. QUẢNG CÁO

Những thay đổi hình thái có thể nhìn thấy đã được quan sát thấy ở mảnh tôm khi điều trị bằng

Paenibacillus sp. AD. Để phân tích sâu hơn về những thay đổi cấu trúc, kính hiển vi điện tử

quét (SEM) và phân tích quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR) đã được thực hiện.

Thủy phân thu được sau khi phân hủy chất thải tôm cũng được phân tích để tìm sản phẩm

phụ.

3.4.1 Skönnun rafeindasmásjá (SEM)

Mảnh tôm trước khi xử lý cho thấy bề mặt gần như nhẵn (Hình 5A). Tuy nhiên, sau khi lên

men, mảnh tôm bị nứt và một số lỗ chân lông được hình thành, điều này cho thấy rõ sự thoái

hóa chitin của enzyme trong quá trình xử lý (Hình 5B). Những thay đổi tương tự đã được

chứng minh về việc xử lý chất thải tôm bằng chitinase từ Aeromonas hydrolytica SBK1 [19] và

Paenicillium sp. LYG0704 [37]. Kết quả chỉ ra rằng chitinase từ Paenibacillus sp. AD rất hiệu

quả trong thủy phân chitin và cũng có thể được sử dụng để phân hủy các vật liệu chitinaceous

khác, vì chủ yếu trong tất cả các nguồn, cùng một cấu trúc của chitin.

HÌNH 5
3.4.2 FTIR bôi trơn

Các liên kết khác nhau có trong chitin và các dải phổ tương ứng của chúng đã được tóm tắt

trong bảng S3. Phổ FTIR của mảnh tôm chưa được xử lý, mảnh tôm được xử lý bằng

ACCEPTED
Paenibacillus sp. AD và thủy phân của nó thu được sau khi thoái hóa được thể hiện trong hình

6.

Chất thải tôm chưa được xử lý (Hình 6A) cho thấy các đỉnh ở mức 1552 cm-1, 1621 cm-1, 3257 cm-1 và 1375

cm-1

MANUSCRIPT
điển hình cho chitin [38, 39].

Trong khi ở các mảnh tôm được xử lý (Hình 6B) đạt đỉnh ở mức 1259,96 cm-1 và 1203,97 cm-1,

tương ứng với các nhóm acetyl và amide đã biến mất do phá vỡ các liên kết này. Kích thước

cực đại ở 1417 cm-1 tương ứng với nhóm –OCH3 trong trường hợp mẫu không được xử lý đã

tăng lên cùng với sự dịch chuyển dải lên 1432cm-1 do rung động xương thơm trong biến dạng

mặt phẳng. Cũng có sự thay đổi về cường độ của các đỉnh núi khác. Tất cả những thay đổi này

cho thấy sự xuống cấp của vật liệu chitinaceous.

Trong khi trong trường hợp phổ FTIR của thủy phân (Hình 6C), có sự gia tăng đáng kể kích

thước đỉnh khoảng 3257-3363 cm-1 sau khi xử lý enzyme. Nó được cho là do phá vỡ các liên kết

trong chuỗi chitin và hình thành các nhóm –OH. Tất cả những thay đổi này cho thấy sự hình

thành các sản phẩm thủy phân chitin như chitin oligosacarit.

BẢNG S3 HÌNH 6

3.4.3 Phân tích các sản phẩm thủy phân bằng TLC

Chất thủy phân thu được sau khi phân hủy chất thải tôm sau đó đã được TLC phân tích bằng

cách sử dụng oligome chitin tiêu chuẩn làm tài liệu tham khảo viz. GlcNAc, (GlcNAc) 2,

(GlcNAc)3, (GlcNAc)4 (Sigma-Aldrich, Hoa Kỳ). Phân tích TLC cho thấy hỗn hợp chitin oligosacarit

viz. N-acetyl glucosamine (GlcNAc); chitobiose, (GlcNAc)2; chitotriose,

(GlcNAc)3, chitotetroses (GlcNAc)4 và oligosacarit có mức độ trùng hợp cao hơn đã được sản

xuất (Hình 7). Kết quả phù hợp với phân tích FTIR. Vì oligosacarit ở mức độ trùng hợp khác

nhau được sản xuất trong quá trình thủy phân, chúng có thể được sử dụng làm tác nhân

prebiotic tiềm năng và cho các mục đích điều trị khác. [19] đã cho thấy sự hình thành chỉ N-

ACCEPTED
acetyl glucosamine (GlcNAc) và chitobiose (GlcNAc) 2 sau khi phân hủy chất thải tôm bởi

Aeromonas hydrophila SBK11.

