Download and Read online, DOWNLOAD EBOOK, [PDF EBOOK EPUB ], Ebooks

download, Read Ebook EPUB/KINDE, Download Book Format PDF

Comparative High Pressure Biology Sébert

OR CLICK LINK
https://textbookfull.com/product/comparative-high-
pressure-biology-sebert/

Read with Our Free App Audiobook Free Format PFD EBook, Ebooks dowload PDF
with Andible trial, Real book, online, KINDLE , Download[PDF] and Read and Read
Read book Format PDF Ebook, Dowload online, Read book Format PDF Ebook,
[PDF] and Real ONLINE Dowload [PDF] and Real ONLINE
More products digital (pdf, epub, mobi) instant
download maybe you interests ...

High Pressure Processing of Fruit and Vegetable

Products 1st Edition Milan Houška

https://textbookfull.com/product/high-pressure-processing-of-
fruit-and-vegetable-products-1st-edition-milan-houska/

Pressure Cooking Idiot s Guides Tom Hirschfeld

https://textbookfull.com/product/pressure-cooking-idiot-s-guides-
tom-hirschfeld/

High Pressure Processing of Food Principles Technology

and Applications 1st Edition V.M. Balasubramaniam

https://textbookfull.com/product/high-pressure-processing-of-
food-principles-technology-and-applications-1st-edition-v-m-
balasubramaniam/

2017 ASME Boiler and Pressure Vessel Code Section VIII

Rules for Construction of Pressure Vessels Division 3
Alternative Rules for Construction of High Pressure
Vessels 1st Edition American Society Of Mechanical
Engineers
https://textbookfull.com/product/2017-asme-boiler-and-pressure-
vessel-code-section-viii-rules-for-construction-of-pressure-
vessels-division-3-alternative-rules-for-construction-of-high-
Expressions of High Status: A Comparative Synthesis 2nd
Edition Jean-Pascal Daloz

https://textbookfull.com/product/expressions-of-high-status-a-
comparative-synthesis-2nd-edition-jean-pascal-daloz/

Indian Food Under Pressure Indian Recipes for Your

Electric Pressure Cooker Ashley Singh Thomas

https://textbookfull.com/product/indian-food-under-pressure-
indian-recipes-for-your-electric-pressure-cooker-ashley-singh-
thomas/

Evolution, the Logic of Biology 1st Edition John S.

Torday

https://textbookfull.com/product/evolution-the-logic-of-
biology-1st-edition-john-s-torday/

Radiation Biology for Medical Physicists 1st Edition C.

S. Sureka

https://textbookfull.com/product/radiation-biology-for-medical-
physicists-1st-edition-c-s-sureka/

Evolution, the Logic of Biology 1st Edition John S.

Torday

https://textbookfull.com/product/evolution-the-logic-of-
biology-1st-edition-john-s-torday-2/
COMPARATIVE
HIGH PRESSURE
BIOLOGY
COMPARATIVE
HIGH PRESSURE
BIOLOGY

Editor
PHILIPPE SÉBERT
Orphy-EA 4324
Université de Brest-UEB
6, Avenue Le Gorgeu 29238 Brest Cedex 3
France

Science Publishers
Enfield (NH) Jersey Plymouth
Science Publishers www.scipub.net
234 May Street
Post Office Box 699
Enfield, New Hampshire 03748
United States of America

General enquiries : info@scipub.net

Editorial enquiries: editor@scipub.net
Sales enquiries : sales@scipub.net

Published by Science Publishers, Enfield, NH, USA

An imprint of Edenbridge Ltd., British Channel Islands
Printed in India

© 2010 reserved

ISBN 978-1-57808-638-2

Cover Illustration reproduced by courtesy of M. Castellini and Y. Grossman

Library of Congress Cataloging-in-Publication Data

Comparative high pressure biology / editor, Philippe
Sébert.
p. cm.
Includes bibliographical references and index.
ISBN 978-1-57808-638-2 (hardcover)
1. High pressure biochemistry. 2. High pressure biology.
3. High pressure chemistry. I. Sébert, Philippe.
QP517.H53C66 2009
572'.43--dc22
2009032722

All rights reserved. No part of this publication may be reproduced,

stored in a retrieval system, or transmitted in any form or by any
means, electronic, mechanical, photocopying or otherwise, without
the prior permission of the publisher, in writing. The exception to
this is when a reasonable part of the text is quoted for purpose of
book review, abstracting etc.

This book is sold subject to the condition that it shall not, by way
of trade or otherwise be lent, re-sold, hired out, or otherwise circulated
without the publisher’s prior consent in any form of binding or cover
other than that in which it is published and without a similar condition
including this condition being imposed on the subsequent purchaser.
 Foreword

It should be noted that hydrostatic pressure is an environmental factor as

well as a thermodynamical factor. In thermodynamics pressure, as
temperature does, can modify enzyme kinetics, membrane fluidity and more
generally structure and/or function of macromolecules and their
interactions. Clearly, high pressure is potentially able to modify all the
biological process which, in return, makes pressure an efficient tool. In the
same way, as an environmental factor, pressure naturally concerns most of
the species living on the earth due to the fact that about 80% of the biomass
lives at depth, mainly in the oceans which represent about 70% of the earth
surface. To the species living under pressure, we must add the species (birds,
mammals and thus Man) which episodically are submitted to relatively
high pressures for feeding, reproduction, exploration, working activities
and also leisure (for these species pressure gas effects must also be
considered).
From the molecules to the overall organism, via the cells and unicellular
species, invertebrates and vertebrates, ectotherms and endotherms, more
than 30 specialists have participated in this book in order to offer a panorama
of their topic as complete as possible. The objective of this book is to present
the state of art in terms of comparative high pressure biology. Consequently,
not only does this book provide the more recent results in each of its chapter
but suggests new directions for research. I hope that the diversity in the
approaches and the numerous animal species studied at different levels of
organization make this ‘pressure book’ interesting for biologists, whatever
their research topic, and attractive for adventurous young researchers
looking out for a fascinating world.
Finally, I would like to thank all the contributors who offer through this
book, many interesting results, ideas and views useful for any researcher or
teacher.

Philippe SÉBERT
 Contents

Foreword v
List of Contributors ix

PRESSURE AND CELL COMPONENTS

1. Protein Kinetics under High Pressure 3
S. Marchal, J. Torrent and R. Lange
2. Protein Folding and Aggregation under Pressure 25
L. Smeller
3. Pressure and Heat Shock Proteins 43
F.G. Tölgyesi and C. Böde
4. Pressure Perturbation of Artificial and Natural Membranes 61
R. Winter
5. High Pressure and Food Conservation 85
E. Dumay, D. Chevalier-Lucia and T. López-Pedemonte

PRESSURE AND CELL AND TISSUE FUNCTIONS

6. Pressure Effects on Cells 121
S. Daniels and Y. Grossman
7. Pressure Sensing: Depth Sensors and Depth Usage 143
P.J. Fraser
8. Pressure Effects on Mammalian Central Nervous System 161
Y. Grossman, B. Aviner and A. Mor
9. Pressure and Osmoregulation 187
A.J.R. Péqueux and P. Sébert
10. Muscle Function and High Hydrostatic Pressures 211
O. Friedrich
11. Pressure and Reactive Oxygen Species 251
C. Moisan, A. Amérand, Y. Jammes, C. Lavoute and J.J. Risso
viii Comparative High Pressure Biology

PRESSURE AND LIVING ORGANISMS

12. Piezophilic Prokaryotes 285
D. Prieur, D. Bartlett, C. Kato, Ph. Oger and M. Jebbar
13. Effects of the Deep-Sea Environment on Invertebrates 323
J.F. Siebenaller
14. Fish and Pressure 347
A. Damasceno-Oliveira and P. Sébert
15. Pressure Tolerance in Diving Mammals and Birds 379
M. Castellini

PRESSURE AND MAN

16. Introduction to the Effects of Pressure on Human 401
Organisms and Other Mammals
J.C. Rostain
17. Ventilatory and Circulatory Responses to Diving 405
Y. Jammes
18. Inert Gas Narcosis 413
J.C. Rostain and C. Lavoute
19. The High Pressure Nervous Syndrome 431
J.C. Rostain, J.J. Risso and J.H. Abraini
20. Hyperbaric Oxygen Therapy 465
S.R. Thom
21. High Hydrostatic Pressure and Cancer 503
G. Blümelhuber
22. Working Under Pressure 519
J.C. Le Péchon
Index 557
 List of Contributors

Abraini, J.H.
Université de Caen UMR 6232, CI-NAPS, Centre CYCERON, BP 5229,
Boulevard Becquerel, 14074 Caen cedex, France.
E-mail: abraini@cyceron.fr
Amérand, A.
ORPHY EA4324, Universite Europeenne de Bretagne, Universite de
Brest, UFR Sciences et Techniques, France.
E-mail: aline.amerand@univ-brest.fr
Aviner, B.
Department of Physiology, Faculty of Health Sciences,Ben-Gurion
University of the Negev, Beer-Sheva, 84105, Israel.
E-mail: benaviner@gmail.com
Bartlett, D.
8750 Biological Grade, 4405 Hubbs Hall, Marine Biology Research
Division, Center for Marine Biotechnology and Biomedicine, Scripps
Institution of Oceanography, University of California, San Diego
92093-0202, La Jolla California, USA.
E-mail: dbartlett@ucsd.edu
Blumelhuber, G.
Sonnenweg 16, 85084 Reichertshofen, Germany.
E-mail: info@immobrau.com
Bode, C.
Institute of Biophysics and Radiation Biology, Semmelweis
University, H-1444 Budapest P.O.Box 263.
E-mail: Csaba.Bode@eok.sote.hu
x Comparative High Pressure Biology

