De moleculaire diagnose van Brugada syndroom

Peirsman Liszl Academiejaar 2009-2010

Dr. Sonia Van Dooren

Afstudeerwerk ingediend voor het behalen van het diploma Bachelor in de Biomedische laboratoriumtechnologie afstudeerrichting Farmaceutische en biologische laboratoriumtechnologie

De moleculaire diagnose van Brugada syndroom

Peirsman Liszl Academiejaar 2009-2010

Dr. Sonia Van Dooren

UZ Brussel Centrum voor Medische Genetica Campus Jette Laarbeeklaan 101 1090 Brussel

Dankwoord Dit afstudeerwerk is er alleen maar gekomen dankzij de steun en hulp van vele mensen! Hieronder een paar woordjes om iedereen te bedanken. Het was een hele ervaring om gedurende vier maanden mee te draaien in een diagnostisch labo. Het opstarten van het onderzoek, het onder de knie krijgen van de technieken en de theoretische begeleiding waren niet mogelijk geweest zonder de samenwerking en sfeer die heerst in het labo. Daarom wil ik ook alle laboranten bedanken die steeds paraat waren om mij te helpen deze stage tot een goed einde te brengen. In het bijzonder wil ik Kristof Endels bedanken. Een betere stagementor had ik mij niet kunnen voorstellen. Ik wens hem te bedanken voor zijn hulp, steun en de grappige momenten tijdens mijn stage. Ben Caljon wens ik te bedanken voor zijn ondersteuning op vlak van informatica en theoretische achtergrond van allerlei zaken. Uiteraard wil ik ook Dr. Sonia Van Dooren bedanken. Als stagepromotor heeft zij er steeds op toegezien dat alles vlot verliep en er mee voor gezorgd dat dit afstudeerwerkvorm kreeg. Zij was steeds bereid uitleg te geven op al mijn vragen. Bedankt voor de vele suggesties en tips en mij te doen doorzetten op momenten dat het even moeilijk ging. Ook mijn ouders, broers, grootouders en toekomstige schoonfamilie mogen niet ontbreken. Hen wil ik bedanken voor hun steun en luisterend oor. Ook mijn medestudenten Sarah, Phebe en Noortje ben ik erg dankbaar. Samen een hapje eten of plezier maken om er nadien weer helemaal ontspannen in kunnen vliegen. Als laatste wil ik mijn verloofde Jan bedanken om mij te helpen bij de vormgeving van dit afstudeerwerk, maar vooral voor de steun en de peptalks gedurende deze stageperiode. Bedankt dat je er bent voor mij. Dankzij iedereen hierboven vernoemd en alle anderen die ik vergeten ben, heb ik een geweldige stageperiode gehad waar ik met een glimlach aan ga blijven terugdenken!

INHOUDSTAFEL 1. 1.1. 1.2. 1.2.1. 1.2.2. 1.3. 1.4. 1.5. 1.5.1. 1.5.2. 1.5.3. 1.5.4. 2. 2.1. 2.1.1. 2.2. 2.2.1. 2.2.2. 2.3. 2.3.1. 2.3.2. 2.3.3. 2.4. 2.4.1. 2.4.2. 2.4.3. 2.5. 2.5.1. 2.5.2. 2.5.3. 2.6. 2.6.1. 2.6.2. 2.6.3. 2.6.4. 2.7. 2.7.1. 2.7.2. 2.7.3. 2.7.4. 3. 3.1. 3.2. 3.2.1. 3.2.2. 3.2.3. 4. 5. 6. 7. Inleiding.................................................................................................................... 11 Het hart...................................................................................................................... 12 Opbouw van het hart................................................................................................. 13 De hartwand .......................................................................................................... 13 Twee helften.......................................................................................................... 14 Prikkelgeleiding ......................................................................................................... 14 Het elektrocardiogram (ECG) ................................................................................... 15 Hartritmestoornissen en hun ECG............................................................................ 16 Normaal ECG ........................................................................................................ 16 De QT-syndromen................................................................................................. 17 Brugada syndroom (BrS) ...................................................................................... 19 Catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie (CPVT)........................... 22 Materiaal en methoden ........................................................................................... 22 Primer design ............................................................................................................ 22 Principe.................................................................................................................. 22 DNA extractie ............................................................................................................ 24 Automatische DNA extractie ................................................................................. 24 Manuele DNA extractie ( protenase-digestie en fenol-chloroform extractie) ...... 26 Polymerase Chain Reaction (PCR) .......................................................................... 27 Principe.................................................................................................................. 27 Reagentia: AmpliTaq 360 DNA-polymerase (Applied Biosystems Kit nr: 4398828) 29 Protocol ................................................................................................................. 30 Gelelektroforese........................................................................................................ 30 Principe.................................................................................................................. 30 Reagentia .............................................................................................................. 32 Protocol ................................................................................................................. 32 Enzym zuivering........................................................................................................ 32 Principe.................................................................................................................. 32 Reagentia (New England Biolabs) ........................................................................ 33 Protocol ................................................................................................................. 33 BigDye Cycle Sequencing ........................................................................................ 34 Principe.................................................................................................................. 34 Reagentia .............................................................................................................. 35 Protocol ................................................................................................................. 36 Analyse.................................................................................................................. 37 High Resolution Melting ............................................................................................ 38 Principe.................................................................................................................. 38 Reagentia .............................................................................................................. 42 Protocol ................................................................................................................. 42 Analyse.................................................................................................................. 44 Resultaten................................................................................................................ 46 Sequencing van SCN5A voor vier indexpatinten ................................................... 46 SCN5A RT-PCR oppuntstelling & HRM pre-validatie .............................................. 50 SCN5A RT-PCR oppuntstelling ............................................................................ 50 SCN5A HRM pre-validatie exon scanning............................................................ 56 SCN5A HRM pre-validatie: gen-scanning ............................................................ 61 Besluit ...................................................................................................................... 70 Literatuurlijst ........................................................................................................... 72 Lijst met figuren ...................................................................................................... 73 Lijst met tabellen..................................................................................................... 75

Lijst met afkortingen A: Adenine ARVD/C: aritmogene rechter ventrikel dysplasie/ cardiomyopathie AV-klep: atrioventriculaire-klep BLAST: Basic Local Alignment Search Tool Bp: basenparen BrS: Brugada syndroom C: Cytosine C: hartritme CCC: covalently closed conformation CO2: koolzuur Cp: cross point CPVT: catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie CRL: Contiguous Read Length DCM: gedilateerde cardiomyopathie ddNTP: dideoxynucleotide trifosfaat DNA: deoxynucleotide acid dNDP: deoxynucleotide difosfaat dNMP: deoxynucleotide monofofaat dNTP: deoxynucleotide trifosfaat ds: double stranded ECG: elektrocardiogram EDTA: ethyleendiaminetetra-azijnzuur F-primer: forward primer G: Guanine GPD1-L: glycerol-3-phospfate dehydrogenase 1-like H-brug: waterstofbrug HCM: hypertrofische cardiomyopathie HRM: High Resolution Melting LQTS: long QT-syndroom NaAc: NatriumAcetaat NCBI : The National Center for Biotechnology Information NTC: no template control, negatieve controle O2: zuurstof OC: open nicked conformation OD: optische densiteit PCR: Polymerase Chain Reaction RNA: ribonucleotide acid

Rpm: rounds per minute R-primer: reverse primer RT: real-time RyR2: cardiale ryanodine receptor type 2 SA-knoop: sino-atriale knoop SCD: sudden cardiac death SNP: single nucleotide polymorphism SQTS: short QT-syndroom ss: single stranded SSS: sick sinus syndroom T: thymine T: Thymine Ta: annealingstemperatuur TBE-buffer: Tris-Boorzuur-EDTA buffer TE-buffer: Tris-EDTA buffer Tm: smelttemperatuur TRL: Trimmed Read Length TRRM: Terminator Ready Reaction Mix UV-licht: ultraviolet-licht

Samenvatting Deze studie focust zich op de moleculaire diagnose van Brugada syndroom. Brugada syndroom is een aangeboren hartritmestoornis in een structureel normaal hart, te wijten aan een onevenwicht tussen in- en uitwaartse ionenstromen. Brugada syndroom wordt tot op heden voornamelijk gelinkt met het SCN5A gen, dat codeert voor een Na+-kanaal. Het doel van dit onderzoek was het ontwikkelen en uitvoeren van de moleculaire diagnose van BrS op het SCN5A gen. Deze studie werd voorafgegaan door de oppunstelling van de directe nucleotide cycle sequencing van SCN5A. Gezien de grootte van dit gen (28 exonen) werd daarnaast ook de voorkeur gegeven aan de ontwikkeling van een diagnostische highthroughput assay via een intermediair mutatiedetectie platform aan de hand van HighResolution-Melting (HRM) analyse. In een vorig werk werd deze oppunstelling opgestart en in dit werk werd deze gefinaliseerd en geprevalideerd. In een eerste deel van dit eindwerk werd de bidirectionele cycle sequencing van SCN5A uitgevoerd voor vier indexpatinten, die allen een typisch Brs ECG hebben. Bij deze indexpatinten werden in totaal 7 single nucleotide polymorphisms (SNPs) gevonden. Bij 1 indexpatint werd een splice-acceptorsite mutatie in intron 24 ontdekt, die, na verder onderzoek in de familie, kan worden beschouwd als de familie-specifieke causale mutatie van Brugada syndroom. In het tweede deel werd de verdere oppuntstelling en prevalidatie van de SCN5A HRM analyse uitgevoerd. Dit vereiste in eerste instantie de oppuntstelling van de real-time PCRs voorafgaand aan de HRM analyse. De 14 nieuw ontwikkelde RT-PCRs werden steeds gevalueerd op sensitiviteit en specificiteit. Finaal kon de HRM analyse oppuntgesteld worden voor 24 van de 28 SCN5A exonen. Voor de HRM-prevalidatie werd enerzijds een exon-gerichte scanning uitgevoerd op de gedentificeerde SNPs in de stalen van de indexpatinten uit deel 1. Alle gevonden SNPs konden ook via HRM-analyse opgepikt worden, met uitzondering van de diep-intronische mutaties die met de HRM-primersets niet gecoverd worden. Anderzijds werd een SCN5A gen-scanning uitgevoerd op stalen van 6 nieuwe BrS indexpatinten en van de indexpatint met een causale BrS mutatie uit deel 1. Hierbij werden een aantal abberante smeltpatronen gedetecteerd die via cycle sequencing als 5 verschillende SNPs en 2 causale BrS mutaties in respectievelijk exon 21 en intron 21 gedentificeerd werden. Bijgevolg werd aangetoond dat de HRM analyse kan gebruikt worden als primaire genscanningmethode voor SCN5A in het kader van de moleculaire diagnose van Brugada syndroom. Dankzij de oppuntstelling zullen in de toekomst sneller mutaties en SNPs kunnen worden gedetecteerd bij patinten met dit syndroom.

Summary This study is focused on the molecular diagnosis of Brugada syndrome. Brugada syndrome is a congenital cardiac arrhythmia in a structurally normal hearth, due to an inbalance between inward and outward ionic currents. Until now, the SCN5A gene, coding for a Na+ channel, is mainly linked with Brugada syndrome. The aim of the research project was to develop and to perform the molecular diagnosis of Brugada syndrome on the SCN5A gene. The study has been preceded by the optimization of direct nucleotide cycle sequencing of SCN5A. Given the size of this gene (28 exons), preference was given to the development of a diagnostic high-throughput assay through an intermediary mutation detection platform, using High-Resolution-Melting (HRM) analysis. This optimization had already started before this study. With this study it has been finalized and prevalidated. In a first part of the research project, the bidirectional cycle sequencing of SCN5A was performed on four index patients, all showing a typical BrS ECG. Within these index patients, 7 single nucleotide polymorphisms (SNPs) in total were found. Within one index patient, a splice-acceptorsite mutation in intron 24 was discovered, that can be considered to be a family specific causal mutation of Brugada syndrome. The second part of the research project was focused on the further optimization and prevalidation of the SCN5A HRM analysis. For this, it was first required to have the real time PCRs optimized prior to the HRM analyses. The 14 newly designed RT-PCRs were always assessed in function of their sensitivity and their specificity. The end result was that the HRM analysis could be optimized for 24 of the 28 SCN5A exons. For the HRM prevalidation, SCN5A exon-focused scanning was performed on the one side, and gene scanning on the other side. The exon-focused scanning was executed on the identified SNPs in the samples of the index patients of the first part of the research project. All of the discovered SNPs could also be detected through HRM-analyses, with the exception of deep intronic mutations that were not covered with the HRM primer sets. The SCN5A gene scanning was executed on samples of 6 new BrS index patients and of the index patient with the causal BrS mutation, discovered during the first part of the research project. During this scanning, a number of aberrant melting patterns were detected, that could be identified as 5 different SNPs and 2 causal mutations in exon 21 and intron 21, respectively. As a result, it was shown that the HRM analysis can be used as a primary gene scanning method within the framework of the molecular diagnosis of Brugada syndrome. Thanks to the optimization of this method it might become easier in the future to detect SNPs and

mutations within patients having Brugada syndrome.

1.

Inleiding

Genetisch onderzoek heeft uitgewezen dat aangeboren, primaire hartritmestoornissen kunnen te wijten zijn aan ionenkanalen die niet optimaal functioneren. Deze ionenkanalen staan in voor de initiatie en propagatie van de actiepotentiaal (het elektrisch signaal dat de hartspier nodig heeft om samen te trekken). Momenteel zijn er heel wat cardiogenen beschreven die elk coderen voor of betrokken zijn in het correct functioneren van een ionenkanaal of een (subeenheid) (tabel 1). Wanneer dergelijk ionenkanaal wordt up- of downgereguleerd, kan dit een effect hebben op het vermogen van de actiepotentiaal, waardoor er een hartritmestoornis kan opgewekt worden. Het zijn vooral de K +-, Na+- en Ca2+-kanalen die aangetast zijn. [1]

Tabel 1: Primaire hartritmestoornissen onderverdeeld volgens type ionenkanaal inclusief de overerving, locus en betrokken genen

11

Primaire hartritmestoornissen als long QT-syndroom (LQTS); short QT-syndroom (SQTS), Brugada syndroom (BrS) en catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie (CPVT) zijn elektrische hartstoornissen die voorkomen in een structureel normaal hart. [2] (Een tachycardie wordt gekenmerkt door een hartfrequentie hoger dan 100 slagen per minuut) Deze syndromen worden voornamelijk via een autosomaal dominant patroon overgerfd. Uiteraard bestaan er ook secundaire hartritmestoornissen, te wijten aan een structureel abnormaal hart. Dit zijn hypertrofische cardiomyopathie (HCM), gedilateerde cardiomyopathie (DCM) en aritmogene rechter ventrikel dysplasie/ cardiomyopathie (ARVD/C). Deze aandoeningen worden gekenmerkt door afwijkingen aan de sarcomeren of het cytoskelet. [3] Daarnaast kan het sick sinus syndroom (SSS) ook hartritmestoornissen veroorzaken. Deze aandoening wordt gekenmerkt door degeneratieve fibrose of ionenkanaal stoornissen in de sinusknoop, wat leidt tot hartritmestoornissen. [4] Deze aangeboren hartritmestoornissen kunnen levensbedreigend zijn en kennen een hoge mortaliteit. Het is daarom belangrijk dat de moleculaire pathways ontrafeld worden om een zo snel mogelijke diagnose te stellen, een goede therapie te starten en nieuwe targets te vinden voor de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen. [1] Dit eindwerk spitst zich vooral toe op de moleculaire diagnose van 1 van de primaier hartritmestoornissen, het Brugada syndroom aan de hand van enerzijds een direct mutatiedetectie platform via directe nucleotide sequencing en anderzijds een intermediair mutatiedetectie platform via High-Resolution-Melting (HRM) analyse.

1.1.