MANUSCRIPT
HÌNH 7

4. Kết thúc

Nghiên cứu hiện tại báo cáo sự phân lập của một loài mới thuộc chi Paenibacillus và ứng

dụng của nó để xử lý sinh học chất thải thực phẩm biển cùng với việc sản xuất chitinase và

chitin oligosacarit. Tối ưu hóa dẫn đến sự gia tăng đáng kể sự xuống cấp (8,25 lần) và sản

xuất chitinase (45,6 lần). Trong điều kiện tối ưu, sự phân hủy 99% chất thải của tôm và mức

độ đáng chú ý của chitinase ngoại bào và chitin oligosacarit ở các mức độ trùng hợp khác

nhau đã được sản xuất bởi Paenibacillus sp. QUẢNG CÁO. Theo hiểu biết của chúng tôi,

đây là báo cáo thứ 1 về sự phân hủy sinh học hoàn toàn chất thải tôm bởi một loại vi khuẩn. Quá

trình này có thể được sử dụng trong việc quản lý hiệu quả chất thải thực phẩm biển chitinous.

Hơn nữa, nó cũng hữu ích cho việc sản xuất chitinase, có các ứng dụng công nghệ sinh học

khác nhau và chitin oligosacarit hoạt tính sinh học, có thể được sử dụng làm tác nhân tiền

sinh học và trị liệu.

Tài liệu bổ sung

Dữ liệu bổ sung liên quan đến bài viết này có thể được tìm thấy trong tệp tài nguyên trực tuyến.
Xung đột lợi ích

Các tác giả tuyên bố rằng họ không có xung đột lợi ích.

Lời cảm ơn

ACCEPTED
Hỗ trợ tài chính từ UGC -SAP New Delhi và học bổng UGC JRF cho ông Aditya Kumar

được đánh giá cao.

Tham khảo MANUSCRIPT

1. K. Jayathilakan, K. Sultana, K. Radhakrishna, A.S. Bawa, Sử dụng các sản phẩm phụ và

chất thải từ các ngành công nghiệp chế biến thịt, gia cầm và cá: đánh giá. J. Khoa học

thực phẩm Technol. 49(2012) 278–293.

2. W. Russ, R.M. Pittroff, Sử dụng chất thải từ các ngành công nghiệp sản xuất và chế

biến thực phẩm. Crit. Rev. Khoa học thực phẩm. Nutr. 44 (2004) 57–62.

3. H. Tsujibo, H. Orikoshi, K. Shiotani, Đặc tính của chitinase C từ vi khuẩn biển

Alteromonas sp. chủng O-7, và cấu trúc gen và miền tương ứng của nó. Ứng dụng. Môi

trường. Vi sinh vật. 64 (1998) 472–478.

4. H. Meruvu, DSR Reddy, Chất thải hải sản Chitinous để sản xuất enzyme diệt nấm. Nhà trọ

Int. J. Res. Dev. 1 (2012) 108-111.

5. Sản xuất B. Krishnaveni, R. Ragunathan, Chitinase tạo thành chất thải thực phẩm biển

bởi mầm bệnh thực vật Bionectria CBNR BKRR sps và ứng dụng của nó trong các

nghiên cứu xử lý sinh học. Quốc tế Res. J. Med. Khoa học 2 (2014a) 15-19.

6. M.S. Brzezinska, U. Jankiewicz, M. Walczak, Phân hủy sinh học các chất chitinous và

sản xuất chitinase bởi đất actinomycete Streptomyces rimosus. Int. Biodeterior. Phân

hủy sinh học. 84(2013):104–110.

7. N.S. Patil, J.P. Jadhav, Sản xuất protein tế bào đơn sử dụng Penicillium ochrochloron

Chitinase và đánh giá của nó trong công thức bột cá. J. Microb. Hóa sinh. Kỹ thuật. S4:

005 (2014). doi:10.4172/1948-5948.S4-005.

8. K. Inokuma, M. Takano, K. Hoshino, Sản xuất ethanol trực tiếp từ chất nền N-

ACCEPTED
acetylglucosamine và chitin của các loài Mucor. Hóa sinh. Anh J.72 (2013) 24–32.

9. R. Hamid, MA Khan, M. Ahmad, M.M. Ahmad, M.Z. Abdin, J. Musarrat, S. Javed,

MANUSCRIPT
Chitinase: Bản cập nhật. J. Pharm. Biol. Khoa học 5(2013) 21-9.