Castellini, M.
School of Fisheries and Ocean Sciences, University of Alaska
Fairbanks, Fairbanks, Alaska, USA 99775.
E-mail: mikec@ims.uaf.edu
Chevalier-Lucia, D.
Assistant Professor, Department of Agro-resources and Biological
and Industrial Processes, Mixed Research Unit of Agro-polymer
Engineering and Emerging Technologies, Université Montpellier 2,
Sciences et Techniques, Place E.Bataillon, 34095 Montpellier, France.
E-mail: Dominique.Chevalier-Lucia@univ-montp2.fr
Damasceno-Oliveira, A.
CIMAR-LA/CIIMAR, Universidade do Porto, Rua dos Bragas, 289
4050-123 Porto, Portugal.
E-mail: aol@ciimar.up.pt
Daniels, S.
Wales Research and Diagnostic Positron Tomography Imaging Centre
School of Medicine, Cardiff University, Cardiff CF14 4XN, UK.
E-mail: danielss@cf.ac.uk
Dumay, E.
Professor, Department of Agro-resources and Biological and
Industrial Processes, Mixed Research Unit of Agro-polymer
Engineering and Emerging Technologies, Université Montpellier 2,
Sciences et Techniques, Place E.Bataillon, 34095 Montpellier, France.
E-mail: Eliane.Dumay@univ-montp2.fr
Fraser, P.J.
Institute of Biological and Environmental Sciences, Zoology
Department, College of Life Sciences and Medicine, Aberdeen
University, Tillydrone Avenue, Aberdeen, UK, AB24 2TZ.
E-mail: p.fraser@abdn.ac.uk
Friedrich, O.
School of Biomedical Sciences, University of Queensland, Skerman
Bldg, QLD 4072, St Lucia, Brisbane, Australia.
E-mail: o.friedrich@uq.edu.au
Grossman, Y.
Feldman Chair for Neurophysiology, Department of Physiology,
Faculty of Health Sciences, Zlotowki Center for Neuroscience, Ben-
Gurion University of the Negev, Beer-Sheva, 84105, Israel.
E-mail: ramig@bgu.ac.il
 List of Contributors xi

Jammes, Y.
UMR MD2 P2COE, Faculté de Médecine, Université de la
Méditerranée, France.
E-mail: jammes.y@jean-roche.univ-mrs.fr
Jebbar, M.
Laboratoire de Microbiologie des Environnements extremes, UMR
6197 (UBO, Ifremer, CNRS), Universite de Brest, France.
E-mail: mohamed.jebbar@univ-brest.fr
Kato, C.
Extremobiosphere Research Center, Japan Agency for Marine-Earth
Science and Technology, 2-15 Natsushima-cho, Yokosuka 237-0061,
Japan.
E-mail: kato_chi@jamstec.go.jp
Lange, R.
INSERM U710, Université Montpellier 2, Place Eugene Bataillon
34095 Montpellier cedex5, France.
E-mail: reinhard.lange@inserm.fr
Lavoûte, C.
Université dela Méditerranée et Institut de Médecine Navale di Service
de Santé des Armées, UMR-MD2—Physiologie et physiopathologie
en condition d’oxygenation extrême, Institut de Neurosciences Jean
Roche, Faculté de Médecine Nord, Bd P. Dramard, 13015 Marseille
France.
E-mail: cecile.lavoute@univmed.fr
Le Péchon, J-C.
Ingénieur Conseil, 94, rue de Buzenval, 75020 Paris, France.
E-mail: hyperbar@club-internet.fr
López-Pedemonte, T.
Assistant Professor, Departamento de Ciencia y Tecnologia de los
Alimentos, Facultad de Quimica—Universidad de la República
(UDELAR), Avenida General Flores 2124 – Montevideo, Uruguay.
E-mail: tlopez@fq.edu.uy
Marchal, S.
INSERM U710, Université Montpellier 2, Place Eugene Bataillon,
34095 Montpellier cedex5, France.
E-mail: stephane.marchal@inserm.fr.
xii Comparative High Pressure Biology

Moisan, C.
ORPHY EA4324, Université Européenne de Bretagne, Université de
Brest, UFR Sciences et Techniques, France.
E-mail: christine.moisan@univ-brest.fr
Mor, A.
Department of Physiology, Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion
University of the Negev, Beer-Sheva, 84105, Israel.
E-mail: morami12@gmail.com
Oger, P.
Laboratoire de Science de la Terre, UMR 5570 CNRS-ENSL-UCBL
46, allée D’Italie, F-69364 Lyon, France.
E-mail: poger@ens-lyon.fr
Péqueux, A.J.R.
Ecophysiology Unit, University of Liège 22,Quai Van Beneden B-
4020 Liège, Belgium.
E-mail: A.Pequeux@ulg.ac.be
Prieur, D.
Laboratorie de Microbiologie des Environnements extrémes, UMR
6197 (UBO, Ifremer, CNRS), Université de Brest, France.
E-mail: daniel.prieur@univ-brest.fr
Risso, J.J.
Université de la Méditerranee et Institut de Médecine Navale du
Service de Santé des Armées, UMR-MD2—Physiologie et
physiopathologie en condition d’oxgénation extrême IMNSSA, BP
84, 83800 Toulon Armées, France.
E-mail: j.jrisso@imnssa.net
Rostain, J.C.
Université de la Méditerranée et Institut de Médecine Navale du
Service de Santé des Armees, UMR-MD2—Physiologie et
physiopathologie en condition d’oxgénation extrême, Institut de
Neurosciences Jean Roche, Faculté de médicine Nord, Bd P.Dramard
13015 Marseille, France.
E-mail: jean-claude.rostain@univmed.fr
Sébert, P.
ORPHY–EA4324, Université Européenne de Bretagne—UBO 6,
Avenue Le Gorgeu, CS 93837, 29238 Brest Cedex3 France.
E-mail: Philippe.sebert@univ-brest.fr
 List of Contributors xiii

Siebenaller, J.F.
Department of Biological Sciences, Louisiana State University, Baton
Rouge, Louisiana 70803 USA.
E-mail: zojose@1su.edu
Smeller, L.
Semmelweis University, Dept. Biophysics and Radiation Biology,
Tuzolto u. 37-47, Budapest IX, H-1444 Pf 263.
E-mail: laszlo.smeller@eok.sote.hu
Thom, S.R.
Professor of Emergency Medicine, Chief, Hyperbaric Medicine,
University of Pennsylvania, 3620 Hamilton Walk, Philadelphia, PA
19104 USA.
E-mail: sthom@mail.med.upenn.edu
Tolgyesi, F.G.
Institute of Biophysics and Radiation Biology, Semmelweis
University, H-1444 Budapest P.O.B. 263.
E-mail: Ferenc.Tolgyesi@eok.sote.hu
Torrent, J.
INSERM U710, Université Montpellier 2, Place Eugene Bataillon,
34095 Montpellier cedex5, France.
E-mail: joan.torrent@inserm.fr.
Winter, R.
TU Dortmund University, Physical Chemistry 1, Biophysical
Chemistry, Otto-Hahn Str. 6, D-44227 Dortmund, Germany.
E-mail: roland.winter@tu-dortmund.de
 PRESSURE AND
CELL COMPONENTS
 1
Protein Kinetics under High
Pressure
Stéphane Marchal, Joan Torrent and Reinhard Lange

INTRODUCTION

High pressure affects protein structures at the secondary, tertiary and

quaternary level (Gross and Jaenicke, 1994). Depending on the protein and
on incubation conditions, exposure to pressure may thus convert a protein
from a-helical to b-sheet structure, induce protein unfolding, or dissociate
or aggregate proteins (Smeller et al., 2006). Of course, these effects are very
important for a variety of applications, such as maintaining or optimizing
the structural integrity of enzymes used as bio-catalysts under extreme
conditions of temperature and pressure, developing new and safer food
products, or controlling folding/misfolding reactions of proteins associated
to systemic or neurodegenerative diseases. (Lange, 2006).
In the last decades, considerable progress was made in developing
analytical instruments for recording protein structural changes under high
pressure. The interest of using pressure as structure perturbation parameter
is i) it provides complementary thermodynamic information to the more
conventional parameters, such as temperature or chemical agents; ii) pressure
is a relatively mild perturbant: irreversible structural changes, such as those
induced by heat, can generally be avoided; iii) its use does not lead to
complications such as specific interactions of protein with chemical
denaturants.
However, this progress was mainly restricted to the study of pressure
dependent reactions under equilibrium conditions. Only in the last decade,
the idea of studying protein reaction kinetics under pressure became popular.

INSERM U710, Université Montpellier 2, Place Eugène Bataillon 34095 Montpellier

cedex5, France.
E-mail: stephane.marchal@inserm.fr, joan.torrent@inserm.fr, reinhard.lange@inserm.fr
4 Comparative High Pressure Biology

The underlying theory is simple, though. The pressure dependence of the

rate constant (k) of an elementary process yields the activation volume, DV‡,
which is equal to the difference in volumes of the kinetic transition state, V‡,
and the ground state, Vg. This relation is described in equations 1 and 2:
(¶ lnk / ¶p)T = –(¶DG‡ / ¶p)T/RT = – DV‡ / RT (1)
DV‡ = V‡ – Vg (2)
where p is the pressure, T the temperature, R, the gas constant and DG‡ the
activation free energy. Hence, any chemical reaction—and a fortiori one
involving protein structural changes— is accelerated (for a negative value
of DV‡) or decelerated (for a positive value of DV‡) by pressure depending on
the relative volume of the kinetic transition state with respect to that of the
ground state (Mozhaev et al., 1996). These differences in volume are due to
transient changes of protein packing and hydration in the course of the
reaction (Royer, 2005). As an example, a value of DV‡ of 69 mL mol–1, found
for invertase (Morild, 1981), gives rise to a more than 100-fold acceleration
for a pressure increase from 0.1 to 200 MPa.
In practice, protein kinetics under high pressure have been studied
mainly by two methods, using high pressure stopped flow and pressure
jump devices. Here we will illustrate the use of these experimental set-ups
for studying the mechanism of enzyme activity, of ligand binding to
hemoproteins, and of protein folding. As our team is specialized in these
approaches, most of the examples will stem from our laboratory in
Montpellier.