Het hart

Het hart ligt in het midden van de borstholte en loopt uit naar de linkerkant. Het vormt een stomp kegelvorming orgaan, ter grootte van een vuist, dat met de punt naar links beneden is gericht. Deze punt wordt ook wel de apex genoemd. [3] Het is een spier die op een consistente en gecontroleerde manier samentrekt. Deze regelmatige contracties zorgen ervoor dat het bloed wordt rondgepompt doorheen het volledige menselijke lichaam. Op deze manier voorziet de hartspier erin dat de in het bloed aanwezige zuurstof en voedingsstoffen de organen en weefsels bereiken. De hartspier zorgt er ook voor dat koolzuur (CO2) wordt afgevoerd naar de longen en daar, in de longblaasjes, wordt uitgewisseld voor zuurstof (O2). 12

Bepaalde chemische stoffen die in de bloedbaan worden vrijgezet, waaronder adrenaline, bepalen samen met de nervus vagus de snelheid waarmee de pacemakercellen een elektrisch signaal genereren. Deze signalen zorgen voor het samentrekken en ontspannen van de hartspier. [3] Normaal trekt het hart 60 tot 100 keer samen per minuut. Hartritmestoornissen ontstaan wanneer het hart onregelmatig samentrekt. Dit kan leiden tot doorbloedingsstoornissen in allerlei organen, waardoor deze te weinig zuurstof en voedingsstoffen krijgen. Dit is problematisch aangezien tekort aan O2 kan leiden tot orgaanfalen. Hartritmestoornissen kunnen ook een oorzaak zijn van sudden cardiac death (SCD). Dit is een plots hartfalen en komt vaak voor bij personen die leiden aan genetische hartaandoeningen en geleidingsstoornissen. Primair en secundaire hartritmestoornissen hebben een ander werkingsmechanisme maar hebben vaak SCD als gevolg. [5] In deze studie leggen we de nadruk op de eerste categorie van hartritmestoornissen, met name diegene die te wijten zijn aan defecten in ionenkanalen of protenen die helpen in de correcte expressie of functie van de ionenkanalen.

1.2.

Opbouw van het hart

1.2.1. De hartwand Het hart is omgeven door een stug, niet-elastisch bindweefselvlies. Dit wordt het pericard of hartzakje genoemd en is een beschermingslaag voor het hart.

Figuur 1: Opbouw hartwand (epicard/pericard)

Het hart heeft een hartwand die bestaat uit 3 lagen. Deze zijn van binnen naar buiten opgebouwd uit: i) het endocard, ii) het myocard en iii) het epicard. Het endocard, 13

opgebouwd uit een laag endotheelweefsel, functioneert als een beschermlaag voor de binnenkant van het hart. Het myocard is een onwillekeurig, dwarsgestreept spierweefsel dat het hart doet samentrekken. Als laatste is er het epicard. Dit is een dun laagje bindweefsel dat dienst doet als beschermlaag voor de buitenkant van het hart. Daarnaast zorgt het ook voor de productie van pericardiaal vocht. Dit laagje vocht zorgt ervoor dat tijdens elke hartcontractie het epicard en pericard vlot over elkaar kunnen glijden. [6]

1.2.2. Twee helften De hartwand omgeeft 2 helften van de hartspier, de linker- en rechterhelft, die van elkaar gescheiden zijn door een septum. Zowel de linker- als de rechterhelft bestaan uit een atrium en een ventrikel. Door deze onderverdeling ontstaan er vier compartimenten in het hart: i) het linkeratrium; ii) het rechteratrium; iii) de linkerventrikel en iiii) de rechterventrikel. Vanuit de ventrikels vertrekken de grote arterin en in de atria komen de grote venen toe. Algemeen kan men zeggen dat O2-arm bloed zich in de rechterhelft van hart bevindt en O2-rijk bloed in de linkerhelft van het hart. [6] In het hart bevinden zich ook kleppen die ervoor zorgen dat het bloed slechts in 1 richting stroomt, van de atria naar de ventrikels, en ook niet terugstroomt. [2] Tussen het linkeratrium en de linkerventrikel treft men de mitralisklep aan. De tricupidalisklep bevindt zicht tussen het rechteratrium en de rechterventrikel. Deze kleppen worden ook wel de atrioventriculaire-kleppen (AV-kleppen) genoemd. De halfmaanvormige kleppen zorgen voor de afscherming tussen het hart en de rest van het lichaam. Zo wordt de linkerventrikel van de aorta afgesloten door de aortaklep. Tussen de rechterventrikel en de arteria pulmonalis bevindt zicht de pulmonalisklep. Of de kleppen open of gesloten zijn, hangt af van de druk die aan beide zijden van de klep heerst. [6] [6] [7]
Figuur 2: Hartkamers en kleppen

1.3.

Prikkelgeleiding

Hartcontracties zijn het gevolg van een elektrische stroom die van de atria richting de ventrikels stroomt. De pacemakercellen, die in het hart gelegen zijn, wekken de elektrische

14

stroom op. Deze cellen bevinden zich in de sino-atriale knoop (SA-knoop), gelegen in het rechter atrium. De elektrische stroom, die 60-100 maal per minuut wordt opgewekt door de SA-knoop, loopt tussen de atria door naar de (AVen en Het nu
Figuur 3: Prikkelgeleiding

atrioventriculaire-knoop trekken bloed het naar de signaal linkerlinkeris

knoop). Tijdens deze doorgang rechteratrium samen waardoor het rechterventrikel elektrisch stroomt.

aangekomen in de AV-knoop en houdt daar even stand. De druk in

de linker- en rechterventrikel wordt groter dan die in de atria waardoor de tricupidalis- en mitralisklep dichtslaan. Dit wordt ook wel diastole, ontspanning van de kamers, genoemd. Vanaf de AV-knoop wordt het elektrisch signaal verdeeld over het His-Purkinje-systeem, dat bestaat uit vier delen: i) de bundel van His; ii) de linkerbundeltak; iii) de rechterbundeltak en iiii) de Purkinje-vezels. Het His-Purkinje-systeem zorgt ervoor dat de ventrikels samentrekken, de systole. Deze contractie doet de druk in de ventrikels stijgen waardoor de aortaklep en de pulmonalisklep zich openen. Het bloed wordt nu richting de rest van het lichaam en richting de longen gepompt. [3] [7]

1.4.

Het elektrocardiogram (ECG)

De hartcyclus, zoals hierboven besproken, kan ingedeeld worden in vier fasen: fase 1: opwekken elektrisch signaal in SA-knoop; fase 2: contractie van de atria; fase 3: het elektrisch signaal houdt stand in de AV-knoop, vulling ventrikels ; fase 4: contractie van de ventrikels. [3] Deze vier fasen kan men opsporen met een ECG, een medische test die de elektrische activiteit van het hart registreert, uitgevonden door de Nederlander Willem Einthoven. Deze grafische voorstelling geeft informatie over de hartfrequentie, het prikkelingsritme en de 15

impulsuitbreiding. [3] Het ECG wordt onderverdeeld in 6 golven van P to en met U.Voor het begin van de P-top vindt fase 1 plaats: de opwekking van het elektrisch signaal in de SA-knoop. De P-top geeft de depolarisatie van de atria weer, wat overeenkomt met fase 2. De repolarisatie van de atria is op zich niet waar te nemen als een grafische verandering omdat die golf overgaat in de volgende golf, het elektrisch signaal in de AV-knoop. Het QRS-complex geeft de depolarisatie van de ventrikels weer, fase 4 van de hartcyclus. De T-golf weerspiegelt uiteindelijk de repolarisatie van de ventrikels. De U-golf geeft de ontspanning van het hart weer, juist voor de volgende samentrekking. [3] [8] Het PR-interval loopt gelijk met de AV-geleidingstijd. Het QT-interval geeft de totale tijdsduur van de- en repolarisatie van de ventrikels weer. Deze is afhankelijk van de hartfrequentie. [8]
Figuur 4: Het ECG

het QRS-complex. Juist voor dit QRS-complex vindt fase 3 plaats: het stand houden van

1.5.

Hartritmestoornissen en hun ECG

1.5.1. Normaal ECG Figuur 5 geeft de link weer tussen de en Na+ verschillende het het ECG. hart ionenstromen hoeveelheden

Wanneer tijdens fase 0 grote binnenstromen, krijgt men de vorming van het QRS-complex, de ventrikels trekken samen. Fase 1 en 2 worden gekenmerkt door een trage K+-uitstroom. Gedurende fase 1 wordt de
Figuur 5: Ionenstroom gelinked aan ECG

16

uitwaartse K+-stroom in evenwicht gehouden door een inwaartse Na+-stroom en Ca2+stroom. Een plateau-fase wordt gevormd. Tijdens fase 3 vindt een snelle K +-uitstroom plaats. Deze 3 fasen geven de repolarisatie van de ventrikels weer. Fase 4, wat niet wordt weergegeven in figuur 5, is de rustfase. Na deze fase is het hart klaar voor een nieuwe cyclus. [1]

1.5.2. De QT-syndromen 1.5.2.1. Long QT-syndroom (LQTS) LQTS is een overerfbare hartritme aandoening die wordt gekenmerkt door een verlenging van het QTc-interval. Deze aandoening komt ongeveer voor bij 1 op de 10.000 individuen. [7] Het QTc-interval is het QT-interval gecorrigeerd voor het hartritme (c) en wordt gemeten tijdens een ECG aan de hand van de formule van Bazett:

QTc = QT/RR

Een normaal QTc-interval bedraagt ongeveer tussen de 350-400 ms. Een QTc-interval langer dan 440 ms wordt vaak als abnormaal beschouwd. [6] Patinten met een QTcinterval groter dan 500 ms worden aanschouwd als patinten met een hoog risico op hartritmestoornissen. [10] 60-70% van de patinten met LQTS zijn vrouwen. Men vermoedt dat het QTc, dat bij vrouwen van nature iets langer is dan bij mannen, de oorzaak hiervan is. Ook de hogere mortaliteit bij jonge, mannelijke LQTS-patinten kan hiertoe bijdragen. Naarmate de leeftijd ouder stijgt, is het verschil in incidentie tussen mannen en vrouwen te verwaarlozen. [8] Onderstaande tabel geeft voor de 3 belangrijkste LQTS, het aangetasten type ionenkanaal, het functioneel effect, de frequentie van voorkomen, het typische ECG, de triggers en de penetratie (fenotypische uiting van de mutatie) weer.

17

Tabel 2: Correlatie tussen genotype en fenotype voor de drie belangrijkste LQT-genen

LQT1 of KCNQ1 codeert voor het IKs-ionenkanaal. Dit ionenkanaal staat in voor een trage uitwaartse K+-stroom. K+-efflux zorgt voor repolarisatie van de ventrikels. Wanneer dit gen gemuteerd is, resulteert dit in een verminderde IKs-ionenstroom door een defect in het transport van de kanaalprotinen naar het plasmamembraan, een falen in de kanaal assemblage of niet functionele IKs-ionenkanalen. Dit heeft een tragere repolarisatie van de ventrikels tot gevolg. [1] [10] [11] LQT2 of KCNH2 codeert voor het IKr ionenkanaal. Dit ionenkanaal zorgt voor de snelle uitwaartse K+-stroom. Een mutatie in dit gen zorgt opnieuw voor een verminderde K+-efflux wat leidt tot tragere repolarisatie van de ventrikels waardoor de actiepotentiaal wordt verlengd. [1] [10] [11] Het INa ionenkanaal wordt gecodeerd door LQT3 of SCN5A. De Na+-instroom door dit ionenkanaal zorgt voor de depolarisatie van de ventrikels. Gain of function mutaties in dit gen vergroten de Na+-instroom door een langer aanhoudende instroom, een vertraagde inactivatiesnelheid, een sneller inactivatieherstel, een verschuiving in activiteit van ionenkanaal of een abnormale interactie met de -subeenheid. Hierdoor wordt de depolarisatie van de ventrikels verlengd. [1] [10] [11]

1.5.2.2. Short QT-syndroom (SQTS) SQTS is een zeldzame hartritmestoornis waarbij de patinten een QTc-interval hebben dat korter is dan 300-330 ms. Door ventriculaire fibrillaties hebben ze ook een hoog risico op SCD. [4] [8] [11] Op het ECG worden vaak puntige T-golven zonder vlak ST-segment waargenomen. De diagnose wordt gesteld aan de hand van verscheidene factoren: verkort QTc-interval, syncope, ventriculaire fibrillatie of polymorfe ventriculaire tachycardie. [5] [9]

18

Figuur 6: ECG Short QT versus normaal ECG

In de literatuur zijn er 5 genen beschreven die aanleiding kunnen geven tot SQTS. Bij SQT1 veroorzaken mutaties in het KCNH2-gen een verhoogde IKr-uitstroom. Dit leidt tot een verkorting van de repolarisatie van de ventrikels. Triggers voor dit syndroom zijn idem aan deze van LQT2: sport, lawaai en rust. [5] [9] [13] Bij SQT2 ligt de oorzaak in mutaties in het KCNQ1-gen wat de IKs-uitstroom verhoogt en zo het QT-interval verkort. [5] [9] [13] Mutaties in het KCNJ2-gen, het IK1-kanaal, veroorzaken SQT3. De IK1-uitstroom wordt verhoogd waardoor de laatste repolarisatie fase versnelt. SQT3 kan aanleiding geven tot onverwacht wakker worden s nachts of hartkloppingen. [5] [7] [13] Als laatste worden SQT4 en SQT5 geassocieerd met mutaties in het CACNA1C-gen en het CACNB2b-gen. Deze 2 genen coderen respectievelijk voor de 1- en 1-subeenheid van het L-type Ca2+-kanaal. Deze mutaties verlagen de ICa,Linstroom wat eveneens een verkorting van de repolarisatie-fase geeft. [9]

1.5.3. Brugada syndroom (BrS) In 1992 werd het BrS voor het eerst beschreven, gekenmerkt door een typisch ECG met een verlenging van het ST-segment in de rechter precordiale geleider. Dit syndroom, met een prevalentie van 5/10.000 personen, kenmerkt zich door een rechter bundel blok, ventriculaire hartritmestoornissen en SCD zonder enige structurele hartafwijkingen. De aandoening valt onder de ionenkanaal stoornissen en wordt autosomaal dominant overgerfd. Patinten kunnen dit syndroom elk op een andere manier ervaren, gaande van hartkloppingen en duizeligheid tot syncope en SCD. Deze symptomen komen vaak tot uiting wanneer de patint rustig is, zoals s nachts. [2] [5] [14] [16] 19

BrS wordt gekenmerkt door 3 verschillende ECGs, elk met hun eigen kenmerken. Type 1 ECG wordt gekenmerkt door een coved (hol) ST-segment verlenging gevolgd door een negatieve T-golf. Het tweede type ECG wordt ook gekenmerkt door een ST-segment verlenging maar dan gevolgd door een positieve of saddleback (bifasische) T-golf. Het derde ECG type wordt gekenmerkt door een kleinere ST-segment verlenging, coved of saddleback. Een type 1 ECG is het belangrijkste diagnostische criterium voor BrS. [2] [16]

Figuur 7: Type 1, 2 en 3 ECG

Aangezien patinten met het BrS op bepaalde momenten een normaal ECG kunnen hebben, is het moeilijk om een diagnose te stellen. Dit kan men oplossen door de patint een Ajmalinetest te laten ondergaan. Ajmaline is een Na+-kanaal blokker en wordt aan het lichaam toegediend via een infuus. Het vertraagt de elektrische geleiding in het hart waardoor het typische Brugada ECG-patroon kan worden opgewekt. Wanneer patinten een positieve Ajmalinetest hebben en een Type 1 ECG is men zeker dat de patint BrS heeft. [2] [14] [16] Genetische testen zijn dan wenselijk om de oorzaak te achterhalen.