10. A. Mathur, A. Rawat, G. Bhatt, Phân lập Bacillus sản xuất chitinase từ đất: Sản xuất và

tinh chế chito-oligosacarit từ chitin chiết xuất từ động vật giáp xác nước ngọt và hoạt

tính kháng khuẩn của chitinase. Gần đây. Res. Khoa học kỹ thuật. 3(2011) 01-06.

11. S.K. Karunya, D. Reetha, P. Saranraj, Tối ưu hóa và tinh chế chitinase được sản xuất

bởi Bacillus subtilis và hoạt tính kháng nấm của nó chống lại mầm bệnh thực vật. Quốc tế

J. pharm. Biol. Khoa học Arch. 2(2011) 1680-1685.

12. N.R. Mubarik, I. Mahagiani, A. Anindyaputri, Vi khuẩn Chitinolytic được phân lập từ

thân rễ ớt: đặc tính chitinase và ứng dụng của nó như là kiểm soát sinh học cho ruồi

trắng (Bemisia tabaci Genn.). Am. J. Nông nghiệp. Sinh học. Khoa học 5(2010) 430-

435.

13. N.N. Nawani, BP Kapadnis, AD Das, A.S. Rao, S.K. Mahajan, Thanh lọc và mô tả đặc

tính của chitinase ưa nhiệt và ưa axit từ Microbispora sp. V2 J. Appl. Vi sinh vật.

93(2002) 965-975.

14. S. Meena, RK Gothwal, J. Saxena, S. Nehra, M.K. Mohan, P. Ghosh, Tác dụng của các

ion kim loại và các hợp chất hóa học đối với chitinase được sản xuất bởi Paenibacillus

sp chịu nhiệt mới được phân lập.BISR-047 và thời hạn sử dụng của nó. Int J. Curr. Vi

sinh vật. Phụ lục Khoa học 4(2015) 872-881.

15. V. Thiagarajan, R. Revathia, K. Aparanjinib, Sản xuất chitinase tế bào bổ sung của

Streptomyces sp. PTK19 trong quá trình lên men chìm và hoạt tính lytic của nó trên

thành tế bào PTK2. Quốc tế J. Curr.Sci. 1(2011) 30-44.

16. M. Zarei, S. Aminzadeh, H. Zolgharnein, Serratia marcescens B4A chitinase tối ưu hóa

ACCEPTED
sản phẩm bằng phương pháp Taguchi. Iran. J. Công nghệ sinh học. 8(2010) 252-262.

17. B. Krishnaveni, R. Ragunathan, Chitinase sản xuất từ chất thải biển của Aspergillus

MANUSCRIPT
terreus và ứng dụng của nó trong các nghiên cứu suy thoái. Quốc tế J. Curr. Vi sinh vật.

Phụ lục Khoa học 3(2014b) 76-82.

18. S. Abirami, K. Yogalsakshmi, ASR Pushpa, M. Kananan, Sàng lọc và xác định vi khuẩn

phân hủy chitin từ môi trường đất thải vỏ tôm và tối ưu hóa môi trường của nó để sản

xuất enzyme chitinase. Thế giới J. Pharm. Pharm. Khoa học 5 (2016) 743-757.

19. S.K. Halder, C. Maity, A. Jana, A. Das, T. Paul, P.K.D.M. Mohapatra, B.K. Pati, K.C.

Mondal, (2013) Phân hủy sinh học thành thạo chất thải vỏ tôm bằng Aeromonas

hydrophilla SBK-1 để sản xuất đồng thời chitinase kháng nấm và chitosacarit chống

oxy hóa. Int. Biodeterior. Phân hủy sinh học. 79(2013) 88-97.

20. M. Jolanda, A.V. Munster, A.Y.P. Sanders, A. Geralt, A.T. Kate, A.L. Dijkhuizen,

J.E.C. Marc, A.B.V.D. Maarel, Đặc tính động học của Aspergillus niger chitinase CfcI

sử dụng phương pháp HPAEC-PAD cho các oligosacarit chitin tự nhiên. Carbohydr.

Res. 407(2015) 73-78.

21. M.A. Faramarzi, M. Fazeli, Y. Tabatabaei, S. Adrangi, K. Jami, A.L. Ahmadi, N.

Tasharrofi, F.A. Mohseni, Tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy để sản xuất chitinase bằng

cách phân lập đất của Massiliatimonae.Biotechnol. 8(2009) 93-99.

22. SC Hsu, JL Lockwood, Thạch chitin dạng bột như một môi trường chọn lọc để liệt kê

xạ khuẩn trong nước và đất. Appl. Môi trường. Vi sinh vật. 29(1975) 422-426.