EXPERIMENTAL

High pressure stopped flow technique

The high pressure stopped-flow technique (Fig. 1) was introduced by

Heremans and further developed by Balny’s group (Balny et al., 1984,
1987) and Merbach (Pappenberger et al., 2000). It allows mixing, within less
then 10 ms, of two solutions under defined pressure (up to 200 MPa) and
temperature (between –20 and +40°C). The reactant solutions (5 mL) are
kept in glass syringes. The mixing bloc and observation cell (1 cm optical
path) are made of Teflon. The apparatus is equipped with quartz windows
for absorbance and fluorescence measurements and interfaced via optical
fibers to a BioLogic light source and detection system.
 Protein Kinetics under High Pressure 5

Figure 1. Schematic representation of a high pressure stopped-flow apparatus. The actual

mixing device, consisting of mixing syringes (1), mixing chamber (2), observation cell (3),
and waste syringe (4), is introduced via an opening screw (5) into a silicon oil containing
cylindrical high pressure cell (6), equipped with quartz windows (7). Mixing of the reactants
contained is induced by a pneumatically driven upward movement of a central piston (8),
pushing upward the pistons of the mixing syringes.
6 Comparative High Pressure Biology

Pressure-jump device to induce protein structural relaxations

Figure 2 gives a schematic representation of a pressure-jump device

connected to a fluorescence spectrometer, as it is used our laboratory. A
limitation of this technique is the pressure-induced variation of temperature.
During a pressure-jump, the temperature of the sample is heated (for upward
jumps) or cooled (for downward jumps) by about 0.1°C for a pressure jump
amplitude of 10 MPa. In order to minimize these temperature variations,
experiments are therefore usually limited to pressure jump amplitudes of 50
MPa (Font et al., 2006b)

Absorbance

Fluorescence

Figure 2. Schematic representation of the pressure jump device. The high pressure optical
cell (1) allows the sample cell to be cooled or heated at a set temperature, and operates at
a pressure of several hundred MPa (up to 700 MPa) without leakage, even at sub-zero
temperatures. It holds a quartz sample cell, which is sealed with a polyethylene stretch,
maintained by a rubber O-ring. This high pressure cell, equipped with sapphire windows,
is easily interfaced to conventional spectrophotometers and fluorimeters. Pressure is
generated by a manual pump (2) and controlled by HP valves (3). The pressure vector,
water (4), is mediated through stainless steel capillaries. A home made pressure-jump
device (Torrent et al., 2006a) can be connected to the high pressure cell. Pressure jumps are
carried out by opening an electrically driven pneumatic valve (5) localized between the
high pressure optical cell and the ballast tank (6). The pressure-jumps consist of sudden
changes of pressure (up to 100 MPa) within a pressure range of 0.1–600 MPa.

THE USE OF HIGH PRESSURE TO STUDY THE MECHANISM

OF ENZYME REACTIONS

The main problem for studying enzyme reactions under high pressure is
the generally high reactivity of enzymes; the conversion of a substrate into a
product starts immediately after mixing the enzyme with its substrate. If
this mixing is done at atmospheric pressure, the time lap that is necessary to
raise the pressure of the mixture precludes observation of early reaction
stages. Moreover, in the case of rapidly reacting enzymes, the reaction may
be even finished before the end of the pressurization time.
 Protein Kinetics under High Pressure 7

A convenient means to overcome this difficulty is given by the stopped-

flow technique under high pressure (see Fig. 1). This approach allows
keeping enzyme and substrate separated during the pressurization time.
They are mixed only once the final pressure has been reached. An alternative
technical solution, optimized for steady state enzyme kinetics, has been
developed by (Hoa et al., 1990). The use of high pressure stopped-flow devices
for studying enzyme activity is illustrated by the following three examples.
Frequently, enzyme catalyzed chemical reactions are carried out by
oligomeric proteins. However, one may ask, what is the role of the oligomeric
states? And are the monomers equally active as dimmers or tetramers? These
questions have been dealt with by Kornblatt and co-workers for the case of
yeast enolase (Kornblatt et al., 1998). This dimeric enzyme catalyzes the
interconversion of 2-phosphoglyceric acid and phosphoenolpyruvate.
Raising pressure induces the dissociation of the protein into monomers.
This information could be deduced from a fourth derivative UV absorbance
spectroscopic investigation (Lange et al., 1996) under pressure. Furthermore,
as shown by stopped-flow results, the activity of the enzyme decreased as a
function of pressure. As shown in Fig. 3, these two processes occurred
concomitantly, suggesting that monomers do not retain native-like structures.

Figure 3. Effects of pressure on the quaternary structure and activity of yeast enolase. The
quaternary structure (full dots) and the enzyme activity (open circles) are expressed as
percentage of the respective values at atmospheric pressure. Adapted from (Kornblatt
et al., 1998).
8 Comparative High Pressure Biology

This study also showed that pressure-induced dissociation of yeast

enolase in the presence of magnesium involves the loss of bound metal ion
Mg(II). Interestingly, when magnesium was replaced by manganese, the
application of pressure did not lead to a loss of the metal ion. Moreover, the
pressure-induced monomers of Mn-bound enolase remained active and
showed a native-like structure. Figure 4 resumes the effects of pressure on
magnesium and manganese-bound yeast enolase (Kornblatt et al., 2004).
Step 1
Mg +2 -dimers Metal-free monomer* + Mg2+

Step 2
Mn +2 -dimers Mn +2 -monomers

Step 3 Step 4

Mn+2 -monomers* Metal-free monomer* + Mn2+

(Species in bold are enzymatically active; monomers and monomers* indicate different
conformations of the monomer)

Figure 4. Effects of hydrostatic pressure on yeast enolase. Adapted from (Kornblatt

et al., 2004).

Carboxypeptidase from the thermophilic archaebacterion Sulfolobus

solfataricus is another example of successful application of high pressure to
study enzyme activity. In the absence of glycerol and beta-mercaptoethanol,
this otherwise heat-stable enzyme undergoes thermal inactivation at 50°C.
However, this loss of activity can be inhibited when the enzyme is maintained
at 200 MPa (Bec et al.,1996). As shown in Fig. 5, at higher temperatures, even
higher pressures (up to 400 MPa) can be used to drastically reduce the
thermal inactivation rate. This property of high pressure to stabilize proteins
against thermal inactivation is interesting for the use of enzymes in
biotechnological applications under high temperature conditions.
Using the same carboxypeptidase, pressure was used for investigating
the role of individual non-covalent interactions in enzymatic reactions
(Occhipinti et al., 2006). This carboxypeptidase turned out to be ideally
suited for this investigation due to its very broad substrate specificity. This
enzyme can remove any amino acid, with the exception of praline, from
short peptides and N-blocked amino-acids, irrespective of the blocking group.
This allowed a first comparative analysis of the effects temperature and
pressure have on the interaction of an enzyme with a broad range of
substrates. Furthermore, the pressure and temperature dependence of the
enzyme kinetic parameters (turnover number and Michaelis constant) could
be used to dissect the individual non-covalent interactions in substrate
binding. Together with molecular docking experiments performed on a 3D
 Protein Kinetics under High Pressure 9

Figure 5. Effect of pressure on the inactivation rate of carboxypeptidase from S. solfataricus

at different temperatures. Adapted from (Bec et al., 1996).

model of the enzyme, it turned out that both hydrophobic and energetic
interactions (i.e., stacking and van der Waals) contribute most strongly to
substrate binding.
As shown in Fig. 6, a strong correlation was observed between the
volume changes associated with Km (DVKm) and kcat (DV‡kcat). Taking into
account the kinetic reaction model of ordered Bi Bi system, describing Km
and kcat in terms of individual rate constants, this correlation indicates that
the pressure dependence of the kinetic substrate binding constant does not
depend on the nature of the substrate. However, as shown in Fig. 7, the
thermodynamic parameters describing the temperature dependence of the
enzyme-substrate interaction and those describing its pressure dependence
were not correlated. This suggests that—in contrast to the pressure
dependence—the temperature dependence of the kinetic substrate binding
constant depends on the nature of substrate.

LIGAND BINDING TO HEMOPROTEINS

In the field of hemoproteins, one of the key features of the puzzling

mechanism of heme-type monooxygenases has been to identify the structural
features responsible for binding and subsequent activation of molecular
10 Comparative High Pressure Biology

Figure 6. Distribution of the volume changes associated with the Michaelis constants
(DVKm) versus the activation volumes (DV‡kcat) of the catalytic step for different N-blocked
amino acids used as substrates. Reprinted with permission from (Occhipinti et al., 2006).

Figure 7. Distribution of the enthalpy changes associated with the Michaelis constants
(DHKm) versus the volume changes associated with the Michaelis constants (DVKm) for
different N-blocked amino acids used as substrates. Reprinted with permission from
(Occhipinti et al., 2006).
 Protein Kinetics under High Pressure 11

oxygen. The best-studied monooxygenase is cytochrome P-450, the generic

name for a multigene family of heme-thiolate proteins that catalyze the
oxidation of a variety of exogenous, as well as endogenous, substrates
(Makris et al., 2002; Makris et al., 2003; Sligar, 1999). Closely related to P450
is nitric oxide synthase (NOS), a two-domains protein that consists of a
cytochrome P450 reductase (Bredt et al., 1991) domain and an oxygenase
domain that resembles cytochrome P450 (Marletta, 1994; McMillan et al.,
1992; Stuehr and Ikeda-Saito, 1992; White and Marletta, 1992). For both
classes of proteins, the heme moiety in its active form contains a
pentacoordinated high-spin iron (FeIII) with an axial cysteine thiolate ligand.
Oxygen can bind to the heme iron as a sixth ligand. This step is the essential
prerequisite for its enzymatic function. Generally, observation of these binary
complexes is very difficult because of their restricted stability in the timescale
of measurement at ambient temperature (Gorren et al., 2000; Lipscomb et al.,
1976; Peterson et al., 1972; Sligar et al., 1974). Besides oxygen, other small
ligands can bind. For example, carbon monoxide (CO) induces a
characteristic red shift of the Soret band to 450nm. Due to the chemical
stability of the ferrous iron -CO complex, the latter is often used as a model
for a better understanding of the interaction of cytochrome P-450 and NOS
with oxygen. An example for a stopped-flow kinetics of CO-binding under
high pressure to cytochrome P450 is shown in Fig. 8.
Several studies reported the importance of thiolate as a fifth proximal
heme-iron ligand on O2 activation for cytochrome P450. Using high pressure
stopped-flow kinetic experiments, Lange et al., 1994 have determined the
activation volume for CO binding in several isoforms of cytochrome P450 in
the absence of a substrate and compared the results with those obtained
with histidine ligated hemoproteins such as haemoglobin and myoglobin.
They pointed out that the pressure effect depended on the nature of the
proximal axial heme ligand. Markedly negative values of the transition
state volume were determined for histidine ligand proteins indicative of
protein conformational changes and/or solvation processes of the transition
state. In contrast, small positive activation volume changes led the authors
to the conclusion that CO-binding transition state was only slightly affected
by pressure for thiolate ligated proteins (Table 1). A first explanation of the
origin of this behaviour was to suggest the presence of the negatively charged
sulphur from cysteine ligand that produces specific electronic properties.
Reconsidering this conclusion, Jung et al. (2002) showed that CO-
binding in cytochrome P450cam complexed with substrate analogues of
camphor carrying methyl groups was also characterized by negative
activation volumes in contrast to the results observed for the protein in the
presence or in the absence of natural substrates (Jung et al., 2002). From
these observations, the authors suggested that the accessibility of the protein
heme centre can be modulated by substrate binding. The positive sign of the
12 Comparative High Pressure Biology

Figure 8. Time course of the CO binding to cytochrome P-450 BM3 after stopped flow
mixing at 150 MPa. Kinetics were started by mixing equal volumes (60µl) of the reduced
form of enzyme and CO solution in a thermostated high-pressure cell placed in Aminco
DW2 spectrophotometer operating in dual wavelength mode. The experiments were set-
up with one syringe filled with enzyme and the other one containing the CO-saturated
solution (1mM). Enzyme and gas-saturated solutions were prepared as described by
(Gorren et al., 2000; Lange et al., 2001). The monoexponential fit is shown by the solid line
through data points.

