i

EGE NVERSTES FEN BLMLER ENSTTS (YKSEK LSANS TEZ)

FINDIK BTKSNN (Corylus avellana) FARKLI ORGANLARINDAN ENDOFTK FUNGUSLARIN ZOLASYONU VE SEKONDER METABOLTLERNN ARATIRILMASI

eref AKAY
Tez Danman: Prof. Dr. Erdal BEDR kinci Danman: Do.Dr. E. Esin KOCABA

Biyomhendislik Anabilim Dal

Bilim Dal Kodu: 621.01.00 Sunu Tarihi: 29.12.2011

Bornova-ZMR 2011

ii

iii

Sayn eref AKAY tarafndan Yksek Lisans Tezi olarak Fndk Bitkisinin (Corylus avellana) Farkl Organlarndan Endofitik Funguslarn zolasyonu ve Sekonder Metabolitlerinin Aratrlmas balkl bu alma E.. Lisansst Eitim ve retim Ynetmelii ile E.. Fen Bilimleri Enstits Eitim ve retim Ynergesinin ilgili hkmleri uyarnca tarafmzdan deerlendirilerek savunmaya deer bulunmu ve 29.12.2011 tarihinde yaplan tez savunma snavnda oybirlii/oyokluu ile baarl bulunmutur.

ZET

FINDIK BTKSNN (Corylus avellana) FARKLI ORGANLARINDAN ENDOFTK FUNGUSLARIN ZOLASYONU VE SEKONDER METABOLTLERNN ARATIRILMASI

AKAY, eref Yksek Lisans Tezi, Biyomhendislik Anabilim Dal Tez yneticisi: Prof. Dr. Erdal BEDR Aralk 2011, 104 sayfa

Doal rn Kimyas ounlukla sekonder metabolit olarak bilinen bir grup bileik ile ilgilenmektedir. Funguslar geni aralktaki sekonder metabolitleri kolaylkla reten nemli bir mikroorganizma grubudur. Biyoaktif yeni sekonder metabolit aratrmalarnda fungus tarafndan retilen metabolitin, fungusun ekolojik evresiyle ilikisinin sonucu olabilecei (bitki patojenleri mikotoksinleri gibi) ve bu metabolik etkileimlerin sekonder metabolit sentezini arttrabilecei gz nne alnmaldr. Bu yakn etkileimlerin sonucu olarak geni aralkta biyoaktivitelere sahip, daha ok sayda ve eitlilikte bileiklerin retilebilecei ngrlmektedir. Aslnda yakn zamanda yaplan detayl bir alma, endofitik funguslardan elde edilen biyolojik olarak aktif bileiklerin %51inin daha nceden bilinmeyen bileikler olduunu gstermitir (Strobel, 2003).

VI

Bu almada fndk bitkisinin (Corylus avellana) farkl ksmlarndan endofit funguslarn izolasyonu ve biyoaktif rnlerinin belirlenmesi amalanmtr. Ege (zmir) ve Karadeniz (Ordu, Zonguldak) Blgesinden

toplanan fndk bitkisine ait, kk, dal, yaprak ve tomurcuk rnekleri sodyum hipoklorit (NaOCl) ile sterilize edilmitir. Ardndan bitki paralarnn d yzeyleri steril bir bistri ile uzaklatrlm ve i dokudan kk rnekler alnarak iinde eitli besi ortamlarnn olduu farkl petrilere aktarlmtr. zolasyon petrileri 28Cde inkbe edilmi ve devamnda oluan fungal kolonileri saflatrmak iin, morfolojik olarak snflandrlan koloniler, ard arda baka ortamlara pasajlanmtr. Bitki ksmlarndan toplamda morfolojik olarak temsili 14 farkl tr izole edilmitir. Elde edilen izolatlarn sv kltrleri yaplm ve kloroform ekstraksiyonu yaplmtr. Elde edilen ekstrelerin sitotoksik aktivite sonularna gre L1 kodlu tr ileri almalar iin seilmitir ve ITS gen blgelerine gre Phomopsis amygdali olarak tanmlanmtr. Byk hacimli fermentasyon sonucunda elde edilen ekstre zerinde saflatrma almalar yaplm, L1F2 ve L1F3 olmak zere iki bileik izole edilmitir. 1D- ve 2D NMR almalaryla L1F2nin bilinen bir bileik pestalotin olduu belirlenirken, yeni bir molekl olan L1F3 (R)-4-btoksi-6-((S)-1-hidroksibtil)-5,6-dihidro-2H-piran-2on olarak tanmlanmtr. Anahtar Kelimeler: Endofitik fungi, Corylus, Phomopsis, Sekonder metabolitler.