23. J.L. Reissig, J.L. Strominger, L.F. Leloir, Một phương pháp đo màu được sửa đổi để

ước tính lượng đường N-acetylamino. J. Biol. Chem. 217(1955) 959-699.

ACCEPTED
24. JG Holt, N.R. Krieg, P.H.A. Sneath, JT Staley, S.T. Williams, Wilkins, Bergey's

Manual of Determinative Bacteriology 9th Eds Waverly Baltimore MD, 1994.

MANUSCRIPT
25. S. Kumar, G. Stecher, K. Tamura, MEGA7: Phân tích di truyền tiến hóa phân tử phiên

bản 7.0 cho các bộ dữ liệu lớn hơn. Mol. Biol. Evol. 33(2016) 1870-1874.

26. N.N. Nawani, D. Prakash, BP Kapadnis, Khai thác, thanh lọc và mô tả đặc tính của một

chất chống oxy hóa từ chất thải biển bằng cách sử dụng cocktail protease và chitinase.

Thế giới J Microbiol. Công nghệ sinh học. 26(2010) 1509–1517.

27. C. Jui-Hsing, L. Jo-Hsin, L. Mei-Chun, C. Poh-Shing, A.B. Arun, Y. Chiu-Chung, C.

Wen-Ming, Paenibacillus contaminans sp. nov., được phân lập từ một tấm phòng thí

nghiệm bị ô nhiễm. Quốc tế J. Syst. Evol. Vi sinh vật. 59 (2009) 125–129.

28. K. Wang, P.S Yan, L.X Cao, Tối ưu hóa các chất dinh dưỡng để sản xuất chitinase của

Serratia marcescens JPP1 chống lại aflatoxin bằng cách sử dụng thiết kế thí nghiệm

thống kê. J. Chem. Pharm. Res. 5(2013) 447-449.

29. N. Rattanakit, S. Yano, A. Plikomol, M. Wakayama, T. Tachiki, Thanh lọc Aspergillus

sp. Chitinase S1-13 và vai trò của chúng trong quá trình đường hóa chitin trong hỗn hợp

nuôi cấy trạng thái rắn với chất thải của động vật có vỏ. J. Sinh học. Sinh học.

103(2007) 535-541.

30. J.L. Xia, J. Xiong, R.Y. Zhang, Sản xuất chitinase và tối ưu hóa nó từ một phân lập mới

S. marcescens XJ-01. Ấn Độ J. Microbiol. 51(2011) 301-306.

31. RJ Jholapara, R.S. Mehta, C.S. Sawant, Tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy để sản xuất

chitinase từ vi khuẩn chitinolytic được phân lập từ mẫu đất. Quốc tế J. Dược phẩm. Tiểu

sử. Khoa học 4(2013) 464-471.

32. RK Singh, D.P. Kumar, M.K. Solanki, P. Singh, A.K. Srivastva1, S. Kumar, P.L.

ACCEPTED
Kashyap, A.K. Saxena, P.K. Singhal, D.K. Arora, Tối ưu hóa các thành phần môi

trường để sản xuất chitinase bằng rhizosphere đậu xanh liên quan đến Lysinibacillus

MANUSCRIPT
fusiformis B-CM18. J. Microbiol cơ bản. 52(2012) 1–10.

33. O. Simon, Stanley, Y. Richard, Morita, Ảnh hưởng mặn đến nhiệt độ tăng trưởng tối đa

của một số vi khuẩn được phân lập từ môi trường biển. J. Vi khuẩn. 95 (1968) 169-173.

34. M. Kumara, A. Brara, V. Vivekanandb, N. Pareeka, Sản xuất chitinase từ Humicola

grisea ưa nhiệt và ứng dụng của nó trong sản xuất chitooligosaccharides hoạt tính sinh

học. Quốc tế J. Biol. Macromol. 104(2017) 1641–1647.

35. N. Tasharrofi, S. Adrangie, M. Fazelia, H. Rastegarc, M.R. Khoshayandd, M.A.

Faramarzia, Tối ưu hóa sản xuất chitinase của Bacillus pumilus bằng phương pháp thiết

kế và phản ứng plackett-burman. Iran. J. Pharm. Res. 10(2011) 759- 768.

36. Z. Hao, Y. Cail, X. Liao, X. Zhang, X. Fang, D. Zhang, Tối ưu hóa các yếu tố dinh

dưỡng trong sản xuất chitinase từ một Chitiolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1 mới

được phân lập. Braz. J. Microbiol. 2(2012) 177-186.