Table 1. Activation volume changes of the CO binding to various hemoproteins.

Enzyme Ligand DV ‡ (ml.mol –1 ) References

–
P-450scc S (cys) 2±2 (Lange et al., 1994)
P-450LM2 S– (cys) 3±2 (Lange et al., 1994)
P-450LM3 S– (cys) 6±5 (Lange et al., 1994)
P-450cam S– (cys)
4.6 ± 2.0 (slow phase) (Jung et al., 2002)
10.2 ± 2.1 (fast phase)
P-450cam + 1R-camphor S– (cys) –19.6 ± 0.9 (slow phase) (Jung et al., 2002)
–13.2 ± 0.8 (slow phase)
P-450cam + norcamphor S– (cys) 7.6 ± 2.0 (fast phase) (Jung et al., 2002)
P-450cam + norbornane S– (cys) 8.4 ± 0.8 (fast phase) (Jung et al., 2002)
chloroperoxidase S– (cys) 1±2 (Lange et al., 1994)
lactoperoxidase N (his) –10 ± 3 (Lange et al., 1994)
Horseradish peroxidase N (his) –24 (Balny and Travers, 1989)
myoglobin N (his) –9 (Hasinoff, 1974)
–18.8 (Adachi and
Morishima, 1989)
hemoglobin N (his) –3 (Hasinoff, 1974)
–36 (Hasinoff, 1974)
 Protein Kinetics under High Pressure 13

activation volume for CO binding is rather indicative for solvent accessibility

and flexibility of the protein than for diffusion-controlled CO binding or for
the specific electronic structure of the thiolate proximal group.
With regard to the CO binding properties of cytochrome P450, it was
surprising that the closely related NOS did not show the same behaviour.
Indeed, using stopped-flow kinetic approach, Lange et al. (2001) ( pointed
out that the rate of CO binding was strongly decreased by the presence of
substrate. However, application of high pressure induced a strong increase
of the rate constant, up to a value similar to that in the absence of substrate.
In contrast, for cytochrome P450 BM3, a protein structurally homologous to
NOS, CO-binding to the heme iron was not affected by pressure, whether in
the absence or in the presence of substrate. Altogether, these observations
indicated that the substrate binding site in BM3 would be large and flexible
while that of NOS would be more rigid and narrow. Thus, the effect of
pressure could be attributed to an expulsion of substrate of the active centre
of NOS.
After instrumental optimization of the high pressure stopped-flow
apparatus and a very careful design of anaerobic experimental conditions,
it became possible to record oxygen binding kinetics under high pressure.

Figure 9. Effect of pressure on the rate of CO binding by BM3 (circles) and neuronal NOS
(triangles). High pressure stopped-flow kinetics were carried out at 25°C in the absence
(solid symbols) and in the presence of 100µM palmitate (open circles) with cytochrome
P450 BM3 and with NOS, in the presence of 200µM substrate, L-arginine (open triangles
up) or in the presence of both 200µM L-arginine and an excess of 25µM cofactor BH4
(open triangles down) for nNOS (Lange et al., 2001).
14 Comparative High Pressure Biology

Accordingly, Marchal et al., 2003 successfully investigated the kinetics of

CO and oxygen-binding to heme-thiolate proteins, the F393H mutant of
cytochrome P450 BM3 and the endothelial NOS under pressure. These
proteins were used as models because of their specific chemical properties,
the formation of a stable ferrous-oxy complex for the former and the absence
of a reductase domain for the latter, preventing the reduction of the
oxycomplex by electron transfer. For BM3, rates and activation volumes of
oxygen-binding matched the values measured for CO binding. In contrast,
these properties differed for NOS, suggesting different binding mechanisms
of CO and oxygen in NOS. Moreover, these results indicated that CO binding
does not seem to be an appropriate probe for studying oxygen-binding.
The analysis of the pressure dependence of the oxygen binding rates of
NOS revealed biphasic profiles. A closer analysis of these profiles, in the
presence of substrates, L-arginine and hydroxyl-arginine, and the cofactor
tetrahydropterin or its inactive analogs, led to interesting results which
could be interpreted by the transient formation of a new form of ferrous-
heme centre for NOS (see reviews (Gorren et al., 2005; Marchal et al., 2005)).
These results were corroborated in more recent rapid-scanning stopped-
flow experiments performed at low temperature (Marchal et al. 2004) which

Figure 10. Pressure-dependence of ligand binding to the ferrous heme centre of P450 BM3
(circles) and eNOSoxy (triangles). CO binding rates (solid symbols) and O2 binding rates
(open symbols) have been measured by rapid mixing of reduced proteins in the presence
of substrate (60µM arachidonate for BM3) and inactive cofactor (0.5mM L-arginine,
50µM amino-BH2 for eNOS) with 0.5mM CO and O2, respectively, in appropriate buffer
at pH 7.4 and at 4°C (Marchal et al., 2003).
 Protein Kinetics under High Pressure 15

showed that oxygen-binding to the reduced endothelial nitric oxide synthase

(eNOS) resulted in two distinct species differing in their Soret and visible
absorbance maxima, and in their capacity to exchange oxygen by CO.
Altogether, ligand-binding studies using high pressure which stopped
flow technology appears to be informative for the characterization of
elementary steps in the complex mechanism of several enzymatic systems.

PROTEIN FOLDING AND UNFOLDING

Protein folding/unfolding is a complex reaction that can be described

properly only in terms of multidimensional energy surfaces (Dill and Chan,
1997; Socci et al., 1998). Determining the path and rate of this reaction remains
a major experimental challenge. Nonetheless, there have been significant
advances in experimental techniques. Apart from computational
approaches, the p-jump method appears as an interesting tool. Over the
past 15 years, the pressure-jump induced relaxation kinetics has yielded
many significant insights in this research field, especially towards the
understanding of folding and unfolding mechanisms (Desai et al., 1999;
Font et al., 2006b; Herberhold et al., 2003; Mohana-Borges et al., 1999; Panick
et al., 1999; Panick and Winter, 2000; Pappenberger et al., 2000; Tan et al.,
2005; Torrent et al., 2006b; Vidugiris et al., 1995; Woenckhaus et al., 2001),
and the structure of folding transition states (Font et al., 2006a; Jacob et al.,
1999; Mitra et al., 2007; Perl et al., 2001).
The p-jump approach can be used to study both the unfolding reaction
(by upward p-jump—pressurization) and the folding reaction (by downward
p-jump—depressurization). These studies monitor the structural changes
through relaxation of the protein’s spectroscopic properties. The data
obtained, with a dead-time on the order of milliseconds, exhibit single- or
multiple-exponential time-decay profiles, showing, respectively, that proteins
can fold in a two-state process (between the native state and the unfolded
state) or in an scenario involving intermediate states.
Generally, protein folding and unfolding reactions are triggered by rapid
flow techniques, involving turbulent mixing with high concentrations of a
chemical denaturant, and by laser-induced temperature-jump (T-jump).
Although, the pressure-jump technique is used much less often, it offers
several advantages: (1) pressure propagates rapidly so that sample
inhomogeneity is a minor problem. (2) Pressure-jumps can be performed bi-
directionally, i.e., by upward and downward p-jumps of magnitude between
10 and 100 MPa. (3) In the case of fully reversible structural changes of the
sample, identical p-jumps can be repeated to allow for an averaging of the
data over several jumps. (4) Pressure allows the activation volumes for folding
and unfolding reactions to be determined, a parameter that informs about
the hydration of the transition state.
Another random document with
no related content on Scribd:
tulisivat toteutumaan, jäi kuin jäikin täyttämättä. Muutoin hallinnon
räikeimmät väärinkäytökset kyllä poistettiin ja järkevät ihmiset kyllä
huomasivat, että tällä tiellä vähitellen saatettaisiin päästä
kansallisten olojen uudistukseen.

Mutta tätä rauhallista kehitystä vastusti ja häiritsi eräs yltiöpäinen

joukkio, joka, ottaen ohjeensa ulkomailla oleskelevalta
pakolaiskunnalta, muodostui salaiseksi kumous-johtokunnaksi ja
vähitellen levitti vaikutuksensa kaikkiin maakuntiin. Kun sensuuri esti
kaiken vakaisen keskustelun maan valtiollisesta asemasta, oli
salaisten julkaisujen vaikutus, varsinkin kokemattomaan nuorisoon,
erinomaisen suuri, ja kypsyneempiäkin miehiä peloitti syytös
maanpetturiudesta, mikä leima painettiin jokaiseen, joka uskalsi olla
missään tekemisissä venäläisen hallituksen kanssa. Tarkoituksena
oli tehdä Venäläisille muka mahdottomaksi enää maata hallita ja
tahdottiin sen ohessa kääntää ulkomaiden huomiota Puolan
kärsimyksiin. Viimemainittua tarkoitusta varten pidettiin julkiset
mielen-osoitukset tärkeänä keinona. Jo kesällä 1860 pantiin toimeen
kansallinen mielen osoitus, kun erään v. 1831 kaatuneen kenraalin
leski haudattiin. Marrask. 29 p. koottiin Varsovan väestö Karmeliitta-
luostarin edustalla kirkolliseen juhlakulkueesen entisen kapinan
kolmenkymmenen-vuotiseksi muistoksi; veisattiin litaniioja ja jaettiin
Kosciusco'n muotokuvia, vaan ei mitään sen pahempaa tapahtunut.
Mutta seuraavana vuonna Helmik. 25 p. 1861 oli Grochov'in
tappelun vuosipäivä; kaatuneiden kunniaksi järjestettiin
suurenmoinen juhlakulkue litaniioineen. Silläkään kertaa, vaikka
poliisi vihdoin hajoitti väkijoukon, ei suurempaa onnettomuutta
tapahtunut, kuin että joitakuita henkilöitä otettiin kiini. Kaksi päivää
sen jälkeen pantiin toimeen uusi, vielä suurempi mielen-osoitus,
jonka näkyväisenä tarkoituksena oli vaatia, että toissa-päivänä
vangitut päästettäisiin vapaiksi, mutta varsinaisena silmämääränä oli
pakoittaa Maanviljelysseuran silloin vuosikokousta pitävät jäsenet
yhtymään kansalliseen liikkeesen. Joku yhteentörmäys näytti
välttämättömältä. Sotaväkeä oli asetettu suojelemaan sekä
Maanviljelysseuran kokous-salia että ruhtinas Gortshakov'in asuntoa
(entisessä kuninkaallisessa palatsissa). Erästä jalkaväen joukkoa,
joka kohtasi kulkuetta, tervehdittiin vihellyksillä ja viskatuilla kivillä; se
vastasi yhdellä kiväärinlaukauksella keskelle tiheätä ihmisjoukkoa,
josta viisi miestä ammuttiin kuoliaaksi. Näin oli ensimäinen
verenpisara vuodatettu. Maanviljelysseura heti lopetti kokouksensa
ja sen etevimmät jäsenet, kreivi Zamoiski etupäässä, lähtivät
ruhtinaan luo vaatimaan hyvitystä sotaväen väkivallasta aseetonta
väkijoukkoa vastaan. Samaa asiaa ajoi myöhemmin illalla eräs
porvariston lähetyskunta. Gortshakov oli varsin hämmästynyt ja jätti
järjestyksen hoidon eräälle porvariston valitsemalle valiokunnalle.
Maalisk. 1 p. koko kaupunki vietti suurimmalla hartaudella ja
mallikelpoisessa järjestyksessä kaatuneiden hautajaiset. Samaan
aikaan valmistettiin Maanviljelysseurassa keisarille lähetettävä
adressi, joka karkeassa muodossa, mutta aivan ylimalkaisesti, esitti
maan ja kansan kärsimyksiä. Se oli protesti, eikä mikään anomus.