VII

ABSTRACT

ISOLATION OF ENDOPHYTIC FUNGI FROM VARIOUS PART OF HAZELNUT (Corylus avellana) AND INVESTIGATION OF THEIR SECONDARY METABOLITES

AKAY, eref MSc. in Bioenginnering Supervisor: Prof. Dr. Erdal BEDR December 2011, 104 pages

Natural product chemistry mainly concerns a group of compounds known as secondary metabolites. Fungi are remarkable organisms that readily produce a wide range of secondary metabolites. In optimizing the search for new bioactive secondary metabolites, it is relevant to consider that; the secondary metabolites, synthesized by a fungus, may correspond with its respective ecological niche, e.g. the mycotoxins of plant pathogens; and that metabolic interactions may enhance the synthesis of secondary metabolites. This may be the case, since closer biological associations may have developed between these organisms in their respective hosts than the epiphytes or soil-related organisms. Hence, the result of this may be the production of a greater number and diversity of classes of biologically derived molecules, possessing a range of biological activities. In fact, a recent comprehensive study has indicated that 51% of biologically active substances isolated from endophytic fungi were previously unknown. (Strobel, 2003). The main aim of this study was to isolate endophytes from different parts of hazelnut (Corylus avellana), to extract bioactive secondary metabolites and then to elucidate their structures. Different plant materials including the roots, branches

VIII

and leaves were collected from Aegean and BlackSea regions of Turkey and they were surface sterilized with sodium hypochlorite (NaOCl). The outer layers removed with a sharp, sterilized blade, and they were cut into pieces. Small pieces of the inner tissue were placed on the surface of petri contained various media, and they were incubated at 28C. Subsequently fungal colonies that grown on petri were classified according to their morphological properties and transferred to the new medium for isolation. In total, 14 morphologically different colonies of plant parts have been isolated. Then the small scale studies were performed followed by chlorofom extraction. The chloroform extracts were screened for their cytotoxic activities by MTT method. Based on the activity results, the isolate L1, identified as Phomopsis amygdali based on ITS analysis, was selected for further studies. After large scale fermentation isolation, and purification studies, a new metabolite (L1F3) together with a known compound, named pestalotin (L1F2) were obtained. The structure of the new metabolite was elucidated as (R)-4butoxy-6-((S)-1-hydroxybutyl)-5,6-dihydro-2H-pyran-2-one by the extensive use of 1D- and 2D NMR. Key words: Endophyte fungi, Corylus, Phomopsis, Secondary metabolites.

IX

TEEKKR

Tez almalarm boyunca benden destek ve yardmlarn esirgemeyen Endstriyel Mikrobiyoloji Laboratuvar, Doal rn Kimyas Laboratuvar ve Bionorm Doal rnleri LTD.T. alanlarna teekkr ederim. Tez almalar boyunca sitotoksik aktivite testlerini gerekletiren arkadam, Fatma KOCABAa teekkr ederim. Ayrca tez kapsamnda kullandm bitki materyallerinin toplanmasnda katklar olan Gner EKZ, Zalike KESKN ve Fatih KARABEYe teekkrlerimi sunarm.

XI

XII

NDEKLER
Sayfa ZET ..............................................................................................................V NDEKLER............................................................................................. XII EKLLER DZN ......................................................................................XV ZELGELER DZN ..............................................................................XVII 1. 2. GR..................................................................................................... 1 LTERATR ZET ............................................................................ 4 2.1. Sekonder Metabolitler .................................................................... 4

2.1.1. la olarak kullanlan sekonder metabolitler .................................. 5 2.1.2. Besin katk maddeleri olarak kullanlan sekonder metabolitler ..... 6 2.1.3. Zirai ila olarak kullanlan sekonder metabolitler ......................... 7 2.2. 2.3. 2.4. Yeni Doal rn Araylar ........................................................... 7 Doal rn Kayna Olarak Bitkiler ............................................. 9 Doal rn Kayna Olarak Mikroorganizmalar ........................ 11

2.4.1. Endofitik funguslar ...................................................................... 13 2.4.2. Endofitik funguslarn eitlilii ve sistematii ............................ 15 2.4.3. Endofitlerin izolasyon ve saklama teknikleri ............................... 22 2.4.4. Endofitik fungus-bitki etkileimleri ............................................. 33 2.4.5. Endofitik funguslardan elde edilen sekonder metabolitler .......... 37 3. MATERYAL ....................................................................................... 60 3.1. 3.2. rneklerin Topland Blgeler ................................................... 60 Kullanlan Besiyerleri .................................................................. 60

3.2.1. Rose-Bengal kloramfenikol agar ................................................. 60 3.2.2. Aktinomiset izolasyon ortam ...................................................... 61