37. YG Lee, K.C. Chung, SG Wi, JC Lee, H.J. Bae, Thanh lọc và tính chất của chitinase từ

Paenicillium sp. LYG 0704. Protein Expr. Thanh tịnh. 65 (2009) 244-250.

38. M.L. Duarte, M.C. Ferreira, M.R. Marvao, J. Rocha, Xác định mức độ acetyl hóa vật

liệu chitin bằng quang phổ 13C CP / MAS NMR. Quốc tế J. Biol. Macromol. 28(2001)

359-363.
 39. R. Ravindra, K.R. Krovvidi, A.A. Khan, Thông số độ hòa tan của chitin và chitosan.

Carbohydr. Đùng. 36(1998)121-127.

40.

41. Nhân vật

ACCEPTED 100
Paenibacillus vulneris CCUG 53270(T) (HE649498)

MANUSCRIPT
83 Paenibacillus yunnanensis YN2(T) (KJ914577)

39 AM900778 S PA215 (AM900778)

23
Paenibacillus xylanisolvens X11-1(T) (AB495094)

Paenibacillus soli DCY03(T) (DQ309072)

AB680850 NBRC 15377 (AB680850)

72
Paenibacillus ehimensis KCTC 3748(T) (AY116665)

Paenibacillus sp. Quảng cáo

66 P. chitinolyticus NBRC 15660(T) (BBJT01000029)

85
Paenibacillus gansuensis B518(T) (AY839866)

42. 0.020

43. Hình 1

44.

Phần mềm chuyên gia®

thiết kế (Hoạt động Biểu đồ Biểu đồ Pareto
Chitinase) ^ 1
57.69
Pareto 19.67
A: Nacl
B:
Casein J
C: Chiết xuất C
48.08
nấm men D: Kích
thước tiêm chủng H Bonf erroni Limit 14.7818
E: Glucose 14.75
F: KCl
t- V a lu e o f | E f f e c

G: 38.46
t - V a lu e o f | E f f e c t |

MgSO4
H: MgCl2 AC
J: Amoni sunfat K:
Fructose 28.85 9.83
L: Na2HPO4
Tác động tích FG
cực Tác động B
tiêu cực
t|

AG
t-Value Limit 4.30265
L
19.23
L Bonf erroni Limit E
F 14.7818 4.92

H
9.62 K

D t -Value Limit 4.
30265

0.00 0.00

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Cấp Cấp
 Một B

Hình 2

ACCEPTED
MANUSCRIPT
Một B C

105 105 105

S h r im p w a s te D e g r a d a

100 100
S h r im p w a s te D e g ra d a

S h r im p w a s t e D e g r a d a

100

95
95 95
90
90 90
85

85 85
80

80 80 75
ti o n

ti o n
tio n

0.50 0.50 0,10 0,10 0.50 0.00 0.50

0.09
0.43 0.43 0.09 0.43 0.00 0.43
0,08
0.35 0.35 0,08 0,07 0.35 0.00 0.35
0.27 0.27 0,07 0.27
0.00 0.27
B: Natri clorua A: Amoni sunfat C: Magnisium Sulphate 0,06 A: Amoni sunfat D: Potassium Chloride A: Ammonium Sulphate
0.20 0.20 0,06 0.05 0.20 0.00 0.20

D E F

105
105
105
100
S h r im p w a s te D e g r a d a

100
S h r im p w a s te D e g r a d a
S h rim p w a s t e D e g ra d a t

100
95
95 95

90
90 90

85
85 85

80 80
80

75 75
75
ti o n

tio n
io n

0,10 0,10 0.00 0.50 0.00

0.50 0.10
0.090.10
0,09 0.00 0.43 0.00 0.09
0.43
0,09 0,08 0.08
0.35 0.00 0.35 0.00 0.08
0,08 0,07
0,07 0.07 0.07
0.00
C: Magnisium Sulphate 0.06 0.27
B: Natri clorua D: Potassium Chloride 0.00 0.27
B: Sodium D: Potassium Chloride 0.06
0.06 C: Magnisium Sulphate
0,06 0,05
0,20 0.00 0.20 Chloride 0.00 0.05

Hình 3
 Một B C

21 22
21
20
20 20
19
19
C h it in a s e A c t iv

C h it in a s e A c t iv
18
18

C h itin a s e A c t iv
18
17 16
17
16 16
14
15 15

ACCEPTED
14 12
14
it y

it y
it y
0.50 0.50 0.10 0.10 0.50 0.00 0.50

0.43 0.43 0.09 0.43 0.00 0 .43

0.09
0.35 0.35 0.08 0.35 0.00 0 .35
0.080.07
0.27 0.27 0.070.06
B: Natri clorua C: Magnisium Sulphate 0.27
A: Ammonium Sulphate D: Potassium Chloride 0.00 0.27
A: Ammonium Sulphate
A: Amoni sunfat 0.06
0.20 0.20 0.05 0.20 0.00 0.2 0