Tällä hetkellä astui näyttämölle eräs Puolan ylimyskuntaan

kuuluva mies, joka pitkät aiat oli mielessään kypsyttänyt täydellisen
ohjelman isänmaansa uudistamista varten laillisten ja rauhallisten
keinojen kautta. Se oli markiisi Aleksanteri Wielopolski, syntynyt v.
1803 ja niinmuodoin tähän aikaan 58 vuoden vanha. Valtiollista
kokemusta häneltä ei kokonaan puuttunut. Loppuvuodella 1830 hän
oli silloisen väliaikaisen hallituksen asiamiehenä lähetetty Lontoosen
ja siellä saanut muutamien kuukausien kuluessa tarpeeksi kokea,
kuinka vähän läntiset suurvallat olivat taipuvaisia tekemään
minkäänlaisia uhrauksia Puolan tähden. Saatuaan sitten kapinan
kukistumisen jälkeen palata maatiloilleen läntisessä Puolassa, hän
oli käyttänyt aikaansa alustalaistensa hoitoon ja tieteellisiin
harrastuksiin. Valtiollisiin toimiin ei ollut siihen aikaan mitään
tilaisuutta. Mutta nuo v. 1846 Itävallan hallituksen myötävaikutuksella
tapahtuneet hirmuteot puolalaisia herroja vastaan itäisessä
Galitsiassa antoivat aihetta ankaraan kirjeesen ruhtinas
Metternich'ille, joka julkaisu painettiin Pariisissa samana vuonna.
Tässä lausuttiin suoraan, että Puolan kansan tulevaisuus oli etsittävä
sovinnollisessa yhteis-elämässä Venäjän samansukuisen kansan
kanssa. Ajatus ei ollut ihka uusi; jo Adam Czartoryski
nuoruudessaan oli Aleksanteri I:n ystävänä tätä ohjelmaa, ainakin
käytännössä, tunnustanut. Mutta se suunta, joka par'aikaa pyrki
yleistä mielipidettä vallitsemaan, ajoi ihan toisia tarkoituksia: ei
mitään alistumista, vaan Puolan entinen itsenäisyys ja sen entiset
rajat Dnieperiin asti. Se adressi keisarille, minkä Wielopolski oli
Maanviljelysseuran vuosikokoukselle ehdottanut, oli hylätty juuri siitä
syystä, että se muka oli liian alamainen, liian vähän vaativainen.

Kaksi eri ohjelmaa oli niinmuodoin olemassa Puolan olojen

uudistusta varten Aleksanteri II:n vapaamielisten taipumusten
perusteella: toinen, joka ei luullut voivansa tyytyä vähempään kuin
Puolan entiseen riippumattomuuteen ja suuruuteen; toinen, joka ei
vaatinut muuta kuin hallinnollista itsenäisyyttä ja olojen vähittäistä
kehitystä. Näiden suuntien välillä alkoi taistelu, josta maan ja kansan
koko tulevaisuus tuli riippumaan.
VI.

MARKIISI WIELOPOLSKI'N UUDISTUSPUUHAT.

Maalisk. 6 p. oli Wielopolski kutsuttu ruhtinas Gortshakov'in

puheille, antamaan neuvoja, mitenkä maan oloja pitäisi parantaa.
Hänen ensimäinen ehdotuksensa oli, että 1815 vuoden
hallitusmuoto edustuslaitoksineen olisi jälleen pantava voimaan:
mutta siitä täytyi toistaiseksi luopua, koska huomautettiin
mahdottomaksi, että keisari nykyhetkellä myöntäisi Puolalaisille, mitä
ei keisarikunnalla vielä ollut. Markiisi tämän johdosta laski pääpainon
kuningaskunnan hallinnolliseen itsenäisyyteen ja lupasi astua
hallituskuntaan, jos muutamat pääehdot täytettäisiin. Ehdotus, vähän
supistettuna, lähetettiin Pietariin ja kärsi siellä vielä melkoisia
supistuksia. Päätettiin asettaa eräs valtioneuvosto, kokoonkutsuttava
kerta vuodessa ja kokoonpantuna hallituksen nimittämistä etevistä
kotimaisista miehistä. Opetus- ja kirkollisten asiain järjestämistä
varten oli asetettava erinäinen toimituskunta, jonka päälliköksi
määrättiin Wielopolski; koululaitos oli täydellisesti uudistettava ja
yliopiston verosta, minkä Wielopolski oli ehdottanut, piti
järjestettämän eri tiedekunnat "korkeakouluiksi". Vihdoin piti
lääneissä ja piirikunnissa järjestettämän neuvostoja paikallisten
asiain hoitoa varten. Tämä oli tosin ainoastaan pientä alkua suotaviin
uudistuksiin. Mutta Wielopolski, joka toivoi, että tätä tietä vähitellen
päästäisiin tarkoittamillensa perille, otti vastaan tarjotun
luottamustoimen Maalisk. 27 p.

Sillä välin oli mielten tila sekä pääkaupungissa että maaseuduilla

melkoisesti pahentunut. Uskonnollisvaltiolliset mielen-osoitukset
kirkoissa ja kaduilla, surupukuineen litaniioineen, yhä jatkuivat.
Kymmentä päivää aikaisemmin Muchanov sisä-asiain päällikkönä oli
uudistanut erään vanhan salaisen kiertokirjeen, joka käski
kruununpalvelijain kehoittaa talonpoikia pitämään silmällä maalla
liikkuvia yllyttäjiä. Asia tuli pian yleisesti tunnetuksi ja synnytti paljon
mielipahaa; syytettiin hallitusta tarkoituksesta yllyttää alustalaiset
aatelisia isäntiä vastaan. Ruhtinas Gortshakov teki parastaan
korjatakseen tämän erehdyksen, ja Muchanov sai eron virastansa.
Mutta asia vielä paheni, kun Maanviljelysseuran valiokunta Maalisk.
20 p. antoi vastajulistuksen, joka seuran asiamiesten kautta levitettiin
kirkoissa luettavaksi. Siinä opetettiin, että Maanviljelysseura jo oli
aateliston yhteisellä suostumuksella päättänyt, että alustalaisten
päivätyöt olivat suorastaan lakkautettavat ja maiden lunastus
tapahtuva jollakin finansi-operatsioonilla, jonka laatua ei ilmoitettu,
eikä voitukaan ilmoittaa, kosk'ei sitä vielä keksitty. Itse teossa oli
Maanviljelysseura tällä tavoin anastanut päätösvallan, johon
välttämättömästi tarvittiin valtion välitystä.

Markiisi katsoi asianmukaiseksi, että talonpoikaiskysymyksen

ratkaisu pysyisi hallituksen käsissä ja kutsui seuran jäsenistä
erinäisen komissionin asiata pohtimaan. Mutta samassa hän sai
ruhtinas Gortshakov'in suostumuksen siihen, että itse
Maanviljelysseura Huhtik. 5 p. lakkautettiin. Tämä toimenpide, vaikka
itsessään aivan oikeutettu, koska Seuralta puuttui sekä kyky että
valta säätämään lakia, oli, mielissä vallitsevaan kiihtymykseen
nähden, sillä hetkellä kovin varomaton. Tätä tilaisuutta oli
kumouspuolue kärkäs käyttämään hyväksensä. Jo Huhtik. 7 p.
pantiin toimeen suuret mielenosoitukset Maanviljelysseuran
valiokunnan ja kreivi Zamoiski'n kunniaksi. Kuninkaallisen linnan
edustalla oli sotaväkeä. Ruhtinas Gortshakov meni itse väkijoukon
sekaan, kehoittaen ihmisiä lähtemään hajalle, ett'ei täytyisi ryhtyä
ankarimpiin keinoihin. Hänelle vastattiin karkeasti: me olemme täällä
kotosalla, teidän on asia lähteä tiehenne. Kuitenkin väkijoukko hajosi
sillä kertaa. Mutta seuraavana päivänä, sunnuntaina Huhtik. 8 p.,
saatiin vielä suuremmat joukot liikkeelle. Komppaniia jalkaväkeä,
santarmien ja kasakkain avustamana, pantiin katua puhdistamaan.
Hajoomiskehoitukseen vastattiin viskatuilla kivillä ja haloilla; vihdoin
sotaväki sai käskyn ampua: kymmenen henkeä saivat surmansa ja
noin satakunta tuli haavoitetuksi. Joukko lankesi polvilleen, veisaten
litaniioja, ja saatiin ainoastaan vaivalla hajoomaan, sitten kun 70
pahimmista yllyttäjistä oli vangittu.