XIII

NDEKLER(devam)
Sayfa 3.2.3. Malt ekstrakt agar ........................................................................ 61 3.2.4. Su agar ......................................................................................... 61 3.2.5. Czapek Dox agar .......................................................................... 61 3.2.6. Patates dekstroz agar .................................................................... 62 3.2.7. Malt ekstrakt broth ....................................................................... 62 3.2.8. Mueller-Hinton agar ..................................................................... 62 3.3. 3.4. Yzey Sterilizasyonu ................................................................... 62 DNA zolasyonu .......................................................................... 63

3.4.1. 50X TAE (Tris-Asetat-EDTA) tamponu ..................................... 63 3.4.2. Potasyum asetat tamponu ............................................................. 63 3.4.3. Liziz tamponu .............................................................................. 63 3.4.4. Primerler ...................................................................................... 64 3.4.5. PCR taq buffer( 10X buffer) : ...................................................... 64 3.5. 3.6. 4. Test Organizmalar ....................................................................... 65 Ekstraksiyon ve Kromatografik lemler ..................................... 65

YNTEMLER .................................................................................... 66 4.1. 4.2. 4.3. 4.4. 4.5. 4.6. 4.7. Yzey Sterilizasyonu ................................................................... 66 Endofitlerin zolasyonu ................................................................ 67 Kk lekli Fermentasyon almalar ................................... 68 Byk lekli Fermentasyon almalar ................................... 69 Ekstraksiyon ................................................................................. 70 Disk Difzyon Yntemi ............................................................... 71 Sitotoksisite Testleri..................................................................... 71

XIV

NDEKLER(devam)
Sayfa 4.8. DNA zolasyonu .......................................................................... 72

4.8.1. Genomik DNA izolasyonu ........................................................... 72 4.8.2. Agaroz jel elektroforezi ............................................................... 72 4.8.3. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ............................................. 73 4.9. 4.10. 5. Ayrma Saflatrma lemleri ....................................................... 73 Yap Tayini .................................................................................. 74

BULGULAR ....................................................................................... 75 5.1. 5.2. 5.3. 5.4. 5.5. 5.6. 5.7. 5.8. Yzey Sterilizasyonu ................................................................... 75 Endofitlerin zolasyonu ................................................................ 75 Kk ve Byk lekli Fermentasyonlar .................................. 78 Ekstraksiyon ve TK Analizleri ................................................... 79 Aktivite Testleri ........................................................................... 80 DNA zolasyonu ve PCR ............................................................. 82 Ayrma Saflatrma lemleri ....................................................... 84 Yap Tayini .................................................................................. 85

6.

SONU VE TARTIMA .................................................................... 93

KAYNAKLAR DZN ............................................................................... 99 ZGEM ............................................................................................ 103

XV

EKLLER DZN

ekil

Sayfa

2-1 Bitki kkenli baz doal biyoaktif rnler ...................................................... 10 2-2. Mikrobiyal kaynakl baz biyoaktif doal rnler .......................................... 12 2-3 Funguslarda rDNA blgesi .............................................................................. 21 2-4 Biyolojik aktivite ynnden test edilen izolatlarn kaynaklarna gre dalm ............................................................................................................................... 24 2-5 Konak bitki ve endofiti tarafndan retilen biyoaktif bileikler ..................... 37 2-6 Endofitlerden biyoaktif doal rnlerin izolasyonu ak emas .................... 39 2-7 Endofitlerden elde edilen nemli biyoaktif bileikler ..................................... 40 2-8 Endofitlerden elde edilen baz antimikrobiyal bileikler ................................ 46 2-9 Endofitlerden elde edilen baz antiviral (A), uucu antibiyotik (B) ve antioksidan ajanlar (C) ........................................................................................... 48 2-10 Antitmor doal biyoaktif bileikler paklitakzel (A) ve toreyanik asit (B) .. 50 2-11 Antitmor aktivite gsteren baz sitokalasin bileikleri ................................ 53 2-12 Endofitlerden elde edilen antiinsektisidial (A), antidiyabetik (B) ve immnspresif (C) bileikler ................................................................................. 55 3-1 Toplanan bitki rnekleri .................................................................................. 60 4-1 Yzey sterilizasyonu gerekletirilmi bitki rnekleri .................................... 67 4-2 zolasyon petrilerine aktarlan bitki rnekleri ................................................. 68 4-3 zolasyon petrilerinde fungal oluumlar .......................................................... 70 5-1 zole edilen saf endofit kolonileri .................................................................... 77 5-2 Baz izolatlara ait kk inkbasyon sonras fermentasyon ortamlar ............ 78 5-3 Byk lekli fermentasyon ortamlar ............................................................ 79 5-4 Elde edilen ekstrelerin TK profilleri .............................................................. 80