MANUSCRIPT
D E F

22 22

22
20 20
20
C h itin a s e A c t iv ity

18

C h it in a s e A c t iv
18
18
C h itin a s e A c t

16 16
16
14 14
14
12 12
iv it y

it y
12

0.00 0.50 0.00

0.10 0.50 0,10 0,10
0,10 0,09 0.00 0.43 0.00 .
0.09 0.43 0,09 0
0.08 0,08 0.00 0.35 0.00 0,08 09
0.35 0,07
0,07 0. 07 0,08
0. 27
D: Potassium Chloride 0.00 B: Sodium 0.00
C: Magnisium Sulphat 0,07 0,06 0.27
B: Natri clorua D: Kali clorua 0.06 C: Magnisium Sulphate
0.06
0.05 0.20 0.00 0.20 Chloride 0,00 0,05 0,06

Hình 4

Một B

Hình 5
 ACCEPTED A

MANUSCRIPT
B
RC SAIF PU, Chandigarh

95.1

2132,94 855,94 776 ,94

932 ,93
90

85

1452 ,83
1406,83
80

%T
75 1116,78

70
1632,70
1585 ,69

65

3363 ,64

60.0
4000.0 360 0 3200 2800 2400 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 650.0
C M-1

Hình 6
 ACCEPTED
MANUSCRIPT
. Hình 7

Hình 1: Cây phát sinh loài có khả năng tối đa không có rễ của Paenibacillus sp. AD và các

loài của các chi liên quan (số gia nhập GenBank được thể hiện trong ngoặc đơn).

Sung.2 Biểu đồ Pareto cho thấy ảnh hưởng của các yếu tố khác nhau đối với (A) Suy thoái

chất thải tôm (B) Năng suất chitinase của Paenibacillus Sp. QUẢNG CÁO

Hình 3 Biểu đồ bề mặt phản ứng ba chiều cho tác dụng của A) Natri clorua và amoni sunfat, B)

Magiê sunfat và Amoni sunfat, C) Kali clorua và amoni sunfat, D) Magiê sunfat và Natri

clorua, E)
 kali clorua và natri clorua và F) Kali clorua và natri clorua để phân hủy chất thải tôm từ

Paenibacillus sp. QUẢNG CÁO

Hình 4: Biểu đồ bề mặt phản ứng ba chiều cho tác dụng của A) Natri clorua và amoni sunfat, B)

Magiê sunfat và amoni sunfat, C) Kali clorua và amoni sunfat, D) Magiê sunfat và natri

ACCEPTED
clorua, E) Kali clorua và natri clorua và F) kali clorua và natri clorua cho năng suất chitinase

từ Paenibacillus sp. QUẢNG CÁO

MANUSCRIPT
Hình 5 Kính hiển vi điện tử quét của (A) Mảnh tôm chưa được xử lý (B) Paenibacillus sp. AD

xử lý vảy tôm

Hình 6 Quang phổ FTIR của (A) Mảnh tôm (B) Paenibacillus sp. Mảnh tôm được xử lý AD (C)

Supernatant thu được sau khi xử lý

Hình 7 Phân tích TLC của chitin oligosacarit từ chất thải của tôm

BÀN

Bảng 1: So sánh đặc điểm sinh hóa của Paenibacillus sp. AD và

Paenibacillus chitinolyticus NBRC15660

Đặc trưng Paenibacillus sp. QUẢNG CÁO Paenibacillus chitinolyticus NBRC15660

Catalase -Ve +ve

Oxidase +ve +ve

Giảm nitrat +ve +ve

Sản xuất axit từ

 Glucose +ve +ve

Lactose -Ve +ve

Xylose -Ve -Ve

Thủy phân casein +ve Phản ứng yếu

ACCEPTED
Bảng 2: Thiết kế Plackett-burman để sàng lọc các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến

suy thoái chất thải tôm và sản xuất chitinase của Paenibacillus sp. QUẢNG CÁO

Yếu tố

Một:
Yếu tố

B:
Yếu tố

C: Chiết
Yếu tố

D: Kích
MANUSCRIPT Yếu tố

E:
Yếu tố

F:
Yếu tố

G:

MgSO
Yếu tố

H:
Yếu tố

J:

Amoni
Yếu tố

10

K:
Yếu tố

11

L:
Phản ứng

Chất

thải của
Phản ứng

Hoạt

Chạy Nacl Casein xuất nấm thước tiêm Glucose KCl 4 MgCl2 sunfat Fructose Na2HPO4 tôm động

men chủng Suy thoái Chitinase

% % Uml-1

(W/V) % (W / V) % (W / V) % %(W/V) % (W / V) (W/V) % (W / V) % (W / V) % (W / V) % (W / V) %

1 0.01 0.1 0.1 0.1 0.1 0 0.05 0 0 0 0.1 29 3.84

2 0.1 0.1 0.01 1 0.1 0 0.01 0 0 0.1 0 43 4.16

3 0.1 0.1 0.1 0.1 0 0 0.05 0 0.1 0.1 0 47 4.64

4 0.01 0.01 0.01 0.1 0 0 0.01 0 0 0 0 30 3.84

5 0.01 0.1 0.1 1 0 0 0.01 0 0 0.1 0.1 10 2.64

6 0.01 0.01 0.1 0.1 0.1 0 0.01 0 0.1 0.1 0 30 3.84

7 0.1 0.01 0.1 1 0 0 0.05 0 0 0 0 30 3.84

8 0.01 0.01 0.01 1 0 0 0.05 0 0.1 0.1 0.1 69 5.28

9 0.1 0.01 0.1 1 0.1 0 0.01 0 0.1 0 0.1 46 4.64

10 0.1 0.1 0.01 0.1 0 0 0.01 0 0.1 0 0.1 68 4.64

11 0.1 0.01 0.01 0.1 0.1 0 0.05 0 0 0.1 0.1 48 4

12 0.01 0.1 0.01 1 0.1 0 0.05 0 0.1 0 0 49 4

Bảng 3: Ma trận thiết kế hỗn hợp trung tâm với các giá trị thử nghiệm và dự đoán về

phân hủy chất thải tôm và sản xuất chitinase từ Paenibacillus sp. QUẢNG CÁO

Yếu tố Suy thoái chất thải tôm Hoạt động của

chitinase

% (W / (%)
V) (IUml-1)

A: Amoni B: Natri C: D:Kali

Chạy Thực tế Dự đoán Dư Thực tế Dự đoán Dư
sunfat clorua Magnisium clorua

sunfat
1 0.5 0.2 0.1 0.0005 89.00 88.25 0.75 11.51 11.07 0.44

2 0.5 0.5 0.05 0.0002 98.00 97.71 0.29 14.52 13.96 0.56

3 0.5 0.2 0.05 0.0002 78.00 77.08 0.92 10.71 10.73 -0.019

4 0.35 0.35 0.025 0.00035 90.00 90.71 -0.71 12.18 11.75 0.43

6
0.5

0.5
0.5

0.5
ACCEPTED
0.1

0.1
0.0002

0.0005
95.00

98.00
93.92

98.88
1.08

-0.88
14.22

12.52
13.73

12.54
0.49

-0.019

MANUSCRIPT
7 0.35 0.35 0.075 0.00035 98.00 98.50 -0.50 19.82 19.43 0.39

8 0.35 0.35 0.075 0.00065 71.00 70.38 0.62 9.95 9.40 0.55

9 0.5 0.5 0.05 0.0005 95.00 94.42 0.58 12.29 12.67 -0.38

10 0.35 0.35 0.125 0.00035 92.00 91.88 0.12 11.63 11.50 0.13

11 0.2 0.2 0.1 0.0002 75.00 74.42 0.58 10.11 9.66 0.45

12 0.35 0.35 0.075 0.00035 99.00 98.50 0.50 19.34 19.43 -0.087

13 0.2 0.5 0.05 0.0005 77.00 76.54 0.46 10.00 10.42 -0.42

14 0.2 0.5 0.1 0.0002 86.00 85.54 0.46 10.53 11.40 -0.87

15 0.35 0.35 0.075 0.00035 98.00 98.50 -0.50 18.90 19.43 -0.53

16 0.2 0.2 0.05 0.0005 70.00 69.92 0.083 10.05 10.47 -0.42

17 0.65 0.35 0.075 0.00035 93.00 93.04 -0.042 11.07 11.91 -0.84

18 0.2 0.5 0.1 0.0005 79.00 78.75 0.25 10.50 10.41 0.090

19 0.35 0.35 0.075 0.00035 99.00 98.50 0.50 20.01 19.43 0.58

20 0.35 0.05 0.075 0.00035 76.00 75.54 0.46 12.26 11.87 0.39

21 0.2 0.2 0.1 0.0005 74.00 74.88 -0.88 9.25 10.45 -1.20

22 0.2 0.2 0.05 0.0002 78.00 77.71 0.29 9.18 9.79 -0.61

23 0.35 0.35 0.075 0.00035 98.00 98.50 -0.50 19.50 19.43 0.073

24 0.05 0.35 0.075 0.00035 73.00 73.54 -0.54 10.24 8.84 1.40
25 0.5 0.2 0.05 0.0005 80.00 81.04 -1.04 11.46 11.22 0.24