Tämmöisten surullisten tapausten estämiseksi julkaistiin heti

asetus, joka kielsi väenkokoontumisia kaduilla ja toreilla; se oli sen
puolesta erittäin kiitettävä sääntö, että rikokset sitä vastaan siirrettiin
sotilasoikeuksien piiristä tavallisten tuomio-istuinten tuomittaviksi.
Mutta vastustus alkoi levitä itse virkamies-piireihin; sisäasiain
päällikkö luopui virastansa ja Wielopolski'n täytyi ottaa tämäkin ala
hoitoonsa. Mielenosoitukset kaduilla kyllä lakkasivat; mutta kirkoissa
jatkettiin papiston myötävaikutuksella entistä kiihoittavaa menoa.
Kouluissakin kurittomuus nousi korkeimmilleen ja maaseuduilla
salaisen johdon valta järjestyi säännölliseksi pakkovallaksi, joka
peloituksilla ja häväistyksillä ajoi maltilliset ainekset joko
vaikenemaan tai liikkeesen yhtymään. Tuo salainen valta oli
järjestetty suurella taidolla; pitkin maakuntia asiamiehet ryhmitettiin
satakuntiin ja kymmenkuntiin, joiden kunkin jäsenet eivät tunteneet
kuin lähimmän päällikkönsä.

Hallituksen lainlaatimus-toimet edistyivät jotenkin nopeasti

myönnettyjen parannuksien perusteella. Jo Toukok. 16 p. 1861
ilmestyi laki päivätöiden muuttamisesta vastaavaksi rahaveroksi,
tulevasta Lokakuusta alkaen. Maanviljelysseura oli, kuten näimme,
tahtonut lakkauttaa päivätyöt ilman korvauksetta, jonka tähden tämä
nyt säädetty kohtuullinen menettelytapa ei saavuttanut "yleisen
mielipiteen" hyväksymistä. Kesäk. 5 p. julkaistiin asetus
perustettavasta valtioneuvostosta; sekään ei voinut tyydyttää, koska
se ei ollut kansan valitsemaa eduskuntaa eikä sen valta ollut muu
kuin neuvoa-antavainen. Mutta unohdettiin taikka ei tahdottu tietää,
että tämä oli vain alkua parempaan. Myöskin opetus-olojen ja
kirkollisten parannusten järjestämisessä Wielopolski kohtasi alituista
vastahankaa.

Näillä aioin tapahtui sekä hänelle että koko maalle se

korvaamaton onnettomuus, että Puolan ylimmäinen hallitusmies, tuo
sävyisä ja oloihin jo perehtynyt ruhtinas Mikael Gortshakov
Toukokuun lopussa kuoli. Pietarissa oltiin Puolan oloista kovin
epäilevällä kannalla. Ensi aluksi lähetettiin Gortshakov'in seuraajaksi
eräs kenraali Sukhozanet, entinen sotaministeri, joka tahdottiin
kunniallisella tavalla siitä virasta poistaa. Tämän miehen
mielivaltainen luonne uhkasi koko aseman pilata; sotaoikeudet
ryhtyivät taas täyteen toimeen ja ihmisiä vietiin muitta mutkitta
Siperiaan. Wielopolski, joka ei voinut tähän hallitustapaan suostua,
vaati eronsa. Mutta koska eräs kreivi Lambert jo oli määrätty maan
ylimmäiseksi käskynhaltiaksi, käskettiin markiisin pysyä asemillaan,
kunnes tämä olisi saapunut.
 Kreivi Charles Lambert, sukuperältään ranskalainen, oli kyllä
kunnon mies, varsin hyvänsävyinen, mutta jotenkin heikko sekä
luonteeltaan että terveydeltänsä. Kuunneltuaan ensin vastustus-
puolueen kuiskauksia, hän lopulta, kun epäjärjestykset joka haaralta
karttuivat, julisti koko maan piiritystilaan.

Salaisen hallituksen ohjelmana oli nyt toimeenpanna muistojuhlia,

joilla kiihko Warsovassa ja maaseuduilla pidettiin vireillä ja Venäläisiä
pyydettiin ärsyttää. Elokuun keskipalkoilla oli juhlaa vietetty Puolan ja
Litvan yhdistymisestä v. 1569. Litvassa olevat Puolalaiset tietysti
yhtyivät tähän liikkeesen ja sekä Vilnassa että Kovnossa tapahtui
yhteentörmäyksiä, joissa verta vuoti. Vähäistä myöhemmin juhlittiin
Dubienkan v. 1792 tapahtuneen tappelun muistoksi. Lokak. 10 p.
taas järjestettiin Horodlossa Bug'in varrella lähellä Lublin'iä suuri
valtiollis-kirkollinen juhlallisuus muka Volhynian ja Podolian
yhdistymisen muistoksi v. 1413; ainoastaan venäläisen sotapäällikön
maltti esti verenvuodatusta. Pahempia seurauksia aiheutui
surujuhlasta Kosiuscon kunniaksi Varsovassa Lokak. 16 p. Itse
tuomiokirkossa veisattiin kapinallisia lauluja ja kun tätä jatkettiin läpi
yön aamuun asti, ajettiin viimein väkijoukko poliisivoimalla ulos.
Mutta papisto otti tästä aiheen sulkeakseen kaikki kaupungin kirkot,
koska muka pyhiä paikkoja oli häväisty. Silloin kreivi Lambert, jonka
ruumiillisetkin voimat olivat lopussa, sai pyynnöstään eron, ja
kenraali Sukhozanet sai taas väliaikaisesti hallitus-ohjat.

Näissä sekavissa oloissa Wielopolski'n valmistamat uudistukset

eivät voineet edistyä niin nopeasti kuin suotavaa olisi ollut.
Valtioneuvosto oli kuitenkin kokoontunut. Laki-ehdotukset
opetuslaitoksista ja alustalaisten oikeudesta lunastaa tilojaan olivat
valmiina. Samoin oli saatu suoritetuksi uusi lain-ehdotus Juutalaisten
yhteiskunnallisista oikeuksista, asia joka Puolassa oli erittäin tärkeä,
koska melkein koko kauppasääty oli Mooseksen uskolaisia. Mutta
Sukhozanet'in ja Wielopolski'n välillä virisi erimielisyys
korkeimmilleen. Markiisi tahtoi erota, mutta kutsuttiin Marraskuun
alussa Pietariin ja viivytettiin siellä kahdeksatta kuukautta, sill'aikaa
kuin hänen laki-ehdotuksiansa keisarin lähisyydessä monipuolisesti
tarkasteltiin.

Viikko sen jälkeen kuin Wielopolski oli lähtenyt, Sukhozanet

eroitettiin virasta, ja sijaan lähetettiin kenraali Aleksanteri Lüders,
eräs 71 vuoden vanha virkeä ukko, joka oli sota-asioissa kyllä
kokenut, mutta hallintotoimista kovin vähän huvitettu. Tästä oli
seurauksena, että Lüders'in venäläinen kanslia anasti haltuunsa
tärkeimmät asiat ja koko siviilihallinto joutui rappiolle. Toiselta puolen
piiritystila antoi tilaisuutta pahimpaan mielivaltaan ja
väärinkäytökseen. Tätä kaikkea kumouspuolue käytti eduksensa,
eikä kauan viipynyt, ennen kuin tuo salainen hallitus, kuleksivain
kiihottajainsa ja kiertokirjeidensä kautta harjoitti todellisempaa valtaa
kuin virallinen hallitus. "Passiivinen vastarinta", kuten sitä nimitettiin,
alkoi jo kehittyä väkivaltaiseen muotoon. Kun Tammikuussa 1862
uusi arkkipiispa Felinski jälleen oli avannut Varsovan kirkot, alkoivat
niissä mielen-osoitukset uudestaan.

Näin tuo kuumeentapainen tila, joka piti mielet levottomassa

jännityksessä, jatkui talven läpitse ja pitkin kevättä 1862. Syy ei ollut
yksistään noissa kapinaa tarkoittavissa yllytyksissä, vaan yhtä paljon
Venäjän hallituksen epäröivissä toimenpiteissä, jotka järkähyttivät
luottamuksen luvattuihin parannuksiin. Alituiset vaihdot
korkeimmassa käskynhaltiudessa ja kahnaukset siviilihallinnon ja
sotilaskomennon kesken vaikuttivat, ett'ei mitään vakaantunutta
ohjelmaa voitu noudattaa. Itse Pietarissa, keisarin läheisyydessä,
oltiin kauan aikaa erimielisiä siitä, mikä määrä itsehallintoa sopisi
Puolan kuningaskunnalle myöntää. Ylipäänsä yleinen mielipide
Venäjällä oli Puolalaisille varsin suopea, mutta vanhan järjestelmän
miehet, joilla vielä oli paljon vaikutusvaltaa, pyrkivät miten
mahdollista supistamaan tai ainakin hidastuttamaan luvattuja
uudistustoimia ja saattoivat vastahankansa perusteeksi esiintuoda
sekä Puolalaisten vanhastaan tunnettua epäluotettavuutta että
maassa yhä yltyvää kiihkotilaa. Samalla kertaa sekä Preussi että
Itävalta, joilla kumpaisellakin oli kappaleita Puolan kansallisuutta
hallussaan, eivät suinkaan suopein silmin katsoneet uusien olojen
syntymistä kuningaskunnassa.

Vihdoin viimeinkin oli kumminkin markiisi Wielopolskin onnistunut

maltillisella ja luottamusta herättävällä käytöksellään päästä
Pietarissa tarkoitustensa perille. Päätettiin korkeimmassa paikassa,
että Puolan sisällinen hallinto oli kokonaan eroitettava keisarikunnan
viranomaisista, että keisarin edusmieheksi Varsovassa oli asetettava
Aleksanteri II:n veli, Suuriruhtinas Konstantino Nikolajevitsh, että
piiritystila oli vähitellen lakkautettava ja siviili-oikeuslaitos siis
pantava voimaansa, ja että siviilihallinnon päälliköksi oli asetettava
näiden uudistusten alkuunpanija markiisi Wielopolski. Tämä uusi
hallitusmuoto oli epäilemättä vähemmin loistava kuin se, minkä
Aleksanteri I v. 1815 oli Puolan kuningaskunnalle lahjoittanut; muun
muassa puuttui varsinaista kansan-edustusta, koska hallituksen
asettama Valtioneuvosto harjoitti ainoastaan neuvon-antamisen ja
anomisen valtaa. Mutta tällä hetkellä ei sopinutkaan laveampaa
itsehallintoa pyytää. Koko hallintokoneisto oli kumminkin uskottava
puolalaisten kansalaisten omiin käsiin, ja erinäiseksi suosion-
osoitukseksi oli katsottava jalon ja hyväntahtoisen Konstantinon
nimitys hallitsijan paikalliseksi edusmieheksi.
 Kesäk. 14 p. 1862 Wielopolski saapui Varsovaan, ryhtyäkseen
uuden virkansa toimiin. Hän heti kääntyi maan etevimpien miesten
puoleen, saadakseen heidän isänmaallista myötävaikutustaan. Mutta
häntä vastaanotettiin ylipäänsä varsin kylmästi. Aateliston
johtomiehet, etupäässä Andreas Zamoiski, eivät voineet sulattaa,
että Maanviljelysseura oli lakkautettu, ja pysyivät itsepintaisesti
uudistustointen ulkopuolella. Kumouspuolue vielä jyrkemmin vastusti
kaikkia parannuksia jo senkin vuoksi, että ne olivat Venäläisten
myöntämiä. Paitsi sitä asetettiin ehtoja, joista hyvin tiedettiin, ett'ei
keisari paraimmallakaan tahdolla olisi voinut, Venäläisten
kansallistuntoa loukkaamatta, niihin myöntyä. Wielopolskille luettiin
viaksi, ett'ei hän saanut toimeen Litvan ja Länsi-Venäjän
yhdistämistä Puolaan. Tämä järjetön vaatimus rikkoi kaikki sovinnon
mahdollisuudet. Kun salainen valta kumminkin pelkäsi, että
Wielopolski'n järjestelmä pääsisi mielissä voitolle, ryhdyttiin taas
väkivaltaisiin toimiin ja uusi hämmingin aika alkoi.
VIII.