20

Figuur 8: Verschil in actiepotentiaal tussen normaal ECG (a), type 1 ECG (c) en type 2 ECG

SCN5A, de -subeenheid van het Na+-kanaal, is lang het enige gen geweest dat aan het BrS werd gelinkt. Er zijn in dit gen al honderden mutaties gekend die een functieverlies geven van de INa-instroom. Dysfunctie van het Na+-kanaal enerzijds maar ook een verminderde vorming van Na+-kanalen anderzijds zijn oorzaak van deze verlaagde INastroom. [14] [16] Door een verminderde Na+-instroom tijdens fase 0 en een normale K+-uitstroom tijdens fase 1 ontstaat er een onevenwicht tussen deze ionenstromen wat de hartritmestoornissen veroorzaakt. Hoewel mutaties in het SCN5A-gen sterk gelinkt worden aan het BrS, wordt er slechts bij 18-30% van de patinten ook een mutatie gevonden. In familiale gevallen van BrS is het percentage aan mutaties dan weer hoger in vergelijking met sporadische gevallen. Deze zaken wijzen er allemaal op dat het BrS een syndroom is met een grote genetische heterogeniteit. Recent werden er naast SCN5A 4 nieuwe andere genen geassocieerd met BrS. Mutaties in het gen, glycerol-3phosphate (GPD1-L) dehydrogenase leiden indirect
+

1-like tot een

Figuur 9: Verstoorde ionenstroom bij BrS

functieverlies van het Na -kanaal. Mutaties in GPD1-L verminderen de aanvoer van Na+kanalen naar het celmembraan. [2] [16]

21

Mutaties in de 2 genen, CACNA1c en CACNB2b, die coderen voor 2 Ca2+-kanalen, kunnen op hun beurt ook zorgen voor een verstoorde ionenstroom met BrS in combinatie met SQTS tot gevolg. Daarnaast zijn mutaties in het KCNE3-gen ook geassocieerd met het BrS. Dit gen codeert voor de -subeenheid uitwaartse K -stroom. [16] Door de ontdekking van deze nieuwe genen wordt BrS niet meer omschreven als een louter Na+-kanaal stoornis, maar meer als een syndroom te wijten aan een onevenwicht tussen de in- en uitwaartse ionenstromen. [16]
+

van een eiwit dat verantwoordelijk is voor de

1.5.4. Catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie (CPVT) Patinten met CPVT hebben polymorfe tachycardin uitgelokt door stress situaties. Bij deze aandoening zorgen gain-of-function mutaties in het cardiale ryanodine receptor type 2 (RyR2) gen voor een ongecontroleerde Ca2+ vrijzetting wat leidt tot hartritmestoornissen. [2]

2. 2.1.

Materiaal en methoden Primer design

2.1.1. Principe Amplificatie van een specifiek deoxynucleotide acid (DNA) fragment verkrijgt men alleen wanneer men specifieke primersets gebruikt. Deze primersets zijn synthetische oligonucleotiden die complementair en anti-parallel zijn aan de te amplificeren DNA sequentie. Voor de ontwikkeling van primersets voor HRM-analyse maakt men gebruik van het gespecialiseerde computerprogramma LigtScanner Primer Design Sofware 1.0. Bij het ontwikkelen van primers zijn er enkele punten waarop men moet letten.

2.1.1.1. Primer selectie: lengte en regio Om een specifieke amplificatie te krijgen, kunnen primers best een lengte van 18-24 basenparen (bp) hebben. Primers met een lager aantal bp hebben echter een grotere kans om aspecifiek in het genoom te binden. De parameters van het programma worden zodanig ingesteld dat primers gegenereerd

22

worden die maximaal fragmenten van 350-400 bp overspannen. Fragmenten groter dan 400 bp zullen de mutatie detectie gevoeligheid verlagen, waardoor de kans op vals negatieven groter wordt. De regio waarin primers worden ontwikkeld, ligt meestal een 50tot 100-tal basen verwijderd van het begin en eind van het exon, om een maximale mutatie detetectie gevoeligheid aan de intron-exon boundaries te garanderen.

2.1.1.2. Primer specificiteit De specificiteit van een primerset gaat men na met het computerprogramma Primer BLAST Basic Local Alignment Search Tool van The National Center for Biotechnology (NCBI). Dit programma gaat na hoe groot de kans is dat een primer ergens aspecifiek in het humaan genoom kan binden. Daarnaast vermijdt men beter eventueel aanwezige single nucleotide polymorphisms (SNP) binnen primers, aangezien ze, afhankelijk van hun locatie, de oorzaak kunnen zijn van allel-dropout of een verlaagde opbrengst van de polymerase-chain-reaction (PCR)-reactie. De aanwezigheid van SNPs onder de ontworpen primers wordt nagegaan met het softwarepakket Alamut 1.5. Dit databaseprogramma met een zeer gebruiksvriendelijke interfase registreert en update continu gekende en beschreven SNPs en mutaties zodat deze gemakkelijk op te sporen zijn in de sequentie van een bepaald gen. [16] [17] [18] [19] [20]

2.1.1.3. De annealingstemperatuur De smelttemperatuur (Tm), de temperatuur waarbij 50% van de primer-matrijs structuur volledig gedenatureerd is, kan ondermeer bepaald worden met de formule van Thein en Wallace en is afhankelijk van het Guanine (G)/ Cytosine (C)-gehalte: Tm = 4C x (GC) + 2C x (AT) Primers met een GC-gehalte van 40-60% zullen een stabiele binding geven met het complementaire DNA fragment, aangezien GC-bindingen sterker zijn dan Adenine (A)/ Thymine (T)-bindingen (3 versus 2 waterstofbruggen (H-bruggen)). Ontwikkeling van primers in een regio waar het percentage GC te hoog is, bemoeilijkt de amplificatie. [18] [20] [21] In functie van de Tm bepaalt men de annealingstemperatuur (Ta) van de primer. Deze Ta ligt meestal 1-5C lager dan het primerpaar met de laagste Tm. Toch moet de optimale Ta van

23

elke primerset experimenteel bepaald worden. Bij primer design is het belangrijk primerparen te ontwikkelen waarvan de T ms ongeveer dezelfde zijn. Primerparen met sterk verschillende Tms resulteren doorgaan in inefficinte amplificatie. Wanneer men een te lage Ta instelt, zullen de primers aspecifiek binden met een lagere opbrengst van het gewenste DNA fragment tot gevolg. Bij een te hoge Ta zal de primerset niet tot niet goed aan de complementaire DNA sequentie kunnen binden met geen tot lage opbrengst als gevolg.

2.1.1.4. Zelfcomplementariteit van de primer Primers met aan het 3-uiteinde een G of een C helpen bij de correcte binding aan en verlenging van het matrijs DNA. Een opeenvolging van >3 verschillende G of Cs aan het 3-uiteinde is best te vermijden. Deze G- of C-stretch kan, door complementariteit, hairpinstructuren (intramoleculaire hybridisatie) vormen, waardoor de primer niet meer kan binden en niet meer beschikbaar is voor verlenging aan het 3-OH-uiteinde. Een thymine (T) of Tstretch aan het 3-uiteinde wordt beter vermeden omdat deze aanleiding geeft tot een minst stabiele binding aan het matrijs DNA. Voor een primerpaar is het ook belangrijk dat de 3-uiteinden geen complementaire sequenties bevatten. Dit kan zelf- of primerset-dimerisatie bevorderen waardoor de primer(s) evengoed niet meer beschikbaar zijn. Met het freeware programma Auto Dimer kan men de kans op dimerisatie en hairpin structuren nagaan. Wanneer men in dit programma de score op zelfcomplementariteit laag instelt (1 voor een perfecte match, -1
een mismatch, -0,25 voor een base (of N) met een N en -2 voor een 'gap') kan deze

maximaal gedetecteerd worden. Het is dan aan de gebruiker om uit te maken of de gevonden zelf-complementariteit en hairpins significant de PCR-efficintie zullen benvloeden. [20][21]

2.2.

DNA extractie

2.2.1. Automatische DNA extractie 2.2.1.1. Principe Met behulp van de Multiprobe II Plus EX + Gripper robot en de Chemagen Chemagic Magnetic separation Module I kan men op een automatische manier DNA extraheren uit 57 ml EDTA-bloed (EDTA wordt gebruikt als een coagulans). Het EDTA-bloed wordt gemengd met een hoeveelheid lysebuffer en protease. De 24

lysebuffer zorgt ervoor dat de cellen opzwellen en openbarsten en het protease gaat de aanwezige eiwitten afbreken. Hierdoor komt het DNA vrij, waarna het in aanwezigheid van de bindingbuffer wordt gebonden aan gecoate beads. Wanneer men de magneet aanzet, zullen de magnetisch gecoate beads, waaraan het DNA is gebonden, aangetrokken worden. Op die manier kan, na een aantal wasstappen, het supernatans met cellulaire resten verwijderd worden. Tenslotte elueert men het gextraheerde DNA in bijhorende elutiebuffer. [22] Met de Nanodrop ND-1000 bepaalt men de concentratie en de zuiverheid van het gextraheerde DNA. De concentratie van het DNA-staal wordt bepaald aan de hand van de optische densiteit (OD) bij 260 nm. De ratio 260/280, die de contaminatie door protinen weergeeft, moet rond de 1,8 liggen. De ratio 260/230 geeft de zuiverheid van het DNA-staal weer in verhouding met de aanwezige hoeveelheid ribonucleotide acid (RNA). Een ratio van 1,8-2,2 is zeer goed en toont aan dat er geen contaminatie aanwezig is. [22] 2.2.1.2. Reagentia (GC Biotech) Lysebuffer; Protease; Bindingbuffer; Magnetische beads; 5 wasbuffers; Elutiebuffer
Figuur Nanodrop

10: ND-1000

2.2.1.3. Protocol DNA-extractie: Zet het toestel en het programma klaar; Breng maximum 7 ml bloed aan in de 50 ml falcon tubes; Plaatsing stalen, tubes, tips; Vul de nodige vloeistoffen aan (magnetische beads, protease, elutiebuffer, buffer); Start de run (per run kan er uit twaalf bloestalen DNA gextraheerd worden);

25

Nanodrop: Schakel de software in; Kalibreren (blanco instellen); Concentratie stalen meten.

2.2.2. Manuele DNA extractie ( protenase-digestie en fenol-chloroform extractie) 2.2.2.1. Principe De protenase K digestie en fenol-chloroform extractie is een techniek die wordt toegepast voor DNA-extractie uit andere stalen dan bloedstalen, bv. prenatale chorion villi of amniocyten, biopten, urine, enz. [23]

waterige fase organische fase

Een lysebuffer let detergent en protenase K worden toegevoegd aan cellen om de celmembraan te lyseren en het DNA vrij te maken van protenen. Tijdens de fenol-chloroform extractie zal het vrijgekomen DNA oplossen in de waterige fase (bovenaan) terwijl alle andere celcomponenten oplossen in de organische fase (onderaan). Dit opgezuiverd DNA kan men gebruiken voor moleculaire testen. [23]

2.2.2.2. Reagentia 1x Tris-EDTA buffer (TE-buffer) pH 8 (Promega); 4mg/ml Protenase-K: 20mg gelyofiliseerd oplossen in 5ml water (Merck); Fenol (Sigma); Chloroform/isoamylalcohol 24:1 (VWR); Absolute Ethanol (apotheek); 3M NatriumAcetaat (24.61 g NaAc aanlengen tot 100 ml met gesteriliseerd water); Zuiver, steriel en pyrogeenvrij water (Kela); 10% SDS (Sigma).

26

2.2.2.3. Protocol Voeg 25 l Protenase-K, 425 l TE-buffer en 50 l 10% SDS toe aan CVS-, spier-, hart-, of leverstalen; Voeg 5 l Protenase-K, 445 l TE-buffer en 50 l 10% SDS toe aan AC-, fibro-, leuco-, EBV-, NS-, of CVSLTstalen; Voeg 500 l van de Protenase-K/TE-buffer/10%SDS oplossing toe aan het te bereiden staal en incubeer het 2u in een warmwaterbad van 45C; Vortex het nadien 1 maal en voeg 500 l fenol toe; Bereid 70% ethanol-oplossing (300 l aqua ad injectabilia en 700 l absolute ethanol); Bereid Ethanol/NaAcetaat-oplossing (1 ml absolute ethanol en 45 l 3 M Natriumacetaatoplossing); Meng de fenol- en waterfase homogeen door de eppendorftube enkele malen om te zwenken; Centrifugeer gedurende 5 min. aan 8000 rounds per minute (rpm) (6726g); Pipetteer de bovenste fase over naar een nieuw eppendorftube en voeg 500 l chloroform/isoamyethanol 24:1 (96 ml chloroform en 4 ml isoamylalcohol ) toe; Centrifugeer na mengen 5 min. aan 8000rpm (6726g); Pipetteer de bovenste fase over naar een nieuwe eppendorftube en voeg opnieuw 500 l chloroform/isoamyethanol 24:1 toe; Centrifugeer na mengen opnieuw 5 min aan 8000 rpm (6726g); Pipetteer de bovenste fase over naar een hemolysebuisje; Na vortexen wordt een slijmerige vlok, DNA, gevormd; Pik de DNA-vlok op met een toegeschroeide pasteurpipet; Spoel de DNA-vlok met 70% ethanol en laat drogen aan de lucht; Los de vlok op in de gewenste hoeveelheid TE-buffer; Draai parafilm rond het dekseltje van tube en laat het overnacht op een rad in de koelkamer (+4C) oplossen; Bepaal de concentratie aan DNA met de Nanodrop; Bewaar het DNA op 4C.

2.3.

Polymerase Chain Reaction (PCR)

2.3.1. Principe PCR is een methode waarmee men, vertrekkende van een kleine hoeveelheid DNA, een

27

specifieke DNA-sequentie exponentieel kan amplificeren. Het is een methode die in vitro wordt uitgevoerd en die wordt gekenmerkt door een cyclische afwisselende temperatuursstijging en daling. Om een specifieke DNA-sequentie te amplificeren maakt men gebruik van primers ( 20 bp), die complementair en anti-parallel zijn aan de matrijs, en van een thermostabiel DNA polymerase, Taq polymerase. Dit Taq polymerase wordt gesoleerd uit Thermus Aquaticus. Het is actief tot een temperatuur van 96C en heeft volgende eigenschappen: 5 3 polymerase activiteit; 5 3 exonuclease activiteit; Geen 3 5 exonuclease activiteit (geen proofreading); Verlengt 3 uiteinde met 1 Adenine (A); Heeft matrijs en deoxynucleotide trifosfaten (dNTPs) nodig om zijn polymerase activiteit uit te voeren; Heeft Mg2+-ionen nodig als cofactor. [24]

Een PCR-reactie bestaat uit volgende stappen: Bij Initile denaturatie bij 95C voor 1; Denaturatie bij 95C voor 30; Annealing bij Ta van de primerset voor 30; Extensie bij 72C; Finale extensie bij 72C; Koeling bij 10C. de PCR-reactie

worden stap 2 tot en met 4 worden ongeveer 30 cycli herhaald. Het aantal test. het De zorgt te DNA enkelstrengig
Figuur 11: Voorstelling PCR-reactie

precieze van ervoor de dat

herhalingen is afhankelijk denaturatie-stap

amplificeren fragment

(single standed of ss) wordt. Tussen de verschillende cycli is een denaturatie-stap van 30 voldoende om de gevormde dubbelstrengige (ds) DNA fragmenten ss te maken. 28

De temperatuur van de annealing-stap de temperatuur waarop de primers binden op het ss DNA- ligt ideaal net onder de Tm van de primers. De extensie-stap gebeurt op 72C, de temperatuur waarop het Taq pol het 3 OH-uiteinde van de primers verlengt. Nadat het ingegeven aantal cycli doorlopen is, vindt de finale extensie plaats. Na deze stap zijn alle gevormde DNA fragmenten in principe volledig ds. Nadien wordt het PCR-product gekoeld op 10C, een temperatuur waarop het zeer stabiel is. Na ongeveer 30 cycli zal er geen exponentile stijging meer zijn. De PCR reactie zal op dat moment zijn plateau-fase bereiken. Reagentia (primermix, dNTPs) die zijn opgebruikt, het Taq pol dat niet meer optimaal werkt of de opstapeling van PPi, dat inhiberend werkt op de PCR-reactie, zijn mogelijke oorzaken van de plateau-fase. [25] [26] Wanneer men verschillende primersets met eenzelfde in silico bepaalde Ta range wil samen testen, kan men opteren voor een touchdown PCR. Bij een touchdown PCR wordt de Ta over een range van maximaal 10C stapsgewijs per cyclus met 0,5C verlaagd. Op deze manier zullen de verschillende primersets elk bij hun eigen ideale temperatuur annealen. Om de downstream directe nucleotide cycle sequencing-reactie te standaardiseren, worden aan de PCR-primers M13-tags gekoppeld. Deze M13-tags zullen niet aspecifiek binden binnen het genoom maar worden wel mee geamplificeerd. Voor meer uitleg zie 2.6. Om na te gaan of er tijdens de PCR-reactie geen contaminatie is opgetreden, neemt men steeds een no template control of NTC mee. Deze NTC bevat alle reagentia behalve DNA. De NTC wordt ook steeds meegenomen tijdens de gelcontrole.