26 0.35 0.35 0.075 0.00035 99.00 98.50 0.50 18.99 19.43 -0.44

27 0.5 0.2 0.1 0.0002 75.00 76.04 -1.04 10.26 10.48 -0.22

28 0.35 0.35 0.075 0.00005 72.00 73.21 -1.21 9.92 9.91 0.013

29

30
0.2

0.35
0.5

0.65
ACCEPTED
0.05

0.075
0.0002

0.00035
92.00

99.00
91.58

100.04
0.42

-1.04
11.14

15.24
11.51

15.07
-0.37

0.17

MANUSCRIPT
Bảng 4: Phân tích phương sai (ANOVA) cho mô hình bề mặt đáp ứng được phát triển

để phân hủy chất thải tôm tối ưu

Tổng của Trung F giá trị p

bình
Nguồn Hình Df Giá trị Prob > F
vuông Vuông
Mẫu 3308.22 14 236.3 267.51 < 0,0001 Đáng kể

A-Amoni

Sulfat 570.37 1 570.37 645.71 < 0,0001

B-Natri clorua 900.37 1 900.37 1019.29 < 0,0001

C-Magiê

Sulfat 2.04 1 2.04 2.31 0.1492

D-Kali

Clorua 12.04 1 12.04 13.63 0.0022

AB 45.56 1 45.56 51.58 < 0,0001

AC 5.06 1 5.06 5.73 0.0302

Quảng cáo 138.06 1 138.06 156.3 < 0,0001

TCN 7.56 1 7.56 8.56 0.0104

BD 52.56 1 52.56 59.5 < 0,0001

CD 68.06 1 68.06 77.05 < 0,0001

 A2 396.5 1 396.5 448.87 < 0,0001

B2 196.57 1 196.57 222.54 < 0,0001

C2 89.07 1 89.07 100.84 < 0,0001

D2 1222.86 1 1222.86 1384.37 < 0,0001

Dư

Thiếu phù hợp ACCEPTED

13.25

11.75
15

10
0.88

1.18 3.92 0.0725 không đáng kể

MANUSCRIPT
Lỗi thuần túy 1.5 5 0.3

Tổng màu 3321.47 29

Lắp mô hình C.V= 1,09 R-sq = 99,60% R-Sq (Pred) = 97,90% R-Sq (Adj) = 99,23%

Bảng 5: Phân tích phương sai (ANOVA) cho mô hình bề mặt đáp ứng được phát triển cho năng

suất chitinase tối ưu

Tổng của Trung F giá trị p

bình
Nguồn Hình vuông Df Giá trị Prob > F
Vuông
Mẫu 370.6 14 26.47 46.24 < 0,0001 Đáng kể

A-Amoni

Sulfat 14.09 1 14.09 24.62 0.0002

B-Natri

Clorua 15.28 1 15.28 26.69 0.0001

C-Magiê

Sulfat 0.1 1 0.1 0.17 0.6817

D-Kali

Clorua 0.38 1 0.38 0.67 0.4265

AB 2.27 1 2.27 3.97 0.0648

AC 0.015 1 0.015 0.026 0.8735

 Quảng cáo 0.037 1 0.037 0.065 0.8026

TCN 5.06E-04 1 5.06E-04 8.84E-04 0.9767

BD 3.16 1 3.16 5.52 0.0329

CD 0.011 1 0.011 0.018 0.894

A2

B2 ACCEPTED
140.47

60.83
1

1
140.47

60.83
245.38

106.27
< 0,0001

< 0,0001

MANUSCRIPT
C2 104.35 1 104.35 182.29 < 0,0001

D2 163.7 1 163.7 285.96 < 0,0001

Dư 8.59 15 0.57

không

Thiếu phù hợp 7.61 10 0.76 3.9 0.0731 đáng kể

Lỗi thuần túy 0.98 5 0.2

Tổng màu 379.19 29

Lắp mô hình C.V= 5,86 R-sq = 97,74% R-Sq (Pred) = 88,07% R-Sq (Adj) = 95,62%