SALAMURHAN-YRITYKSET. ILMI-KAPINA v. 1863.

Kesäk. 27 p., muutamia päiviä ennen kuin Suuriruhtinas oli

saapunut, tehtiin murhan-yritys kenraali Lüders'iä vastaan. Itse
Suuriruhtinasta aiottiin murhata rautatie-asemalla, hänen
saapuessaan puolisonsa kanssa, ja Heinäk. 3 p. tehtiinkin häntä
vastaan murhanyritys, joka ei kuitenkaan onnistunut. Kuukautta
myöhemmin Wielopolski'a vastaan yritettiin samanlaista rikosta.
Kolme rikoksen-tekijää tuomittiin kuolemaan ja hirtettiin. Mutta
salainen keskushallitus julisti heidät marttiiroiksi, käskien pitää
julkisia rukouksia heidän edestänsä, ja pääkaupungin hienottaret
kunnioittivat näiden muka isänmaallisten miesten muistoa.
Tarkastukset, jotka murhan-yritysten johdosta pantiin toimeen ja
joissa 66 salaisen hallituksen jäsenistä otettiin kiinni, saattoi myöskin
ilmi salaliiton ohjesäännöt. Tämä asiakirja ei enää sallinut epäilystä
siitä, että tuo "Kansallinen keskuskomitea", kuten se itseänsä nimitti,
tarkoitti ja valmisti yleistä kapinaa, että se sitä varten kokosi aseita ja
keräsi rahavaroja, että sen aikomuksena oli itse Venäjänmaallakin
yllyttää tyytymättömät ainekset yhteistä vihollista, s.o. Venäjän
hallitusta vastaan. Näihin paljastuksiin "Keskuskomitea" vastasi
(Syysk. 1 p.) ilmoittamalla, että se juuri katsoikin itseänsä kansan
todelliseksi ja lailliseksi hallitukseksi. Yleinen mielipide maassa
nähtävästi ei ollut pahantekijäin puolella; päinvastoin kauhistus ja
mielipaha näkyy olleen maaseuduilla varsin suuri, ja suuriruhtinaan
julistus Elok. 27 p., joka vetosi Puolalaisten isänmaan-rakkauteen
ilkitöiden ehkäisemiseksi, kohtasi paljon myötätuntoisuutta. Mutta
yleinen mielipide oli yleensä heikko ja helposti eksytetty. Aateliston
joukossa oli kyllä maltillista osaa, joka oivalsi, mihin tämä hurja meno
lopulta veisi. Niinpä Syyskuun alussa noin 300 aatelismiestä
kokoontuivat Varsovaan. Alkuperäinen tarkoitus oli erinäisessä
adressissa kääntyä Suuriruhtinaan puoleen, lausumalla rehellisten
ihmisten inhoa siitä, mitä oli tapahtunut. Mutta kun ei sovittu
sisällyksestä ja kun ei kreivi Zamoiski tahtonut yhtyä tähän mielen-
osoitukseen, jäi yritys sillensä. Sen sijaan allekirjoitettiin Syysk. 11 p.
kreivin luona eräs hänelle osoitettu kirjelmä, jossa kokoontuneet
pyysivät häntä esittämään Hänen Keisarilliselle Korkeudelleen
kansan tarpeita ja vaatimuksia. Mutta näin muodostuneena kirjelmä
pääasiallisesti muuttui valituskirjaksi, jossa vanhat ja uudet
kärsimykset lueteltiin ja sovinnollista mieltä tuskin nimeksikään tuli
näkyviin. Päinvastoin kirjelmän viimeiset lauseet katkaisivat kaikki
sovinnon mahdollisuudet. Ne kuuluivat:

"Puolalaisina emme voi hallitusta kannattaa, ellei tämä hallitus tule

puolalaiseksi ja ellei kaikki ne maakunnat, jotka muodostavat
isänmaamme, tule yhteenliitettäviksi ja nauttimaan perustuslaillista
hallitusmuotoa ja vapaita laitoksia."

"Julistuksessaan Suuriruhtinas itse on käsittänyt ja kunnioituksella

maininnut rakkautemme isänmaahan; mutta tätä rakkautta ei voida
ositella; jos rakastamme isänmaatamme, sitä rakastamme
kokonaisuudessaan niissä rajoissa, mitkä Jumala on sille antanut ja
historia vahvistanut."

Nämä sointuvat lauselmat selvästi ilmoittivat, ett'ei mitään sovintoa

voisi syntyä, ennen kuin kaikki ne alat, joissa Puola muinoin oli
hallinnut litvalaisen ja pikkuvenäläisen väestön yli, jälleen siihen
yhdistettäisiin. Sananmukaisesti näytti siinä olevan sekin vaatimus,
että vielä Posenin ja Galitsian maat pitäisi Venäjän keisarin toimesta
takaisin hankittaman. Näytti todellakin siltä, että Puolan aatelisherrat
eivät olleet historiasta mitään oppineet.

Tämä surullinen käänne asiassa on epäilemättä luettava kreivi

Andreas Zamoiski'n syyksi. Asemansa ja nauttimansa arvon kautta
hän yksin olisi voinut johtaa olot sovinnollisille perille. Mutta hän ei
ollut se mies, joka olisi pannut kansan-suosiotansa alttiiksi kansan
pelastamiseksi, ja näin hän joutui muiden johdettavaksi. Kohta sen
jälkeen hän sai käskyn lähteä Pietariin, tekemään keisarille selkoa
kannastansa. Hän ei noudattanut käskyä, vaan matkusti sen sijaan
Pariisiin, jossa niin muodoin yhtyi tuohon Puolan kansalle niin paljon
vahinkoa jo tehneesen pakolaiskuntaan.

Yleinen asema oli todellakin kummallinen. Wielopolski'n

väsymättömällä toimella uudistuspuuhat edistyivät hyvin.
Alustalaismaiden arvaus lunastusta varten kulki tasaista menoaan.
Koululaitoksen uudistus edistyi erittäin nopeasti; kolmenkymmenen-
vuotisen lakkautuksen perästä Varsovan yliopisto syntyi uudestaan
ja sai opettajakunnan, etevämmän kuin mitä oli toivottukaan. Uusia
lakiehdotuksia oli yhä tekeillä: rikoslaki oli uudistettava, samoin
kunnallis-asetus, Puolan pankin ohjesääntö, jonka ohessa uusi
maanviljelys-pankki oli perustettava alustalaismaiden lunastamista
varten, y.m. Toiselta puolen oli kumouspuolueen vastahanka jo
käynyt aivan julkiseksi. Lokakuussa 1862 "Kansallinen
keskuskomitea" vaati aatelistolta kansallisen veron. Sen valtaa
melkein tunnustettiin lailliseksi, ja sen kuolemantuomiot, jotka
"jumalallisen koston enkelit" s.o. keskuskomitean hirttäjä-santarmit
panivat täytäntöön, katsottiin luonnolliseksi vallanharjoitukseksi.
Kaikkialla ja kaikissa kansanluokissa oli se ajatus jo juurtuneena,
että ennen tai myöhemmin yleinen kapina oli nostettava. Mutta
enimmältään, jopa itse keskuskomitean johtomiehissäkin, oli se
käsitys vallalla, että valmistukset vielä olivat keskentekoisia ja että
toimeenpano oli lykättävä soveliaampaan aikaan. Myöskin
Pariisilainen pakolaiskunta kehoitti malttiin ja varovaisuuteen, koska
eurooppalaiset valtio-olot eivät tuntuneet lupaavan kapinalle mitään
todellista kannatusta.

Vaan erinäinen seikka ajoi nämä viivytystuumat tyhjiin. Oli jo

kesällä keisarikunnan sotaministeri vaatinut, että Puolanmaasta, joka
useita vuosia oli saanut olla sotaväen-otosta vapaana, piti ensi
tilassa otettaman suhteellinen rekryytti-määrä valtakunnan
sotaväkeen. Uuden asevelvollisuus-lain mukaan olisi palvelukseen
ottaminen ollut määrättävä arvan mukaan. Mutta erinäisistä syistä
säädettiin, että tällä kerralla tilanhaltijat ja koko maanviljelys-luokka
oli vapautettava, ja että irtaimesta väestä ja kaupunkien levottomasta
nuorisosta piti otettaman keitä vain käsiin saatiin. Tunnustettuna
tarkoituksena tällä mielivaltaisella toimella oli riistää
kumouspuolueelta sen varsinaiset liikevoimat. Näin suunniteltuna
rekryytin-otto tapahtuikin aamu-yöstä Tammik. 15 p. 1863.
Keskuskomitea oli pitänyt huolta siitä, että melkoiset joukot
otettavista olivat edellisinä päivinä päässeet Varsovasta
pakenemaan joko ulkomaille tai maaseuduille; mutta aseelliseen
vastarintaan ei ollut silloin vielä aikomus ryhtyä. Asia kuitenkin
päättyi toisin. Keskuskomitean johtomiehet eivät enää voineet hillitä
niitä intohimoja, joita se oli virittänyt. Yöllä Tammik. 17 ja 18 p. välillä
se pakoitettiin julistamaan yleisen noston alkavaksi yöllä 23 päivää
vastaan. Jo 18 p. ilmestyi ensimäinen sissiparvi Kampinos-
metsässä, pohjoisessa Varsovasta. Arpa, koko Puolan kansalle
onneton arpa, oli siis langennut.