2.3.2. Reagentia: AmpliTaq 360 DNA-polymerase (Applied Biosystems Kit nr: 4398828) AmpliTaq 360 10X PCR buffer (stockconcentratie) 1X (werkconcentratie); 25mM MgCl2-oplossing (stockconcentratie) 2mM (werkconcentratie); 200 M dNTPs (GE Healthcare); AmpliTaq 360 5U/l 1U; primer mix forwared (F)/reverse (R) ( finaal elk 2 M) (IDT); DNA verdunning (finaal 1,70 g/ml); Water tot 50 l (Kela); 29

Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems).

2.3.3. Protocol Nummer de nodige PCR tubes; Maak reactie mix, steeds in overmaat; Voeg het Taq pol op het einde toe (zie tabel 3); Verdeel 30 l mix uit in elke PCR tube; Voeg 5 l primermix toe (bevat forward en reverse primers) toe aan elke PCR tube; Maak DNA verdunning onder de laminaire flow om DNA-contaminatie te vermijden, steeds in overmaat; Voeg 15 l van de DNA-verdunning toe aan de genummerde PCR tubes, steeds onder de laminaire flow om DNA-contaminatie te vermijden; Plaats de PCR-tubes in de Veriti Thermal Cycler (applied Biosystems) en stel het PCR-programma in;
Tabel 3: Samenstelling reactiemix PCR

Lotnummer (+ firma)

Finale conc. / 1x 2 mM 200 M 1U

Samenstelling

Volumes in l 1 reactie # react. 8 102 40 32 64 2

240

Water GeneAmp 10x PCR Buffer II 25 mM MgCl2 solution dNTPs AmpliTaq (5U/l) totaal

12,75 5 4 8 0,25 30

2.4.

Gelelektroforese

2.4.1. Principe De migratie van moleculen, in een dragermateriaal, doorheen een elektrisch veld noemt men elektroforese. Deze moleculen kunnen gescheiden worden op basis van: grootte; conformatie; ladingsdensiteit.

30

De grootte komt voor een DNA fragment overeen met de lengte. DNA fragmenten met een groot aantal bp zullen trager migreren dan DNA fragmenten met een kleiner aantal bp. Covalently closed conformation (CCC), open nicked conformation (OC) en lineair zijn de 3 conformatie vormen waarin DNA kan voorkomen. PCR-producten zijn lineaire DNA fragmenten en migreren sneller dan OC en CCC DNA. Bij neutrale pH is de lading van elk DNA-molecule hetzelfde. De fosfaatgroepen van de fosfaat-pentose ruggengraat zijn op die pH geoniseerd, wat het DNA een netto negatieve lading geeft. De DNA moleculen zullen hierdoor allemaal naar de positieve pool (anode) van het elektrisch veld migreren. [26] Als dragermateriaal gebruikt men het lineair polysaccharide agarose dat gextraheerd wordt uit zeewier en is opgebouwd uit galactose en een galactose derivaat. Het wordt opgelost in Tris-Boorzuur-EDTA-buffer (TBE-buffer) en is vloeibaar bij 95C. Bij afkoelen, zullen er zich H-bruggen vormen tussen de bouwstenen waardoor men gel-vorming krijgt. Om de DNA fragmenten na scheiding te visualiseren onder ultraviolet licht (U.V-licht) voegt men aan de TBE-buffer, opgelost in H20, 100 l Gelred toe. Gelred is een fluorescente dye die, in tegenstelling tot ethidiumbromide, veiliger en veel gevoeliger is. Het intercaleert tussen de baseparen en absorbeert U.V.-licht van 300-360 nm, waarna het een fluorescent signaal uitzendt. De sterkte van een gekleurd bandje op gel komt overeen met de hoeveelheid geamplificeerd DNA. [27] Wanneer men een PCR van een bepaald exon op punt stelt, is het belangrijk na te gaan of men het juiste fragment heeft geamplificeerd. Dit kan men doen door een moleculaire gewichtsladder mee op gel te zetten. Deze moleculaire gewichtsladder bevat x-aantal fragmenten waarvan de lengte gekend is. Aan de hand hiervan kan men de lengte van het geamplificeerde DNA fragment afleiden. Voor een controle van PCR-fragmenten voor sequencing, met een lengte tussen 200 500bp, maakt men een gel van 2% agarose. Voor real-time (RT) PCR-controle tussen 100 en 350bp maakt men een gel van 3% agarose, om een betere scheiding van fragmenten te bekomen.
Figuur 12: Foto gelelektroforese

31

2.4.2. Reagentia UltraPure Agarose Electrophoresis (invitrogen); 10X TBE-buffer (stockconcentratie) 1X (werkconcentratie) (Invitrogen); Gelred 10l in 100 l (Biotium); Eventueel moleculaire gewichtsmerkers (Roche en New England Bio-Labs); Draagbakje en kammetjes (Eurogentec Mupid-ex); Elektroforesekamer (Eurogentec Mupid-ex); UV-transilluminator + camera (TFP-M/WL Vilber Lourmat).

2.4.3. Protocol Meet 70 ml TBE-buffer 1X af in een maatcilinder en breng over in een fles (idem voor RT-PCR-controle); Weeg 1,4 g agarose (2,1 g voor RT-PCR-controle) af in een weegschuitje en voeg toe aan de TBE-buffer 1X; Meng de agarose en verwarm in een microgolfoven tot alle agarose is opgelost; Laat 10 min afkoelen en giet oplossing in een draagbakje + kammetjes; Laat de gel stollen; Haal de kammetjes uit gel; Leg de gel in een elektroforesekamer (gevuld met TBEbuffer); Laad 10 l PCR-product (5 l voor RT-PCR-controle); Stel de timer in op 20 minuten (60 minuten voor RTPCR-controle); Stel de spanning in op 100V; Visualiseer na de aangegeven tijd het DNA in de gel onder de U.V.-transilluminator en maak een foto.
Figuur Gelektroforesekamer kammetjes 13: +

2.5.

Enzym zuivering

2.5.1. Principe Na een PCR-reactie bevindt er zich in de PCR-tube nog onverbruikte primersets en vrije dNTPs die moeten verwijderd worden vooraleer men de sequencing kan verderzetten. De aanwezigheid van zowel een F- als een R-primer kunnen het elektroferogram, dat aan het 32

einde van de sequencing bekomen wordt, verstoren. Bovendien kan een te hoge concentratie aan vrije dNTPs de incorporatie van dideoxynucleotiden trifosfaten (ddNTPs) bemoeilijken. [28] Voor de enzymzuivering gebruikt men 2 enzymen: Exonuclease I en Antartic Phosphatase. Exonuclease I breekt ssDNA en dus de primers in een 3 5 richting af en vormt zo deoxynucleotide monofosfaten (dNMPs). Antartic Phosphatase breekt de vrije dNTPs af tot deoxynucleotide difosfaten (dNDPs), dNMPs en zo tot nucleosides. Deze componenten kunnen niet meer verbruikt worden en dus ook niet meer interfereren in verdere reacties. [28]
Exonucleas e I Antarctic Phosphatas e oligonucle otide dNMP nucleoside

Antarctic Phosphatase Antarctic Phosphatase Antarctic Phosphatase dNTP dNDP dNMP nucleoside

2.5.2. Reagentia (New England Biolabs) Exonuclease I 20 U/l (stockconcentratie) 1 U/l; Antartic Phosphatase 5 U/l (stockconcentratie) 1 U/l; Beide opgelost in 100 l H2O

2.5.3. Protocol Nummer de nodige PCR-tubes; Voeg aan elke PCR-tube 1 l enzym-mix (5 l Exonuclease I, 20 l Antartic Phosphatase en 75 l H20 voor 100 l enzym-mix) toe; Voeg 5 l PCR-product toe; Zet PCR-tubes in Veriti Thermal Cycler en stel volgend programma in:

Tijd Incubatie 15'

Temperatuur 37C 80C 10C

Denaturatie 20' Koeling

De stalen zijn nu zuiver om een BigDye Cycle Sequencing reactie uit te voeren. 33

2.6.

BigDye Cycle Sequencing

2.6.1. Principe Met sequencing bepaalt men de opeenvolging van basen in een DNA-keten. De techniek, gebaseerd op de keten-terminatie methode van Sanger, is geautomatiseerd en maakt gebruik van 4 fluorescent gelabelde ddNTPs: ddATP; ddGTP; ddTTP en ddCTP. De ddNTPs hebben aan hun 3-uiteinde een H-groep in plaats van een OH-groep en worden in ondermaat toegevoegd aan het reactiemengsel. De H-groep die het ddNTP draagt, voorkomt verlenging van de DNA-keten aan het 3-Huiteinde. [28]

Figuur 14: Verschil tussen dNTP en ddNTP

In plaats van, zoals bij een PCR-reactie, de F-en R-primer toe te voegen, voegt men hier enkel de F- of R-primer toe. Het geamplificeerde DNA fragment zal nu slechts langs 1 zijde verlengd worden met een lineaire amplificatie tot gevolg. Door de ddNTPs in ondermaat toe te voegen, zullen ze door het Taq pol op willekeurige posities ingebouwd worden wat
Figuur 15: BigDye Cycle sequencing

resulteert in fluorescent gelabelde ssDNA fragmenten van verschillende lengte. [25] [28] Voor de BigDye Cycle Sequencing-reactie heeft men - juist zoals bij een PCR-reactie -

34

buffer, Taq-pol en dNTPs nodig. De ddNTPs zijn specifiek voor de BigDye Cycle Sequencing-reactie. Het Taq pol, de dNTPs en de ddNTPs zitten samen in een mastermix, Terminator Ready Reaction Mix (TRRM). De buffer, het water, de M13 F- of R-primers en het gezuiverde PCR-product moeten nog apart toegevoegd worden. [28] Om na de BigDye Cycle Sequencing de niet verbruikte M13 primers, dNTPs en ddNTPs te verwijderen, gebruikt men de BigDye X-TerminatorTM Purification Kit. Deze kit bevat een buffer, SAM-oplossing en hars, X-Terminator. De X-terminator hars zal onder constant schudden alle vrije componenten binden en capteren. Tijdens en na het afdraaien, zakt de X-Terminator uit naar de bodem. De bovenstaande SAM-buffer bevat de ssDNA fragmenten en is vrij van interfererende deeltjes. [28] De ssDNA fragmenten worden gescheiden en geanalyseerd op de ABI 3130 xl Genetic Analyzer. In dit toestel worden de ssDNA fragmenten gescheiden via capillaire elektroforese. De uitgezonden fluorescentie wordt in bepaalde golflengtegebieden (virtuele filters) opgevangen en gecollecteerd door een CCD camera. De opgevangen lichtintensiteiten worden opgeslagen als digitale signalen die de computer dan met behulp van het Sequence Analysis software v5.2 verwerkt tot een elektroferogram die de opeenvolgende basen weergeven.

2.6.2. Reagentia BigDye Cycle Sequencing (Applied Biosystems): 1 l Gezuiverd PCR product; 1.5 l BigDye Sequencing buffer 5X (stockconcentratie) 0.75x (werkconcentratie); 1 l TRRM (bevat Taq pol, dNTPs en ddNTPs) 2.5x (stockconcentratie) 0.25x (werkconcentratie); 1 l M13 primer (F en R) 0.16 M (werkconcentratie); 5,5 l water.

Plaatzuivering (Applied Biosystems): 35 l SAM-buffer; 7.5 l X-Terminator (deze moet voor gebruik zeer goed gemixt worden); 35

Schudapparaat (IKA MS3 Digital).

2.6.3. Protocol BigDye Cycle Sequencing: 9 l mix (buffer, TRRM, M13 primer en water) in elke PCR tube en 1 l enzym gezuiverd PCR product; Stel programma in en run op de Veriti Thermal Cycler:

Tijd Denaturatie 1'

Temperatuur 96C

Deanturatie 10' Annealing Extentie 5' 4'

96C 50C 60C 25 x

Koeling

10C

Plaatzuivering: Meng voor 1 staal 35 l SAM en 7,5 l X-Terminator; Voeg per well 42.5 l van de oplossing toe aan de 96-well plaat; Voeg10 l Big Dye product toe; Laat 30 min schudden op 3000 rmp en daarna 2 min afdraaien 1000 g; Plaat laden in de ABI 3130 xl Genetic AnalyzerSequencing inzetten => namen ingeven; => oven aanzetten; => programma instellen (standaard, kort of lange injectie, lange runtijd,).

36

2.6.4. Analyse De ABI 3130xl Genetic Sequencer geeft, na de run, de resultaten weer in elektroferogrammen. Deze elektroferogrammen zijn een grafische weergave van de nucleotidensequenties. Ze worden manueel gelezen, aan de hand van een referentiesequentie. Nadien worden de sequenties nagekeken in het software programma Variant Reporter v1.1. Om een analyse in Variant Reporter v1.1 uit te voeren, worden eerst enkele analyseparameters ingesteld waaronder basecalling en trimming. Tijdens de basecalling gaat het programma na of het aan elke piek, gegenereerd in het elektroferogram, een base kan toeschrijven. Nadien wordt de sequentie getrimmed. Tijdens deze stap worden 5 en 3 uiteinden van de sequentie verwijderd volgens vooraf aangegeven criteria. Na het instellen kunnen de referentiesequentie en de te analyseren sequenties in het programma gemporteerd en geanalyseerd worden. Na deze stap wordt eerst aan de hand van de kwaliteitsparameters nagegaan welke sequenties al dan niet voldoen aan de analyseparameters. De onderzochte kwaliteitsparameters zijn Average Trace Score, Median PUP score , Contiguous Read Lenght (CRL), Trimmed Read Lenght (TRL) en Signal Strength. De belangrijkst sequentie kwaliteitsparameter is Average Trace Score en geeft een kwaliteitswaarde aan de sequenties die overblijven na trimming. Een trace score van 30 stemt overeen met een 99.9% zeker basecalling. De Median PUP score geeft de zuiverheid van de sequenties weer: hoe hoger de PUP score, hoe minder achtergrondsequentie er aanwezig is. De CRL zegt iets over de continue lengte van de sequentie waarin de basecalling vlot verloopt. De TRL laat zien of de sequentie nog aan de analyseparameters voldoet na trimming. Als laatste is er de Signal Strength, die weergeeft welke sequenties een piekintensiteit hebben hoger dan de minimum ingestelde piekintensiteit van 200. Of een sequentie wel of niet voldoet aan elk van deze kwaliteitsparameters wordt weergegeven aan de hand van een kleurencode. Sequenties die groen kleuren zijn OK. Sequenties die oranje kleuren zijn twijfelachtig. Sequenties met een rode kleur, worden niet goedgekeurd. Bidirectionele veranderingen ten opzichte van de referentiesequentie worden nagekeken in Alamut v1.5 en gerapporteerd. [28]

37

Figuur 16: Voorstelling elektroferogram

2.7.

High Resolution Melting

2.7.1. Principe HRM is een sensitieve gen-scanning methode, gebaseerd op heteroduplex analyse, die wordt gebruikt om de aanwezigheid van mutaties en SNPs op te sporen. In eerste instantie amplificeert men een specifiek PCR-fragment via RT-PCR-reactie. Na de RT-PCR-reactie wordt het amplicon onderworpen aan de HRM-analyse. De HRM-methode is een methode met verscheidene voordelen: Er zijn slechts kleine hoeveelheden reagentia nodig (20 l reactievolume); Er is slechts een kleine hoeveelheid staal nodig (HRM-analyse direct na PCR); Het is een simpele en snelle techniek om de aanwezigheid van mutaties op te sporen; Een snelle optimalisatie is mogelijk; Hoge reproduceerbaarheid; Het heeft een hoge nauwkeurigheid en sensitiviteit; De HRM-analyse wordt uitgevoerd in een gesloten systeem (minder kans op crosscontaminatie); Het PCR-product van de HRM-analyse kan gebruikt worden om een BigDye Cycle Sequencing-reactie op uit te voeren. [29] [30] Een RT-PCR-reactie is identiek aan een gewone PCR-reactie met als extra voordeel dat men de reactie kan volgen in de tijd. Om de PCR-reactie in real time te kunnen volgen, wordt er aan de Master Mix een fluorescerende dye Resolight toegevoegd. Resolight heeft enkel affiniteit voor ds DNA en satureert deze ook volledig wanneer het in overmaat wordt toegevoegd. Tijdens de amplificatie nestelt de fluorescente dye zich in de ds DNA streng. Naarmate er meer kopijen van het te amplificeren DNA fragment gevormd worden, stijgt de fluorescentie.

38

Aan het einde van de PCR-reactie kan nagegaan worden of de PCR efficint verlopen is. Dit impliceert een Cross point (Cp) -waarde - de waarde waarop de fluorescentie de achtergrond overstijgt - beneden de 30 cycli en een sigmodale amplificatie, waarbij de PCR-reactie een mooi plateau bereikt met behoorlijk fluorescentieniveau. Cp-waarden boven de 30 kunnen wijzen op een te kleine hoeveelheid DNA in het reactievolume, een slechte kwaliteit van het DNA of aspecifiek geamplificeerde artefacten. [31] Voor HRM analyse zijn de amplicons best niet langer dan 350 bp om maximum sensitiviteit in mutatiedetectie te garanderen. In theorie zou men een SNP tot op 1 nucleotide van de primer moeten kunnen detecteren. Deze gevoeligheid en de algenen mutatiedetectiegevoeligheid daalt aanzienlijk voor langere PCR-fragmenten. In het verleden is al gebleken dat een SNP die te dicht bij de F of R primer ligt (i.c; 9 NT), niet konden worden gedetecteerd via HRM. Om di en dus vals negatieve resultaten te vermijden, kan men ofwel primers voldoende intronisch ontwikkelen (minimum 50nt van intron-exon boundaries) of de HRM-reactiecondities gevoeliger instellen (oa. via tragere renaturatie en/of meer metingen per stijgende C tijdens denaturatie). Het is ook heel belangrijk om tijdens de PCR-reactie een NTC mee te nemen om eventuele DNAcontaminatie op te sporen. De HRM methode verloopt steeds volgens hetzelfde patroon, dat hieronder wordt weergegeven: Pre-incubatie bij 95C voor 10 (1 cyclus); Amplificatie (45 cycli); HRM-analyse (1 cyclus); Koeling: 40C, 1 (1 cyclus).

Figuur 17: Stappen HRM-analyse

39

Tijdens de pre-incubatie op 95C wordt het Taq pol geactiveerd en denatureert het ds DNA fragment. In de 2de stap van het proces vindt de amplificatie plaats, die uit 3 stappen bestaat. De denaturatie-stap van 10 op 96C zorgt ervoor dat zowel het DNA fragment als de primers ss zijn. Tijdens de annealing-stap van 15 zullen de primers binden aan de complementaire sequenties in het ss DNA fragment. Als laatste vindt de extensie plaats op 72C voor 15. De primers zullen nu verlengd worden aan het 3-uiteinde. De 3de stap in het proces is de HRM-analyse. Eerst is er een denaturatie-stap van 1 op 95C waarbij de gevormde ds DNA fragmenten denatureren. Bij daling van de temperatuur tot 40C worden de homo- en heteroduplexen gevormd (zie verder). Nadien stijgt de temperatuur snel naar 65C in 28.4 waarna de temperatuur zeer geleidelijk aan klimt tot 96C. Tijdens deze stap, welke ongeveer 15 in beslag neemt, wordt de fluorescentie gemeten. [32] Om minieme verschillen in DNA-sequenties waar te nemen moet men spiken met een controle staal, waarvan de DNA-sequentie gekend is. Van dit controlestaal wordt 5 ng DNA (1l van 5 ng/l) toegevoegd aan de reactie-mix ten opzichte van 20 ng patint DNA (4 l van 5ng/ l). Tijdens de denaturatie-stap van de HRM-analyse zullen zowel het ds DNA van het patint staal als van het controle staal denatureren. Tijdens de afkoeling naar 40C zullen de ss DNA fragmenten van het patinten staal en het controle staal ad random met elkaar basenparen. Op die manier worden DNA-duplexen gevormd. Als het patintamplicon niet verschilt van het controle-amplicon krijgt men enkel de vorming van homoduplexen. Van zodra patint- en controle-amplicon van elkaar verschillen worden heteroduplexen gevormd. In de heteroduplexen is complementaire basenparing niet mogelijk op de mutatie of SNP posities, waardoor de HRM-dye niet kan intercaleren op die plaats.

40

DNA with heterozygote SNP

PCR

C G

T A

C G Denaturation reannealing + Intercalating fluorescent dye T A C A T G

C G Increasing temperature T A C A T G

C G T A

+ ...
Figuur 18: Principe HRM methode

Tijdens de laatste stap van de HRM-analyse wordt de temperatuur geleidelijk aan opgedreven naar 96C waardoor de DNA-duplexen denatureren tot ss DNA. De HRM-dye komt vrij wat resulteert in een daling in fluorescentie. Heteroduplexen, waarbij op sommige plaatsen geen basenparing is, zullen sneller denatureren en een verschillend denaturatieof smeltpatronen vertonen dan homoduplexen. Dit verschil kan na verdere analyse worden waargenomen als er ander smeltpatroon.

Figuur 19: Analyse smeltpatroon van een PCR fragment na HRM

Omdat HRM een zeer gevoelige techniek is, wordt er gewerkt in een reagentia- en DNA laminaire flow. In de reagentia flow worden alle reactie mixen gemaakt. In de DNA flow doet men alle DNA-manipulaties en voegt men de NTCs toe.

41

2.7.2. Reagentia Master Mix 2x (stockconcentratie) 1x (werkconcentratie) (Roche Diagnostics) bestaande uit: FastStart Taq DNA polymerase (gebruikt bij hot start PCR), i.e., een chemisch gemodificeerde vorm van het thermostabiele-recombinante Taq DNA polymerase, die wordt geactiveerd bij 95C tijdens de pre-incubatie en inactief is bij temperaturen tot 75C. Hierdoor worden minder aspecifieke producten gevormd en stijgt de specificiteit en sensitiviteit van de RT-PCR-reactie bijgevolg; 2x reactiebuffer (samenstelling onbekend); dNTP mix (dATP, dUTP, dCTP en dGTP); High Resolution Melting Dye (Resolight); De Master Mix wordt best bij -15C - 25C en uit het licht bewaard; Vortex de Master Mix zeer goed voor gebruik

MgCl2 25mM (stockconcentratie) 1,0mM 3,5mM (werkconcentratie) (De concentratie MgCl2 in de reactiemix is afhankelijk van exon tot exon. De optimale concentratie moet experimenteel onderzocht worden); H2O (een bepaalde hoeveelheid water is nodig om het eindvolume op 20 l te krijgen); Primers (Voor deze techniek is specifieke amplificatie zeer belangrijk. Primerconcentratie is dus best tussen de 0,1-0,3 M elk. Meestal worden concentraties van 0,2 M gebruikt).

2.7.3. Protocol 2.7.3.1. Oppuntstelling RT-PCR-reactie Maak test-DNA verdunning van 5ng/l; Maak MgCl2-verdunningen; Maak reactiemix (steeds overmaat) (zie tabel 4); Voeg per rij telkens een andere MgCl2-concentratie toe; Verdeel 12.2 l reactie mix uit in de welletjes voor de NTCs en 5 L H2O voor de helft van de NTCS; Voeg de juiste hoeveelheid test-DNA toe aan de reactiemix; Verdeel 17.2 l reactiemix uit in welletjes voor het test-DNA; Voeg aan de overige NTCs 5 l H2O toe (in de DNA-laminaire flow);

42

Sluit de plaat af met de LightCycler 480 Sealing Foil; Draai de plaat kort af (short spin: 10 sec aan 2000 g); Zet plaat in LightCycler 480 (Roche) en start het RT-PCR programma; Analyseer de resultaten aan de hand van de LightCycler 480 Gene Scanning Software.

Tabel 4: Samenstelling reactiemix HRM

reagentia. mastermix(x) 25 mM MgCl2 H20 totaal reactiemix 2,5 M primermix spike DNA test DNA totaal

stockconc. 2 25

userconc. 1 2,5

1x 10 2 1,4 13,4

2,5 M

200 nM 5 ng/l 5 ng/l

1,6 1 4 20

2.7.3.2. Scanning patinten Maak DNA verdunningen; Maak reactiemix (steeds overmaat); Verdeel 15 L reactiemix uit in de welletjes voor de NTCs en 5 L H2O voor de helft van de NTCs; Voeg juiste hoeveelheid spike DNA toe aan reactiemix; Verdeel 16 L reagentia mix met spike DNA uit in welletjes voor het test-DNA; Voeg aan elke well 4 L patint-DNA toe; Voeg aan de overige NTCs 5 l H2O toe (in de DNA-laminarie flow); Sluit de plaat af met de LightCycler 480 Sealing Foil; Draai de plaat kort af (short spin: 10 sec aan 2000 g); Zet plaat in LightCycler 480 (Roche) en start het RT-PCR + HRM programma;

43

Analyseer de resultaten aan de hand van de LightCycler 480 Gene Scanning Software.

2.7.4. Analyse Nadat het volledige programma doorlopen is, worden de resultaten geanalyseerd met de LightCycler 480 Gene Scanning Software. Bij een oppuntstelling wordt er eerst gekeken bij welke MgCl2-concentratie de beste PCRreactie curve gevormd wordt. Elke PCR-reactie heeft namelijk een ideale concentratie aan MgCl2 nodig aangezien enkel nucleotiden, gecomplexeerd met Mg2+-ionen, kunnen gebruikt worden als substraat voor de groeiende DNA-keten. Ook het FastStart Taq DNA pol heeft een bepaalde hoeveelheid MgCl2 nodig om zijn productiviteit en betrouwbaarheid te vrijwaren. [33] Nadien wordt via gelelektroforese nagegaan of de amplificatie specifiek was. Wanneer men positieve NTCs heeft, worden deze enderzijds mee op gel geladen om mogelijke PCR contaminatie te onderscheiden van mogelijke primer-dimeren.

Figuur 20: Tm calling

Anderzijds kan men de specificiteit van de RT-PCR-reactie ook controleren via een RTPCR smeltcurve met behulp van Tm-calling. Deze Tm-calling is een grafische voorstelling van de fluorescente veranderingen wanneer ds DNA overgaat naar ss-vorm. Bij deze T mcalling kan men nakijken of NTCs, die fluorescent signaal geven, het resultaat zijn van PCR-contaminatie dan wel primer-dimeren. Figuur 20 geeft een voorbeeld van een T mcalling. De grote piek stelt het geamplificeerde DNA-fragment voor. De klein piek geeft de smeltcurve van primer-dimeren weer. [34] Wanneer men op de patinten-stalen een HRM-analyse wil uitvoeren, slecteert men een

44

Gene Scanning analyse in de Lightcycler software. Hierbij wordt gestart men een normalisatie op de x-as. Men stelt de pre- en post-melt marges in zo dicht mogelijk tegen de eigenlijke smeltcurve. Op deze manier wordt de pre- en post-melt fluorescentie voor alle verschillende stalen in de normalisatie-regio gelijkgesteld op 100% en respectievelijk 0% (figuur 21). Nadien voert men een normalisatie uit op de y-as. Bij deze normalisatie wordt de threshold op 5% gezet, omdat op het einde van een smeltcurve de miniemste verschillen het best waar te nemen zijn (figuur 22). Wanneer deze stappen doorlopen zijn, worden dezelfde types smeltcurves samen gegroepeerd. Een difference plot, welke de differentiaal is van de genormaliseerde smeltcurve, visualiseert kleine verschillen in smeltcurven beter (figuur 23). Stalen met een verschil in basensequentie ten opzichte van het gespikte controle-DNA, die ook als basis curve wordt geselecteerd, zullen een ander smeltpatroon geven dan het controlestaal met enkel het controle-DNA.

Figuur 21: Normalisatie op de x-as

Figuur 22: Normalisatie op de y-as

Figuur 23: Difference plot

Na de HRM-analyse zal het afwijkend smeltpatroon in de patint-stalen verder geanalyseerd worden en de mogelijke mutaties en/of SNPs gedentificeerd worden via directe nucleotide sequencing.

45

3. 3.1.

Resultaten Sequencing van SCN5A voor vier indexpatinten

Het eerste deel van de stage bestond uit de directe nucleotide sequentiebepaling van SCN5A voor 4 indexpatinten die allen een typisch BrS ECG hebben. De SCN5A PCR en sequencing reactiecondities stonden al op punt voor alle exonen. De 28 exonen en exonintron boundaries van SCN5A worden aan de hand van 31 PCRs volledig 'gecoverd'. Alle PCRs leverden onmiddellijk specifiek en voldoende PCR product op. Alle gelgecontroleerde PCR-producten werden bidirectioneel gesequeneerd. De bekomen sequenties werden gevalueerd volgens de hierboven beschreven kwaliteitsparameters (zie 2.4.6.) 178 sequencing reacties voldeden onmiddellijk aan alle kwaliteitsparameters. Voor 70 reacties werd teveel achtergrond waargenomen en werd de sequencingreactie opnieuw uitgevoerd. Na een nieuwe kwaliteitsparameterevaluatie werden finaal al de sequenties manueel gelezen en nadien gecontroleerd in Variant Reporter. Tijdens de directe nucleotide sequentiebepaling zijn er in 6 van de 28 exonen SNPs gevonden. Onderstaande tabel geeft een overzicht van de gevonden SNPs weer. De frequentie en impact van de SNPs werd nagegaan in Alamut v1.5. Alle gedentificeerde SNPs hebben geen invloed op het SCN5A proteine, aangezien het ofwel stille base substituties zijn die niet resulteren in een aminozuur verandering , ofwel diep-intronisch voorkomen zonder daar een splice-site te creeren. In bijlage 1 vindt u een grafische voorstelling van de gevonden SNPs.

Tabel 5: Overzicht SNPs

Initialen patinten

SCN5A regio Genotype c.87 A>G (homozygoot) c.87 A>R (heterozygoot) c.2788-6 C>Y (heterozygoot) c.2788-6 C (wildtype) c.3183 A>R (heterozygoot) c.3183 A (wildtype)

SNP Frequentie f=0,633 f=0,333 f=0,043 f=0.957 f=0,255 f=0,021

Allel1/ Allel2 G/G G/A T/C C/C G/A A/A

C.S./Z.W./V.P.P. Exon 2 S.S. C.S. Exon 2 Exon 17A

Z.W./S.S./V.P.P. Exon 17A C.S./S.S. Z.W. Exon 17B Exon 17B

46

Initialen patinten V.P.P. C.S. Z.W./S.S. V.P.P. C.S./Z.W. S.S./V.P.P. C.S./S.S. Z.W./V.P.P. C.S./S.S. Z.W. V.P.P.

SCN5A regio Exon 17B Exon 23 Exon 23 Exon 23 Exon 24 Exon 24 Exon 25 Exon 25 Exon 28B Exon 28B Exon 28B Genotype c.3183 A>G (homozygoot) c.4245+82 A (wildtype) c.4245+82 A>R (heterozygoot) c.4245+82 A>G (homozygoot) c.4299+116 G (wildtype) c.4299+116 G>R (heterozygoot) c.4437+65 G (wildtype) c.4437+65 G>R (heterozygoot) c.5457 T>Y (heterozygoot) c.5457 T (wildtype) c.5457 T>C (homozygoot)

SNP Frequentie f=0,723 f=0.525 f=0,356 f=0,119 f=0.617 f=0,362 f=0.830 f=0,106 f=0,400 f= 0.483 f=0,117

Allel1/ Allel2 G/G A/A G/A G/G G/G G/A G/G G/A T/C T/T C/C

Tijdens de directe nucleotide sequentiebepaling werd er bij 1 indexpatint, S.S., een heterozygote base-substitutie gevonden op positie c.4300-2 A>T. Deze base-substitutie bevindt zich in de splice-acceptorsite van intron24-exon 25.

Figuur

24:

Voorstelling

heterozygote

base-

substitutie c.4300-2 A>W

Verschillende bronnen werden geraadpleegd om uit te zoeken of deze base-substitutie de causale mutatie is van BrS. In databasen die polymorfismen en mutaties registeren en continu updaten, zoals Alamut v1.5 en Biobase, was de mutatie niet terug te vinden.

47

Daarna werd via de internet tool Inherited Arrhytthmias Database en via PubMed nagegaan of de mutatie daar al was beschreven. Omdat de gedetecteerde mutatie niet werd teruggevonden, werd aan de hand van de Mutation Properties toepassing in Alamut v1.5 het effect van deze base-substitutie op de splice-site voorspeld. De verandering van Adenine (A) naar Thymidine (T) heeft als gevolg dat de splice-site niet meer functioneel is. Volgens de splice-site predictie programmas, SpliceSiteFinder like, MaxEnscan, NNSplice en GeneSplicer kunnen de splice-enzymen eventueel een alternatieve, out-of-frame herkenningssequentie gebruiken, verder in exon 25 gelegen. Indien de splicing hier zou gebeuren, gaat er een deel van de coderende sequentie verloren met een frame-shift tot gevolg. Hierdoor komt de normale vorming van het INa ionenkanaal meer dan waarschijnlijk in het gedrang, waardoor ook de normale ionenstroom wordt verstoord. Onderstaande figuur geeft weer wat het effect is van de base-substitutie op de splice site.