Itse asiassa kapinan-nosto tällä hetkellä oli hurjinta hulluutta; sillä,

vaikka salaliiton järjestelmä sinänsä oli suurella taidolla kehitetty,
puuttui liikkeeltä todellisen sodankäynnin ensimäiset ehdot: joltinen
varasto aseita sekä sotataitoisia päälliköitä, jotka olisivat osanneet
harjoitella noita tarjoutuvia vapaaehtoisia välttämättömiin temppuihin.
Kuinka toisenlaisilla toiveilla oli alkanut 1831 vuoden kapina, jonka
sydämmenä oli valmis kansallinen armeija kokeneiden kenraalien
johdon alla. Mitään yhteistä johtoa ei tässä voinut olla, ja nuo
hajanaiset sissijoukot, jos kohta jokuinen niistä nousikin 3000:een
mieheen, olisivat olleet muutamassa viikossa hävitetyt, ellei
venäläinen sotakomento olisi noudattanut mitä takaperoisinta
taktiikkaa. Vastoin Suuriruhtinaan mielipidettä ja Wielopolski'n
neuvoa, ko'ottiin sotaneuvoston käskyn mukaan tuo 83,000:een
mieheen nouseva venäläinen varusväki muutamiin strateegillisiin
pääpaikkoihin, ikäänkuin olisi oltu tekemisessä vahvan
vihollisvoiman kanssa. Seurauksena oli, että yleensä maaseutu ja
pienemmät kaupungit jäivät kapinoitsijain valtaan ja itse väestö, jota
ei hallitus osannut suojella, käsitti kapinan tunnustetuksi
sodankäynnin muodoksi. Vielä tärkeämpi etu kapinoitsijoille oli
ulkomaisten rajain paljastaminen, joten saattoivat etenkin Galitsiasta
täydentää asetarpeitansa ja muita puutteita. Sillä tavoin kapina sai
jatkua ja voimistuakkin, sill’aikaa kuin venäläinen pääkomentaja,
Suomesta kotoperäinen parooni Ramsay, osoitti varsin vähän
pontevuutta sotatointen johdossa.
 Kevään tullen ulkomaiset vallat alkoivat sekaantua asiaan.
Huhtikuun alkupuolella Ranska, Englanti ja Itävalta lähettivät
Pietariin yhteisen kirjelmän, jossa moittivat Venäjän hallitusta
Puolassa suunniteltujen uudistusten riittämättömyydestä. Samaan
aikaan oli keisari erinäisellä julistuksella tarjonnut kapinallisille
anteeksi-antamusta, jos he kuukauden kuluessa heittäisivät
aseensa; hän sen ohessa lupasi vielä pitää voimassa alkuun-
panemansa parannukset maan sisällisessä hallinnossa sekä ne
"kehittää aian ja kansan tarpeiden mukaan". Nämä sovinnon alkeet
nyt turmeli ulkovaltain esiintyminen. Puolalaiset eivät voineet muuta
uskoa, kuin että aseellinen apu oli odotettavissa, jos vastarinta
jatkuisi ja tulisi yhä yleisemmäksi. Pariisilaisen pakolaiskunnan
kehoituksesta useat valtioneuvoston jäsenistä jo luopuivat ja
Wielopolski'n johtama siviili-hallitus kohtasi yhä enemmän
vaikeuksia. Itse Suuriruhtinas Konstantino, jonka seurapiirissä
Varsovan ylimysnaiset jo kauan aikaa olivat kuiskanneet epäluuloja
Wielopolski'a vastaan, ei enää ollut varmalla kannalla asiain
tarkoituksen-mukaisen johdon suhteen. Sota-toimissa tosin tuli
parempi järjestys, kun Ramsay'n sijaan jo Huhtikuun alulla tuli tuo
Suomessa hyvin tunnettu, entinen kenraalikuvernööri, kreivi Fredrik
Wilhelmi Berg, iältään lähes 70-vuotias ja ulkomuodolta jo kuihtunut
vanhus, joka kuitenkin oli säilyttänyt kaikki henkiset voimansa ja
sukkelan kekseliäisyytensä. Mutta kreivi Berg ei myöskään ollut
taipuvainen kannattamaan sitä itsenäistä siviilihallintoa, joka
tavallaan oli esteenä kapinan kukistamiselle. Näin Wielopolski'n
asema tuli yhä enemmän mahdottomaksi. Kesällä hän vihdoin anoi
virkavapautta ja matkusti Berlin'iin, terveyttänsä hoitamaan.
Syyskuussa Suurruhtinas kutsuttiin pois Varsovasta ja samaan
aikaan Wielopolski sai lopullisesti eron virastansa. Koko valta, sekä
siviilihallinto että sotakomento, jäi kreivi Berg'in haltuun.
 Kapinallisten sotatoimet eivät olleet muuta kuin säännöttömien
partiojoukkojen hajanaisia yrityksiä, joissa epäilemättä osoitettiin
suurta uroutta, mutta kokonaisjohtoa puuttui. Tosin jo Maaliskuussa
eräs Langievitsh oli anastanut diktaattori-vallan, mutta ennen pitkää
hän tungettiin Galitsian puolelle, jossa Itävaltalaiset ottivat hänet
talteensa. Useat muut päällikkönimet mainittiin taistelujen ohessa:
Frankovski, Padlevski, Bogdanovitsh, ranskalainen Rochebrune,
vieläpä eräs nainen neiti Pustovojova, y.m. Mutta näiden hajanaiset
urostyöt eivät voineet toivottua tulosta tuottaa, kun ei mikään
varsinainen armeija niitä kannattanut. Itse "keskuskomitea", joka nyt
otti nimen "kansalliskomitea" ja sinetissään käytti Puolan, Litvan ja
Ruthenian vaakunat, oli alituisten sisällisten vallankumousten
alaisena eikä lopulta muuta toiminut kuin salamurhan tuomioita ja
niiden täytäntöönpanoa kätyriensä kautta. Venäläinen sotaväki taas,
ärsytettynä sissijoukkojen päällekarkauksista, harjoitti monessa
paikoin julmaa kostoa. Kaikki yhteiskunnallinen järjestys oli
kerrassaan loppunut.

Tällä välin oli yleisessä mielipiteessä itse Venäjänmaalla

tapahtunut suuri muutos Puolan suhteen. Niinkuin jo olemme
maininneet, Puolan hallinnollinen itsenäisyys herätti ensi aluksi
Venäjällä paljon myötätuntoisuutta. Mutta Puolalaisten osoittama
vihamielisyys ja olletikkin ulkovaltain uhkaukset vaikuttivat käänteen
yleisessä mielipiteessä. Vanhat muistot 1812 vuoden taistelusta
Napoleoni I:stä vastaan virisivät uudestaan ja kaikista keisarikunnan
osista tulvasi uskollisuuteen vakuutuksia keisarille. Sanomalehdistö,
olletikkin Moskovskija Viedomosti, yllytti tämän kansallisen kiihon
äärimmälleen. Ensi aluksi keisarillinen hallitus ei tahtonut muuttaa
suunnitelmaansa kuningaskunnan suhteen. Vielä Toukokuun
keskipaikoilla oli sisä-asiain päälliköksi Varsovassa nimitetty
puolalainen ylimys, kreivi Ostrovski; mutta samaan aikaan lähetettiin
Vilnaan tuo säälimätön kenraali Muraviev, jonka tehtävänä oli jos
millä keinoin hyvänsä tukehuttaa Litvaan levinnyttä kapinaliikettä. Se
oli paha enne varsinaiselle Puolanmaalle. Kun Wielopolski ja
Suuriruhtinas Konstantino olivat poistuneet, ryhtyi kreivi Berg asiain
johtoon; hyvin käsittäen, että Varsova oli kapinaliikkeen sydän, hän
päätti "kansallishallituksen" harjoittamaa hirmuvaltaa vastaan panna
yhtäläisen hirmuvallan. Kaupunki jaettiin pieniin piirikuntiin,
jokaisessa oma sotapäällikkönsä; toreille nostettiin hirsipuita ja nuo
jokapäiväiset salamurhat, joita kaupungissa yhä harjoitettiin, saivat
aina vastineeksi hirttämistuomion, joka kohtasi milloin syyllistä,
milloin syytöntäkin, ellei syyllistä löydetty. Vaikutus oli pian
huomattava. Pääkaupungin väestö, joka peloituksen valtaamana oli
noudattanut salaisen hallituksen käskyjä, asettui pian tuon vielä
peloittavamman virallisen hirmuvallan puolelle. Jonkun viikon
kuluessa kansallishallituksen jäsenet olivat pötkineet tiehensä rajan
yli ja kapinaliekki oli pääasiallisesti sammunut.

Kun maa tällä tavoin oli rauhoitettu, olisi kreivi Berg epäilemättä
osannut järjestää säännöllistä siviilihallintoa, kenties jossakin määrin
jatkaa Wielopolski'n aloittamaa uudistustyötä. Mutta hän ei enää
hallinnut asemaa. Hänelle tosin jäi varakuninkaan eli namiestnikin
ulkonainen arvo. Mutta sisäasiain johtoon lähetettiin Venäjältä toisia
miehiä, Nikolai Miljutin ja ruhtinas Tsherkaski, joiden tehtävänä oli
hävittää perin juurin, mitä Puolassa vielä oli kansallista. Näiden
toimet eivät enää kuulu tämän historian kehään. Ainoastaan sen
tahdomme mainita, että alustalaismaat ilman korvauksetta annettiin
talonpojille, — siis vielä jyrkempi ratkaisu kuin mitä
Maanviljelysseura aikoinaan oli päättänyt. Aateliston köyhdyttäminen
oli tämän toimenpiteen silmämääränä ja seurauksena.
 Kesällä Ranska ja Englanti vielä kerran olivat uudistaneet
diplomaatilliset huomautuksensa Puolan asiassa. Se kuitenkin jo
alkoi olla selvää, että suurten sanain takana ei ollut mitään vakavaa
tarkoitusta. Kun Venäjän valtiokansleri, ruhtinas Gortshakov, oli
Länsivalloille antanut terävän vastauksensa, lakkasi tuo
diplomaatillinen meteli itsestään. Länsivallat eivät olleet muuta
vaikuttaneet kuin selvää turmiota Puolan kansalle.

Markiisi Aleksanteri Wielopolski, näiden tapausten merkillisin mies,

hän joka oli suunnitellut uuden tulevaisuuden kansallensa, asettui
sitten Dresden'iin asumaan ja kuoli siellä Jouluk. 30 p. 1877.