Figuur 25: Effect mutatie

Aangezien dit enkel predictie-tools zijn, en op die manier niet kon worden aangetoond of de mutaties wel degelijk causaal is, werd overgegaan tot het testen van beschikbare stalen van een aantal rechtstreekse familieleden van S.S. Sommige familieleden hebben immers een type I ECG en/of positieve Ajmaline-test indicatief voor BrS, terwijl anderen negatief zijn voor beide testen en dus vermoedelijk geen BrS patinten zijn.

48

Onderstaande figuur geeft de stamboom van de familie weer.

1919 - 1989
70

1929
81

Ferdinand F.W. Type I ECG: ? Weyns

Ajmalinetest: ?

Ajmalinetest: ?

Maria M.L. Type I ECG: ? Leppens

1954 Jef Anita J.S. A.W. Type I ECG: - Weyns Type I ECG: + Sterckx
Ajmalinetest: -

1957
52

1959 Fernand F.W. Type I ECG: + Weyns

1960
49

Ajmalinetest: +

Luk Martine L.V.K. M.W. Type I ECG: ? Type I ECG: Van Weyns Ajmalinetest: ? Ajmalinetest: Kets

Ajmalinetest: +

Erna E.D.L Type I De ? ECG: Ajmalinetest: ? Ajmalinetest: ?. Loose

Werner W.W. Type I ECG: ? Weyns

1978

1983

1986
23

1987 Tom T.V.K. TypeVan ? I ECG: Ajmalinetest: ? Kets Jan J.W. Weyns

1990
19

1993
17

Stijn Maarten Pieter S.S. M.S. P.J.S. Type I ECG: + Sterckx + Sterckx Type I ECG: Jan Type I ECG: Ajmalinetest: ? Ajmalinetest: ? Ajmalinetest: Sterckx

Type I ECG: + Type I ECG: Ajmalinetest: + Ajmalinetest: -

Wilfried W.W. Weyns

Marco M.W. Weyns

Type I ECG:Ajmalinetest: -

Legende: : man, niet aangetast : vrouw, niet aangetast : man, aangetast : vrouw, aangetast

Figuur 26: Stamboom van de familie van de indexpatint S.S.

Links onderaan in de stamboom bevindt zich de indexpatint, S.S. Zowel zijn broers als ouders werden ook genetisch getest. En van de broers, M.S., heeft evenwel de mutatie. De andere broer, P.J.S., heeft de mutatie niet. Bij de ouders, J.S. en A.W., werd de mutatie enkel bij de moeder teruggevonden: de mutatie is dus overgerfd langs moederskant. Nadien werden de broers en zus van A.W. ook genetisch getest. M.W. is niet aangetast met de mutatie, maar F.W. wel. Van W.W. zijn geen gegevens gekend. Ook de zoon van F.W., J.W., is aangetast met de mutatie. Alle leden van de familie waarbij de mutatie is bevestigd, hebben ook een Type I ECG en/of een posititeve Ajmalinetest (zie 1.5.3.). In de andere familieleden die type I ECG en Ajmaline negatief zijn, werd de mutatie niet gedetecteerd. Hieruit kan men afleiden dat de heterozygote base-substitutie ook de causale mutatie is van het BrS, dat autosomaal

49

dominant wordt overgerfd.

3.2.

SCN5A RT-PCR oppuntstelling & HRM pre-validatie

3.2.1. SCN5A RT-PCR oppuntstelling Een HRM analyse kan maar efficint verlopen als een optimaal RT-PCR product wordt gegenereerd. Hierbij wordt gestreefd naar sensitieve en specifieke RT-PCRs. Sensitiviteit wordt gevalueerd op basis van bekomen Cp-waarden < 30 en fluorescentie. De specificiteit wordt beoordeeld op basis van de smeltcurve (Tm-calling) en agarose gelelektroforese. De HRM analyse voor 28 exonen van SCN5A werd in eerste instantie op punt gesteld door een vorige student met primers in-house ontwikkeld via de Primer Blast software. Onder verschillende uitgeteste condities, bleek op basis van de best bekomen sensitiviteit en specificiteit, dat voor 13 exonen beter nieuwe primers werden ontwikkeld. In dit werk werden de nieuwe oppuntstellingen uitgevoerd voor de RT-PCRs op 13 SCN5A exonen, wat overeenkomt met 14 RT-PCR-reacties (nl. exon 7, 9, 12b, 14, 16a, 17a, 17b, 19, 20, 21 22, 25, 27, 28e). Aangezien intussen een publicatie over SCN5A HRM analyse was verschenen in de literatuur [35], werden de primersequenties voor de oppuntstelling van de overige exonen, na controle op correctheid, overgenomen uit het artikel. Voor de oppuntstelling van de RT-PCR-reactie voorafgaand aan de HRM-analyse van SCN5A werkt men steeds via een bepaald patroon. De eerste stap in de oppuntstelling is het uitvoeren van een MgCl2-titratie van 1,5mM tot 3,5mM met een interval van 0,5mM voor elke RT-PCR-reactie. De MgCl 2-concentratie is een belangrijke component in een RT-PCR-reactie. Enkel dNTPs, gecomplexeerd met MgCl2 worden ingebouwd in de groeiende matrijs. Ook het Taq pol heeft een welbepaalde concentratie aan MgCl2 nodig om zijn polymerase activiteit ten opzichte van de DNA-matrijs ideaal uit te voeren. Er werd gestart met een touchdown Ta gaande van 70C60C met een daling van 0,5C/cyclus. Afhankelijk van het verloop en de specificiteit van de RT-PCR-reactie werden er verdere stappen ondernomen. Bijlage 2 bevat een overzicht van de verschillende stappen in de oppuntstelling van de RT-PCR-reactie voor SCN5A. Het te doorlopen stappenplan wordt aan de hand van enkele PCRs voor exonen 16 (16a), 17 (17a en 17b) en 19 hieronder nader verklaard.

50

Tabel 6 geeft de indeling van een 96-well plaat voor een MgCl2 RT-PCR-optimalisatie weer. Tabel 7 geeft de samenstelling van de reactiemix, gebruikt bij de oppuntstelling van de RTPCR-reacties weer. Elke RT-PCR wordt beoordeeld op gevoeligheid (op basis van Cp-waarden < 30 en fluorescentie) en specificiteit (op basis van Tm-calling en agarose gelelektroforese).

Tabel 6: RT-PCR-optimalisatie: MgCl2-titratie ter bepaling van de ideale concentratie

Tabel 7: RT-PCR-optimalisatie: reactiemix

reagens mastermix (x) 2,5M primermix H20 DNA totaal reactiemix 25mM MgCl2 totaal

stockconc. 2 2,5

userconc. 1 200 nM

1x 10 1,6 0,6

Nx

5 ng/l

5 17,2

25

1,5-3,5mM

2,8 20

N= aantal stalen

51

Figuur 27: Bepaling optimale MgCl2-concentratie voor exon 16a (rode curve: 2.0mM MgCl2; groene curve: 2.5mM MgCl2; blauwe curve: 3.0mM MgCl2

Na de MgCl2-titratie voor exon 16a bleek een concentratie van 2,0mM MgCl2 optimaal te zijn. De PCR-reactie komt bij deze MgCl2 concentratie op bij een Cp-waarde van 24,40 en bereikt de hoogste fluorescentie. Bovendien zal bij stijgende concentratie aan MgCl 2 de PCR-reactie een lager fluorescentie-plateau bekomen. Nadien wordt om de specificiteit na te gaan een Tm-calling uitgevoerd (figuur 28) en de 2 meest ideale MgCl2-concentraties op een 3% agarosegel geanalyseerd. In figuur 28 kan men zien dat de amplificatie van exon 16a resulteert in 1 hoge piek, wat wijst op een specifieke amplificatie. De lage rode piek is de smeltcurve van een NTC en stelt primer-

Figuur 28: Tm-calling voor exon 16a (rood) en 17a (groen) bij touchdown van 70C 60C

dimeer voor. De primer-dimeren zijn veel korter dan het PCR product waardoor ze al op een lagere temperatuur zullen denatureren. De vorming van primer-dimeren bij de NTC werd bevestigd via agarosegel elektroforese (zie figuur 30). Deze toont ook aan dat voor de

52

controlestalen voor exon 16a bij een MgCl2-concentratie van 2,0mM een specifiek PCRbandje van de correcte lengte wordt verkregen, wat wijst op een specifieke amplificatie (figuur 30). Exon 17a levert bij de MgCl2-concentraties van 2,0mM en 2,5mM PCR-producten van verschillende lengten op. Dit wijst op een aspecifieke amplificatie (zie figuur 30). Dit is ook te zien in de Tm-calling van exon 17a (figuur 28). Er wordt een lage groene curve gevormd bij meerdere smelttemperaturen. Het specifieke fragment is echter wel geamplificeerd maar in een veel lagere hoeveelheid dan bv. exon 16a door de vorming van aspecifieke producten. Om deze aspecifieke bandjes weg te werken, werd de Ta van de touchdownPCR verhoogd naar 72C65C met een daling van 0,5C/cyclus. Dit gaf echter ook nog steeds aspecifieke PCR-producten. Daarom werd in een volgende stap de T a ingesteld op 72C zonder touchdown-Ta. Een Ta van 72C gaf goede resultaten, zowel voor de Tmcalling (figuur 29) als voor de gelelektroforese (figuur 31). De Tm-calling laat 2 smeltcurven zien, wat kan wijzen op 2 rele smeltdomeinen in het amplicon of op aspecificiteit. Aangezien de gelelektroforese voornamelijk 1 dominante specifieke PCR-band vertoont met een te verwaarlozen achtergrond, nemen we aan dat het hier om een PCR-product bestaande uit 2 smeltdomeinen gaat.

Figuur 29: Tm-calling voor exon 17a bij Ta van 72C

53

Ex17a 2.0 mM

Ex17a 2.5 mM

Ex16a 2.0mM

Ex16a 2.5mM

Ex17a 2.0 mM

Figuur 30: Agarosegel-elektroforese van touchdown PCR Ta 70C 60C

Figuur 31: Agarosegel-elektroforese van touchdown PCR Ta 72C

De RT-PCR-reactie van de 2 laatste RT-PCRs op de 96-well plaat, exon 17b en exon 19 kwam veel te laat op. Hierdoor werd de PCR plateau fase niet meer bereikt, wat cruciaal is voor een betrouwbare HRM-analyse (zie figuur 31). Dit kan eventueel te wijten zijn aan het feit dat de touchdown Ta 70C60C te hoog is voor de primers om hun complementaire sequentie te vinden. Vervolgens wordt de touchdown Ta verlaagd naar 65C55C met een daling van 0,5C/cyclus.

Ex17a 2.5 mM

MW5 ladder

Log2 ladder

Ex16a NTC

54

Figuur 32: RT-PCR-reactie exon 19 via touchdown Ta 65C55C

Een touchdown Ta van 65C55C met een daling van 0,5C/cyclus gaf ook geen goede resultaten waardoor de Ta nog werd verlaagd naar 60C50C met een daling van 0,5C/cyclus. Ook dit gaf geen goede resultaten. Aangezien bij instelling van een nog lagere Ta de kans op aspecifieke priming steeds groter wordt, werd overgegaan tot het ontwerpen van nieuwe primers. Na het doorlopen van het stappenplan voor de oppuntstelling van de RT-PCRs van alle overige 13 SCN5A exonen, werd voor volgende exonen aan de hand van van de in de literatuur verschenen primers de RT-PCR-reactie finaal oppuntgesteld: exon 9, 16a, 17a, 21, 22,25 en 27 (zie bijlage 3). Voor exon 7, 12b en 14 werd teruggegrepen naar de resultaten van de vorige student. Deze RT-PCRs waren toen, ondanks de specifieke amplificatie, initieel afgekeurd omdat Cp-waarden net boven de 30 gegenereerd werden. Aangezien de destijds bekomen sensitiviteit en/of specificiteit beter was dan de huidige, werden voor voormalige RT-PCRs Cp-waarden <32 aanvaard op voorwaarde dat een effectieve RT-PCR plateau-fase bereikt werd. De RT-PCR-reactie kon niet op punt worden gesteld met de primers uit de literatuur voor exon 17b, 19, 20, 28d en28e. Voor deze RT-PCR-reacties werden nieuwe primers ontwikkeld. Hiervoor werd gebruik gemaakt van een intussen door het labo nieuw aangekocht software pakket, specifiek voor primerdesign voor HRM-analyse, nl. Light Scanner.v1.0 software. Met deze nieuw ontwikkelde primerparen kon finaal nog enkel 1 RT-PCR voor exon 28d oppuntgesteld worden.

55

In bijlage 3 vindt men een overzicht van de ideale condities voor elk exon. 25 RT-PCRreacties waren al oppuntgesteld door een vorige student. 7 nieuwe RT-PCR-reacties werden in dit werk oppuntgesteld met de in de literatuur beschreven primers. Voor 6 RTPCR-reacties (exon 17b, 19, 19bis, 20, 28d en 28e) werden nieuwe primers ontwikkeld, waarbij enkel voor RT-PCR 28d aanvaardbare resultaten bekomen werden. Voor de overige 4 RT-PCRs werd na 3 tot 4 pogingen van primerdesign en RT-PCR optimalisatie geopteerd om geen gen-scanning via HRM-analyse uit te voeren voorafgaand aan directe nucleotide sequencing.

3.2.2. SCN5A HRM pre-validatie exon scanning Tijdens de directe nucleotidesequencing van SCN5A op de vier indexpatinten uit 3.1., werden 7 SNPs gevonden in 6 exonen. Om de gevoeligheid van de SCN5A HRM-analyse te testen, werd nagegaan of deze SNPs ook wel degelijk konden gedetecteerd worden met de oppuntgestelde RT-PCRs en HRM-analyse. Aldus werden de DNA-stalen van deze 4 indexpatinten onderworpen aan een exon-specifieke HRM-analyse, met name enkel voor de 6 hoger beschreven exonen (zie tabel 5). De DNA-stalen van de patinten en een controlestal werden steeds in duplo getest en gespiked met controlestaal.

3.2.2.1. Exon 2: SNP c. 87 A>G Figuur 33 toont de 2 vormen van de SNP. De rode curves stellen de heterozygote SNP detectie voor. De blauwe curves, waaronder ook het controle DNA, vertegenwoordigen de homozygote SNP. Hieruit kan men besluiten dat de HRM-analyse deze SNP kan detecteren. De aanwezigheid van deze SNP heeft ook geen invloed op de correcte eiwitvorming, aangezien het een synonieme basesubstitutie is, die niet resulteert in een aminozuurverandering Database. volgens Alamut en de internet tool Inherited Arrhytthmias

56

Figuur 33: Exon scanning voor exon 2

3.2.2.2. Exon 17 (intron 16): SNP c. 2788-6 C>T De HRM-PCR 17A (voor het upstream deel van exon 17) resulteert in een HRM-smeltcurve met 2 smeltdomeinen. Wanneer men de pre- en post-melt marges net buiten deze 2 smeltdomeinen instelt, kan men de SNP met onvoldoende gevoeligheid detecteren (figuur 34). Er worden wel afwijkend smeltpatronen waargenomen, maar onvoldoende opdat de analyse software ze apart zou groeperen. (figuur 35)

Figuur 34: Exon scanning: normalisatie tussen 1 en 2 smeltdomein exon 17a

57

Figuur 35: Exon scanning: 'Difference plot' voor 1 en 2 smeltdomein exon 17a

Echter, wanneer men de post-melt marge instelt na het 1ste smeltdomein en dus enkel het 1e smeltdomein analyseert (figuur 36), kan de SNP wel opgepikt worden (figuur 37).

Figuur 36: Exon scanning: normalisatie binnen 1 smeltdomein exon 17a

Figuur 37: Exon scanning: difference plot voor 1 smeltdomein exon 17a

De rode curves stellen de heterozygote SNP-detectie voor. De blauwe curves 58

vertegenwoordigen de wildtypes. Deze SNP staat niet beschreven in de Inherited Arrhytthmias Database. Volgens Alamut is het een gekende SNP die geen invloed heeft op de splicing.

3.2.2.3. Exon 17: SNP c. 3183 A>G Voor het B-deel van exon 17 kon geen HRM-analyse uitgevoerd worden, aangezien er geen optimaal primerpaar gevonden werd, waardoor de RT-PCR-reactie niet geoptimaliseerd werd. Voor deel B moet men direct overgaan tot een directe nucleotide sequencing. Volgens de internet tool Inherited Arrhytthmias Database heeft deze synonieme SNP geen effect op de correcte vorming van het eiwit.

3.2.2.4. Exon 23 (intron 23): SNP c. 4245+82 A>G Tijdens de directe nucleotidesequencing van exon 23 werd bij de 4 indexpatinten de homozygote en heterozygote vorm van de SNP alsook wildtype op positie c.4245+82 teruggevonden. Tijdens de HRM-analyse konden deze vormen niet van elkaar gescheiden worden wanneer men de pre- en post melt marge instelde voor en na de 2 smeltdomeinen. Wanneer de pre melt marge werd ingesteld tussen de 2 smeltdomeinen en dus na het 1 e smeltdomein, slaagde men er wel in de verschillende vormen van de SNP op te sporen (figuur 38 ). De groene en rode curves stellen respectievelijk de homozygote en heterozygote SNP voor. Het controle DNA werd als basislijn geselecteerd en vormt samen met de wildtypen de blauwe curven (figuur 39). Volgens Alamut 1.5 en de Inherited Arrhytthmias Database heeft deze SNP geen effect op de correcte vorming van het eiwit.

59

Figuur 38: Exon scanning: normalisatie exon 23

Figuur 39: Exon scanning voor exon 23

3.2.2.5. Exon 24 (intron 24): SNP c. 4299+116 A>G Deze SNP kan men niet opsporen via HRM-analyse aangezien de SNP-positie buiten de reikwijdte van het HRM-primerpaar ligt. De SNP is bekend in Alamut en heeft geen invloed op de SCN5A protene-vorming. De SNP staat niet beschreven in de Inherited Arrhytthmias Database. 3.2.2.6. Exon 25 (intron 25): SNP c. 4437+65 A>G Deze SNP kan men eveneens niet opsporen via de oppuntgestelde HRM-analyse 60

aangezien de SNP-positie buiten de reikwijdte van het HRM-primerpaar ligt. De SNP is bekend in Alamut en heeft geen invloed op de SCN5A protene-vorming. De SNP staat niet beschreven in de Inherited Arrhytthmias Database. 3.2.2.7. Exon 28: SNP c. 5457 T>C Tijdens de directie nucleotidesequencing werd het wildtype, de heterozygote en homoyzgote vorm van de SNP teruggevonden bij de 4 indexpatinten. Ook deze 3 vormen konden opgespoord worden met de HRM-analyse. De rode, de groene en de blauwe curves stellen respectievelijk de heterozygote SNP, de homozygote SNP en het wildtype voor (figuur 40). Volgens Alamut en de Inherited Arrhytthmias Database heeft deze synonieme SNP geen invloed op de correcte vorming van het eiwit.

Figuur 40 Exon scanning voor exon 28c

3.2.3. SCN5A HRM pre-validatie: gen-scanning Aangezien er in het CMG tot op heden onvoldoende indexpatinten via directe nucleotide sequencing onderzocht werden op mutaties in SCN5A, werd de HRM pre-validatie aan de hand van volledige gen-scanning voor 24 van de 28 SCN5A exonen verder uitgevoerd op DNA-stalen van 7 nieuwe index-patinten. Het DNA-staal van indexpatint 4, S.S., waarvoor het SCN5A gen reeds volledig is gesequeneerd, werd ook meegenomen ter controle. De DNA-stalen van de patinten en een controlestaal werden steeds in duplo getest en gespiked met controlestaal. Wanneer er in een exon een afwijkend patroon werd gedetecteerd bij 1 van de patinten werd het specifieke exon verder onderzocht. Zowel de afwijkende als de normale patronen werden aan een bidirectionele nucleotide sequencing onderworpen.

61

3.2.3.1. Exon 2: c.87 A>G Figuur 40 geeft de gen-scanning voor exon 2 weer. Na instellen van de pre- en postmelt marges, werden er 3 verschillende patronen gegenereerd. Na sequencing van de overeenkomstige patinten en het controlestaal bleek dat de HRM-analyse een SNP had opgepikt op positie c. 87, idem aan deze hoger beschreven SNP (zie tabel 5). De groene curves stellen de patinten voor die heterozygoot zijn voor de SNP. De rode curves stellen het wildtype voor. De blauwe curves, waaronder ook het controle DNA, vertegenwoordigen de homozygote SNP. In Alamut 1.5 werd de frequentie van de verschillende vormen van de SNP nagegaan: Homozygoot: f= 0,633; Heterozygoot: f= 0,333; Wildtype: f=0.033

De aanwezigheid van deze SNP heeft ook geen invloed op de correcte eiwitvorming, aangezien het een synonieme basesubstitutie is, die niet resulteert in een aminozuurverandering volgens Alamut en de internet tool Inherited Arrhytthmias Database. Tot op heden beschikt het CMG niet over een wild type voor dit specifieke polymorfisme, wat niet onlogisch is gezien de lage prevalentie.

Figuur 41: Gene scanning voor exon 2

Deze SNP heeft geen invloed op de correcte vorming van het eiwit volgens de internet tool Inherited Arrhytthmias Database

62

Heterozygoot SNP

Homozygoot SNP

Wildtype

3.2.3.2. Exon 10 (intron 9): c. 1141-3 C>A Figuur 41 toont de verschillende smeltpatronen voor exon 10 bekomen na het testen van 8 indexpatinten en 1 controle staal. Na sequencing werd een SNP ontdekt op positie c.1141-3. Deze SNP is bijgevolg gelegen in intron 9. De heterozygote SNP, waaronder het controle staal, wordt weergegeven als een rode curve. De blauwe curves vertegenwoordigen het wildtype. In Alamut v1.5 werd de frequentie van de verschillende vormen van de SNP nagegaan. Heterozygoot: f= 0,234; Wildtype: f= 0,475.

Deze intronisch gelegen SNP heeft geen effect op de splicing en aldus juiste vorming van het eiwit volgens de internet tool Inherited Arrhytthmias Database

Figuur 42: Gene scanning voor intron 9

63

Heterozygoot SNP

Wildtype

3.2.3.3. Exon 12: c. 1673 A>G Na het testen van 8 indexpatinten en 1 controlestaal, gaf de smeltcurve voor exon 12 3 patronen. Na sequencing bleken deze patronen de verschillende vormen van 1 SNP op positie c.1673 voor te stellen. De patinten die homozygoot zijn voor de SNP worden gegroepeerd onder de groene curves. De patinten die heterozygoot zijn voor de SNP worden verzameld onder de rode curve. De wildtypes worden weergegeven als blauwe curves. Het controle staal is wederom heterozygoot voor de SNP. In Alamut v1.5 werd de frequentie van de SNP nagegaan: Homozygoot: f= 0.033; Heterozygoot: f= 0.300; Wildtype: f=0.667.

Deze base-substitutie heeft als gevolg dat er een Arginine in plaats van een Histidine wordt gevormd. Beide aminozuren zijn allebei basische aminozuren. Het effect zal bijgevolg miniem zijn. Deze positie is gekend als een cSNP in de Inherited Arrytthmias Database.

64

Figuur 43: Gene scanning voor exon 12

Homozygoot SNP

Heterozygoot SNP

Wildtype

3.2.3.4. Exon 16: Tijdens de gen scanning van exon 16 (HRM-PCR 16B) werd voor twee verschillende indexpatinten, S.S. en M.S., een ander smeltpatroon opgemerkt. Via directe nucleotide sequentiebepaling werd er geen afwijking gevonden in vergelijking met de referentie sequentie. Uit de positionering van zowel HRM- als sequencing primerparen bleek dat de HRM-primers het sequencing primerpaar veel verder overspannen, omdat voor HRManalyse van exon 16 twee PCRs werden ontwikkeld. Een nieuw sequencing primerpaar, dat het volledige gebied van het 16B HRM-primerpaar covered, werd ontworpen. De sequentie-analyse leverde jammer geen bijkomende info. Het deel waarvan de sequentie nog onbekend was en dat waarschijnlijk de SNP/mutatie bevat, is zeer GC-rijk en bevat bovendieneen repeat regio, waardoor er niet kon doorheen gesequeneerd worden.

65

3.2.3.5. Exon 21: c. 3840+1 G>A en c. 3695 G>A Tijdens de HRM-analyse voor exon 21 werden 3 verschillende smeltpatronen waargenomen. Na bidirectionele sequentiebepaling van de verschillende patronen werden er op 2 verschillende posities base substituties gevonden. Op positie c.3840+1 is er bij 1 patint (V.D.S.M.) een heterozygote base substitutie teruggevonden van G>A die volgens Alamut de splice site teniet doet. De internet tool Inherited Arrhytthmias Database beschrijft deze inderdaad als een BrS causale splice mutatie. Deze basesubstitutie wordt voorgesteld als een groene curve. De rode curves stellen de heterozygote base substitutie voor op positie c.3695, aangetroffen in patint V.S.L. In de internet tool Inherited Arrhytthmias Database wordt deze base substitutie beschreven als een missense mutatie waarbij er een Glutamine in plaats van een Arginine wordt gevormd. De verandering van een basisch polair naar een neutraal polair aminozuur heeft weinig fysico-chemische impact. De invloed op de vorming van het eiwit is moeilijk te voorspellen en aldus ook de ontwikkeling van het BrS. De blauwe curves stellen het wildtype voor, waaronder ook het controle staal.

Figuur 44: Gene scanning voor exon 21

66

Heterozygote splice mutatie c. 3840+1 G>A

Heterozygoot mutatie: c. 3695 G>A

3.2.3.6. Exon 23 (intron 23): 4245+82 A>G Figuur 44 is een voorstelling de verschillende smeltpatronen die na sequencing analyse een SNP in intron 23 blijken te vertegenwoordigen. De rode curve stelt de HRM-analyse voor van de patinten die homozygoot zijn voor de SNP. De blauwe curve stelt de HRManalyse voor van de patinten die heterozygoot zijn voor de SNP, waaronder het controle staal. Een staal dat het wildtype voorstelt, is, werd tot op heden nog niet gevonden in de reeds geteste patinten populatie. Binnen de blauwe curves dient wel een aanzienlijke afwijking ten opzichte van de basiscurve te worden opgemerkt. In de toekomst moet via sequencing worden onderzocht of deze blauwe curves misschien toch het smeltpatroon van een (andere) SNP weergeven, dan wel dat de omliggende G-stretch verantwoordelijk is voor de grotere afwijking binnen de wild types. In Alamut v1.5 is de frequentie van de SNP nagegaan: Homozygoot: f= 0,119; Heterozygoot: f=0,356.

Via Alamut en de internet tool Inherited Arrhytthmias Database kon nagegaan worden dat deze SNP geen invloed heeft op de juiste vorming van het eiwit.

67

Figuur 45: Gene scanning voor exon 23

Homozygoot SNP

Heterozygoot SNP

3.2.3.7. Exon 25 (intron 24): c. 4300-2 A>T De splice mutatie, gevonden tijdens de bidirectionele nucleotidesequencing bij S.S, kon opgepikt worden tijdens de HRM-analyse voor exon 25. De rode curves stellen het HRMpatroon voor van de patint met de splice-acceptorsite mutatie. De blauwe curves stellen de wildtypes voor.

Figuur 46: Gene scanning voor exon 25

68

3.2.3.8. Exon 28: c. 5457 T>C Figuur 46 geeft een voorstelling van de 3 HRM-smeltpatronen voor exon 28. Na sequencing bleken de rode, de groene en de blauwe curves respectievelijk de heterozygote, homozygote SNP en het wildype voor te stellen. In Alamut v1.5. werd de frequentie van de SNP nagegaan: Heterozygoot: f= 0,400; Homozygoot: f= 0;117; Wildtype: f= 0,483.

Aan de hand van Alamut en de internet tool Inherited Arrhytthmias Database kon nagegaan worden dat deze synonieme SNP geen invloed heeft op de juiste vorming van het eiwit.

Figuur 47: Gene scanning voor exon 28

Heterozygoot SNP

Homozygoot SNP

Wildtype

69

4.

Besluit

Deze studie had tot doel de moleculaire diagnose van BrS op termijn mogelijk te maken aan de hand van een high-througput mutatiedetectie platform, nl. HRM analyse. Het gebruik van de HRM analyse zou namelijk toelaten om de diagnose van BrS veel sneller te laten verlopen in vergelijking met de traditionele techniek van de bidirectionele nucleotide sequencing. Om HRM analyse mogelijk te maken, dienden allereerst de 37 RT-PCR-reacties van het SCN5A gen op punt gesteld te worden. Pas nadat de RT-PCR optimalisatie voltooid was, kon overgegaan worden op het testen van de detectiegevoeligheid van de HRM-analyse. Dit moest in de eerste plaats uitgevoerd worden op DNA-stalen van indexpatinten, waarvan .de volledige SCN5A exon en flankerende intron nucleotidesequentie gekend is, en dus alle mogelijke polymorfismen en/of mutaties gedentificeerd zijn. Met betrekking tot de eerste vereiste de oppuntstelling van de 37 RT-PCR-reacties kon beroep worden gedaan op een eerdere poging tot oppuntstelling. Bij deze eerste poging was men er reeds in geslaagd 21 van de 37 RT-PCR-reacties op punt te stellen. Bij de aanvang van het huidige onderzoek werd opnieuw gestart voor de 16 overige RT-PCR- en HRM-analyses. Op basis van primers, beschreven in de literatuur, werd er in geslaagd om 7 van de 16 RT-PCR-reacties verder op punt te stellen. Voor de overblijvende 9 RT-PCRreacties, werden de resultaten van de eerste poging tot oppuntstelling vergeleken met die van de tweede poging met primers uit de literatuur. Uit deze vergelijking bleek dat bij 4 RTPCR-reacties de resultaten van de eerste poging tot oppuntstelling beter en alsnog bruikbaar waren. Voor de overige 5 RT-PCR-reacties moesten nieuwe primers ontwikkeld worden. Hiervoor werd het computerprogramma Light Scanner gebruikt. Met deze nieuwe primers werd in een derde poging n bijkomende RT-PCR-reactie oppuntgesteld. De 4 overblijvende RT-PCR-reacties konden niet op punt worden gesteld tijdens dit onderzoek. Bijgevolg zal men de exonen gelinkt aan deze RT-PCR-reacties niet kunnen onderwerpen aan een HRM-analyse. Voor deze exonen (m.n. 17, 19, 20 en 28) zal men toevlucht moeten blijven nemen in directe nucleotide sequencing. Voor de tweede vereiste beschikken over stalen van indexpatinten met gedenticeerde SNPs en/of mutaties werd het DNA van 4 indexpatinten eerst onderzocht via directe nucleotide sequencing. Bij dit onderzoek werden in totaal 8 basesubstituties gevonden. Zeven bleken gekende SNPs te zijn, terwijl n nog niet beschreven mutatie werd gevonden. Aan de hand van de familiale segregatie van de mutatie, enkel in familieleden die positief zijn voor de klinische diagnostische criteria voor BrS, kon worden aangetoond, dat de gevonden mutatie causaal is voor BrS. 70

Deze aanwezige SNPs en mutatie werden gebruikt als basis voor de HRM-prevalidatie in het kader van detectiegevoeligheid. Voor 4 exonen met SNPs (m.n. 2, 17a, 23, 28b) werden aberrante smeltpatronen opgepikt. Voor 2 van deze 4 exonen bekwam men echter enkel de gewenste gevoeligheid, indien hun tweeledige smeltdomeinen apart geanalyseerd werden. Voor 2 exonen (24, 25) konden de SNPs niet worden gedetecteerd, aangezien deze zich in een gebied bevinden dat niet wordt gecoverd door de HRM-primers. Voor exon 17b stond de RT-PCR-reactie niet op punt en kon dus niet worden overgaan tot HRManalyse. Uit deze resultaten is gebleken dat de HRM analyse althans voor de onderzochte exonen voldoende gevoelig is. Ingeval de PCR uit meerdere smeltdomeinen bestaat, dienen deze ook apart geanalyseerd te worden . Achteraf werd de HRM-detectiegevoeligheid verder onderzocht aan de hand van genscanning voor alle ontwikkelde SCN5A HRM-PCRs dmv van 6 nieuwe indexpatinten. Bij deze 6 patinten werden via HRM analyse in totaal 8 afwijkende smeltpatronen gedetecteerd, welke via sequencing werden gedentificeerd als 6 SNPs en twee mutaties. Deze totale analyse (HRM SCN5A gen scanning + exon-specifieke sequencing) werd uitgevoerd op twee weken tijd, terwijl een sequenicng analyse van alle exonen voor deze 6 patinten waarschijnlijk meer dan een maand in beslag had genomen. Dankzij het gebruik van HRM als screeningmethode zal het dan ook mogelijk worden om in de toekomst sneller tot een moleculaire diagnose van Brugada syndroom te komen. In de komende maanden zullen beide platforms echter in parallel getest worden om de HRMdetectiegevoeligheid nog verder te onderzoeken.

71

5. 1. 2. 3.

Literatuurlijst Wolf C.M., Berul C.I. Molecular Mechanisms of Inherited Arrhytmias. Current Genomics 2008, 9, p. 160-168; http://cardio.nettools.be/default.aspx?url=p_119.htm geraadpleegd op 26 april 2010; Campuzano O., Sarquella-Brugada G., Bugada R., Brugada P., Brugada J. The Genetic Basis of Malignant Arrhythmias and Cardiomyopathies Rev Esp Cardiol. 2009, 62(4), p. 422-436;

4. 5. 6. 7. 8. 9.

L.L. Kirchmann Anatomie en fysiologie van de mens. 2005, Elsevier gezondheidzorg, Maarssen; S. Silbernagl, A. Despopoulos Atlas van de fysiologie. 2008, SESAM/Hbuitgevers, Baarn; Sovari A.A., Kocheril A.G., Assadi R., Baas A.S., Zareba W., Rosero S. Long QT Syndrome 2009, emedicine.medscape.com; Morita H., Wu J., Zipers D.P. The QT syndromes: long and short Lancet, 2008, 372, p. 750-763; Schwartz P.J. The congenital long QT syndromes from genotype to phenotype: clinical implications Journal of Internal Medicine, 2006, 259, p. 39-47; Medeiros-Domingo A., Iturralde-Torres P., Ackerman M.J. Clinical and Genetics Characteristics of Long QT Syndrome Rev Esp Cardiol, 2007, 60, p. 739-752;

10. Reinig M.G., Engel T.R. The Shortage of Short QTq Chest, 2007, DOI 10.1378/chest.06-2133; 11. Brugada R., Hong K., Cordeiro J.M., Dumaine R. Short QT Syndrome Canadian Medical Association Journal, 2005, 173(11), p. 1349-1354; 12. Antzelevitch C. The Brugada Syndrome: diagnostic criteria and cellular mechanisms European Heart Journal, 2001, 22, p. 356-363; 13. Brugada P., Benito B., Brugada R., Brugada J. Brugada Syndrome: Update 2009 Hellenic J Cardiol, 2009, 50, p. 352-372; 14. Farwell D., Gollob M.H. Electrical heart disease: Genetic and molecula basis of cardiac arrhytmias in normal strucural hearts Can. J. Cardiol., 2007, 23, p. 16A-22A; 15. Benito B., Brugada J., Brugada R., Brugada P. Brugada Syndrome Rev. Esp. Cardiol., 2009, 62(11), p. 1297-1315; 16. http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.html geraadpleegd op 8 mei 2010; 17. http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.html geraadpleegd op 8 mei 2010; 18. https://www.roche-applied-science.com/sis/amplification/index.jsp?id=AM050300 geraadpleegd op 8 mei 2010; 19. http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi geraadpleegd op 1 mei 2010; 72

20. Real-Time PCR: From Theory to Practice, invitrogen; 21. http://www.nfstc.org/pdi/Subject04/pdi_s04_m01_02_f.htm geraadpleegd op 2 mei 2010; 22. SOP DNA bereiding UZ Brussel; 23. SOP fenol/chloroform extractie UZ Brussel; 24. http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-andServices/Applications/Nucleic-Acid-Amplification-and-Expression-Profiling/PCR/PCRMisc/Taq-DNA-Polymerase.html geraadpleegd op 2 mei 2010; 25. Watson J.D., Baker T.A., Bell S.P., Gann A., Levine M., Losick R. Molecular Biology of the Gene. 2008, Pearson Education, San Fransisco; 26. Koolman J., Rhm K.-H. Atlas van de biochemie. 2004, SESAM/HBuitgevers, Baarn 27. http://www.biotium.com/product/price_and_info.asp?item=41001&Sub_Section=09A geraadpleegd op 2 mei 2010; 28. SOP DNA sequencing UZ Brussel; 29. http://www3.appliedbiosystems.com/AB_Home/applicationstechnologies/HighResolution-Melting/index.htm geraadpleegd op 11/03/2010 30. https://www.roche-applied-science.com/sis/rtpcr/htc/index.jsp?&id=htc_000000 geraadpleegd op 9 mei 2010; 31. LightCycler High Resolution Melting Master versie maart 2007; 32. Bijsluiter Light Cycle 480 High Resolution Melting Master, versie juli 2009; 33. http://www.primerdesign.co.uk/Download%20material/Beginners%20guide%20to%20r eal-time%20PCR.pdf geraadpleegd op 11 maart 2010; 34. Real-Time PCR Reaction: From Theory to Practice, Invitrogen; 35. Millat G., Chanavat V., Rodriguez-Lafrasse C., Rousson R., Rapid, sensitive and inexpensive detection of SCN5A genetic variations by high resolution melting analysis Clinical Biochemistry, 2008, 42, p. 491-499.

6. 1. 2. 3. 4. 5.

Lijst met figuren http://www.10voorbiologie.nl/index.php?cat=9&id=573&par=586&sub=589 geraadpleegd op 13 mei 2010; https://www.healthforums.com/print/articlePrint?brand=HealthForums.com&pkg=hf2&c ontentID=9770 geraadpleegd op 13 mei 2010; http://cardio.nettools.be/default.aspx?url=p_99.htm geraadpleegd op 13 mei 2010; http://www.virtualmedicalcentre.com/healthinvestigations.asp?sid=28 geraadpleegd op 15 april 2010; http://drsvenkatesan.wordpress.com/2009/08/26/why-ecg-is-greatly-influensed-byserum-potasium-levels-and-least-affected-by-serum-sodium-levels/ geraadpleegd op 73

13 mei 2010; 6. 7. 8. 9. Brugada R., Hong K., Cordeiro J.M., Dumaine R. Short QT Syndrome Canadian Medical Association Journal, 2005, 173(11), 1349-1354; Brugada P., Benito B., Brugada R., Brugada J. Brugada Syndrome: Update 2009 Hellenic J Cardiol, 2009, 50, p. 352-372; Antzelevitch C. The Brugada Syndrome: diagnostic criteria and cellular mechanisms European Heart Journal, 2001, 22, p. 356-363; Brugada P., Benito B., Brugada R., Brugada J. Brugada Syndrome: Update 2009 Hellenic J Cardiol, 2009, 50, p. 352-372; 10. http://www.genehk.com/news/pr/pr_s03.html geraadpleegd op 8 mei 2010; 11. http://www.mun.ca/biology/scarr/PCR_simplified.html geraadpleegd op 8 mei 2010; 12. https://sites.google.com/a/luther.edu/genetics/students/adam-ragheb/identification-oftaster-and-nontaster-genotypes-by-restriction-enzyme-digestion-and-gelelectrophoresis geraadpleegd op 8 mei 2010; 13. http://kenickbiochem09.wikispaces.com/Western+Blotting+--By+Ongori,+David?f=print geraadpleegd op 8 mei 2010; 14. http://home.scarlet.be/~tsk05520/biomolespa/Enzimas/enzima-01.jpg geraadpleegd op 8 mei 2010; 15. http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/portal/documents/web_content/cms_0 51951.gif geraadpleegd op 8 mei 2010; 16. http://dnasequencing.wordpress.com/2007/10/26/chain-termination-methods/ graadpleegd op 8 mei 2010; 17. Introducing High-Resolution Melting on the LightCycler 480; 18. Introducing High-Resolution Melting on the LightCycler 480; 19. Introducing High Resolution Melting on the LightCycler 480 System; 20. Tm-calling; 21. Introducing High Resolution Melting on the LightCycler 480 System; 22. Introducing High Resolution Melting on the LightCycler 480 System; 23. Introducing High Resolution Melting on the LightCycler 480 System. 24. Voorstelling heterozygote base-substitutie; 25. Effect mutatie; 26. Stamboom familie indexpatint; 27. Bepaling optimalisatie MgCl2 concentratie voor exon 16a; 28. Tm-calling voor exon 16a en 17a; 29. Tm-calling voor exon 17a; 30. Agarosegel-elektroforese 1; 31. Agarosegel-elektroforese 2; 32. RT-PCR-reactie exon 19;

74

33. Exon scanning voor exon 2; 34. Exon scanning : normalisatie exon 17a; 35. Exon scanning: Differende plot exon 17a; 36. Exon scanning: normalisatie exon 17a; 37. Exon scanning: Difference plot exon 17a; 38. Exon scanning: normalisatie voor exon 23 39. Exon scanning voor exon 23 40. Exon scanning voor 28c; 41. Gene scanning voor exon 2; 42. Gene scanning voor inron 9; 43. Gene scannning voor exon 12; 44. Gene scanning voor exon 21; 45. Gene scanning voor exon 23; 46. Gene scanning voor exon 25; 47. Gene scanning voor exon 28

7. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Lijst met tabellen The Genetic Basis of Malignant Arrhythmias and Cardiomyopathies Clinical and Genetic Characteristics of Long QT Syndrome; Rev Esp Cardiol. 2007;60:739-52; Samenstelling reactiemix PCR; Samenstelling reactiemix HRM; Overzicht SNPs; RT-PCR-optimalisatie: MgCl2-titratie ter bepaling van de ideale concentratie; RT-PCR-optimalisatie: reactiemix.

75

Bijlage 1 Exon 2: c. 87 SNP homozygoot SNP heterozygoot Exon 17a: c. 2788-6 SNP heterozygoot

Exon 17b: c. 3183 SNP heterozygoot SNP homozygoot

Exon 23: c. 4245+82 SNP homozygoot SNP heterozygoot

76

Exon 24: c. 4299+116 SNP heterozygoot

Exon 25: c. 4437+65 SNP heterozygoot SNP heterozygoot

Exon 28b: c. 5457 SNP heterozygoot SNP homozygoot

77

Bijlage 2 Ta: 70C60C RT-PCR reactie evaluatie obv Cp en fluorescntie. OK Tm-calling en Gel Aspecifiek Specifiek Ta: 72C65C OK Niet OK Ta: 65C55C RT-PCR reactie evaluatie obv Cp en fluorescentie OK T m-calling en Gel Aspecifiek Nieuw primerdesign Niet OK Ta: 60C50C Specifiek OK RT-PCR reactie:Cp en fluo. OK Niet OK Nieuw primerdesign

RT-PCR reactie evaluatie obv Cp en fluorescentie. Niet OK Nieuw primerdesign Aspecifiek Ta: 72C OK OK Tm-calling enGel Specifiek OK

T m-calling en Gel Tm-calling en gel Niet OK Aspecifiek

Specifiek OK

RT-PCR reactie evaluatie obv Cp en fluorescentie

Nieuw primerdesign

Nieuw primerdesign

78

Bijlage 3 Annealingstemperatuur en elongatietijd 65 -> 55C (15'') Exon 2a(*) 2b(*) 3(*) 4(*) 5(*) 6(*) 7a bis(+) 7b(+) 8(*) 9(-) MgCl2 2,5 mM 2,5 mM 2,5 mM 2,5 mM 2,5 mM 2,5 mM 2,5 mM 2,5 mM 2,5 mM 2,5 mM 24,83 0,03 specifiek 31,40 0,17 specifiek 30,19 0,24 27,68 0,05 licht asp specifiek 28,39 0,12 specifiek 28,16 0,17 27,82 0,13 29,78 0,16 specifiek specifiek specifiek 28,74 0,24 specifiek Cp Gel 70 -> 60C (15'') Cp Gel 72 -> 62C (15'') Cp 23,02 0,12 Gel specifiek 72C (30'') Cp Gel

79

Annealingstemperatuur en elongatietijd 65 -> 55C (15'') Exon 10(*) 11(*) 12a(*) 12b(+) 13(*) 14(+) 15(*) 16a(-) 16b(*) MgCl2 2,5 mM 2,5 mM 2,5 mM 3,5 mM 2,5 mM 2,5 mM 2,5 mm 2 mM 2,5 mM 28,77 0,15 24,40 0,05 27,53 0,09 specifiek specifiek specifiek 26,05 17a(-) 17b(#) 2,5 mM 0,03 licht aspecifiek Cp Gel 70 -> 60C (15'') Cp Gel 72 -> 62C (15'') Cp Gel 72C (30'') Cp Gel

28,13 0,07 specifiek 27,14 0,29 specifiek 26,38 0,11 30,41 0,24 26,17 0,03 31,28 0,16 specifiek specifiek specifiek specifiek

80

Annealingstemperatuur en elongatietijd 65 -> 55C (15'') Exon 18(*) 19(#) 20(#) 24,22 21(-) 22(-) 23a(*) 2 mM 2,5 mM 3 mM 29,30 0,12 29,29 0,07 specifiek specifiek zeer licht 23b(*) 24(*) 25(-) 26(*) 3 mM 3 mM 2 mM 3,5 mM 31,16 0,12 specifiek 26,07 0,02 specifiek 27,78 0,05 27,81 0,09 aspecifiek specifiek 0,06 specifiek MgCl2 3,5 mM Cp Gel 70 -> 60C (15'') Cp Gel 72 -> 62C (15'') Cp 24,57 0,06 Gel specifiek 72C (30'') Cp Gel

81

Annealingstemperatuur en elongatietijd 65 -> 55C (15'') Exon MgCl2 Cp Gel 70 -> 60C (15'') Cp Gel 72 -> 62C (15'') Cp Gel 72C (30'') Cp 24,82 27(-) 28a(*) 28b(*) 28c(*) 28d(#) 28e(#) 2,5 mM 3 mm 3 mM 3 mM 26,03 0,04 24,84 0,02 25,86 0,08 specifiek specifiek specifiek 0,04 licht asp Gel

(*): Primers ontwikkelt in Primer Blast (+): Primers uit Primer Blast met betere resulaten dan primers uit literatuur (-): Primers uit de literatuur (#): Nieuwe primers ontwikkelt in Light Scanner

82

Bjilage 4

HRM condities Exon 2a 2b 3 4 5 6 7abis 7b 8 pre-melt marge 85-86 87-88 84,5-85,5 86-87 86-87 81-82 89-90 86,5-87,5 83-84 post-melt marge 94-95 92-93 91-92 93-94 90,5-91,5 88,5-89,5 92,5-93,5 91,5-92,5 89,5-90,5 SNPs c. 87 A>G Mutatie

83

HRM condities Exon 9 10 11 12a 12b 13 14 15 16a 16b pre-melt marge 88-89 86-87 84,5-85,5 85,5-86,5 90-91 86-87 85,5-86,5 85-86 85-86 86-87 post-melt marge 92-93 89,5-90,5 88-89 89,5-90,5 94,5-95,5 93,5-94,5 90-91 91,5-92,5 89,5-90,5 89-90 ? c. 1693 A>G c. 1141-3 G>A SNPs Mutatie

84

HRM condities Exon 17a 17b 18 19 20 21 22 23a 23b 24 85-86 86,5-87,5 86-87 83,5-84,5 80-81 89-90 91-92 90-91 90-91 89-90 c. 4245+82 A>G c. 3840+1 G>A & c. 3695 G>A 88,5-89,5 94-95 pre-melt marge 86-87 post-melt marge 94-95 SNPs Mutatie

85

HRM condities Exon 25 26 27 28a 28b 28c 28d 28e pre-melt marge 79,5-80,5 83-84 82,5-83,5 84,5-85,5 83-84 84-85 post-melt marge 83-84 91-92 87,5-88,5 91-92 93,5-94,5 89-90 c. 5457 T>C SNPs Mutatie c. 4300-2 A>T

86