XVI

EKLLER DZN(devam)

ekil

Sayfa

5-5 Baz izolatlardan elde edilen ekstrelerin antimikrobiyal aktiviteleri............... 81 5-6 L1 izolatndan elde edilen L1F3 bileiinin sitotoksik aktivitesi.................... 82 5-7 zolatlarn ITS analizleri sonucuna dayanarak oluturulan filogenetik aa .. 84 5-8 Saflatrlan bileiklere ait TK plakalarnn UV ve normal grnmleri....... 85 5-9 L1F2 moleknn yaps ................................................................................... 87 5-10 L1F3 moleklnn yaps .............................................................................. 87 5-11 L1F2 moleklne ait 1H NMR spektrumu (CDCl3 400MHz)....................... 88 5-12 L1F2 moleklne ait 13C NMR spektrumu (CDCl3 100 MHz)..................... 89 5-13 L1F3 moleklne ait 1H NMR spektrumu (CDCl3 400MHz)....................... 90 5-14 L1F3 moleklne ait 13C NMR spektrumu (CDCl3 100 MHz)..................... 91 5-15 L1F3 iin COSY Spektrumu ......................................................................... 92

XVII

ZELGELER DZN
izelge Sayfa

2-1 Kaynaklarna gre antibiyotiklerin dalmlar ............................................... 12 2-2 Endofit fungusalarn izoalsyonunda kullanlan yzey sterilizasyon teknikleri ..
..................................................................................... Hata! Yer iareti tanmlanmam.

2-3 Baz organizmalara kar endofitiklerin aktiviteleri ...................................... 40 2-4 Endofit funguslardan elde edilen doal biyoaktif bileikler .. 56 5-1 zole edilen endofit funguslar .......................................................................... 76 5-2 L1 ve R4 ekstrelerine ait IC50 deerleri ... Hata! Yer iareti tanmlanmam. 5-3 L1F2 moleklne ait 1H ve 13C datalar ........................................................ 866

XVIII

1. GR

Bakterilerin antibiyotiklere kar diren gelitirmesi, yeni grlmeye balayan ve hayat tehdit eden virsler, organ nakillerinde tekrarlayan salk problemleri, bitkileri etkileyen eitli hastalklar ve fungal enfeksiyonlarn dnyada byk art gstermesi nemli bir sorun haline gelmektedir. Bu problemlerle baa kmak iin btn ynleriyle insanlara yardmc olacak ve gven verecek bileiklere duyulan ihtiya giderek artmaktadr. Dnyann baz yerel blgelerindeki insan nfusu iin yeterli gda salanamamas, evresel bozulma, biyoeitliliin kaybolmas, toprak ve sularn bozulmas karmza kan dier problemlerdir. Bunlar, salk ve beslenme ile ilgili olumsuz sonular dourabilir (Strobel and Daisy, 2003). Bitkiler, bcekler, mikroorganizmalar ve denizel organizmalar evreleri ile kompleks ilikiler iindedirler ve kendi yaamlar iin faydal kk doal rnler retirler. Bu biyolojik rollerinin yan sra bu metabolitler, geni bir aralkta biyolojik aktivite gsterebilmektedirler. Aslnda uzun yllardan beri doal rnler, ila keif ve gelitirme srelerinde temel rol oynamaktadr. Ayrca, doal rnlerin kompleks yaplar, sentetik kimya iin ilham kayna olmu ve eitli biyokimyasal yolaklarn anlalmas iin yararl bir ara salamtr. Bununla birlikte yararl bir doal rnn baarl bir ekilde kefedilmesinde en hayati noktalardan biri rnn izole edilecei kaynan seilmesidir (Gallo et al., 2008). Doal rnler; mikroorganizma, bitki ya da hayvanlardan doal olarak elde edilen yan rn ya da metabolitlerdir. Bu rnler bin yllardan beri insanlar tarafndan kullanlmaktadr ve bitkiler, ila olarak kullanlan bu bileiklerin ana kayna olarak n plana kmaktadr. Bugn bile geleneksel ilalarn en byk kullancs, Farmakopisinde 5000den fazla bitki ve bitkisel rn bulunan indir. Doal rn kullanm ile ilgili rneklerin says zellikle dnyann uzak blgelerindeki kk yerli topluluklarda ok daha fazladr. rnein; Amazon havzasndaki baz kabileler, Papua Yeni Ginenin yksek kesimlerindeki insanlar ve Avustralyadaki Aborjinler, souk algnlndan byk yaralara, barsak rahatszlklarnn giderilmesine kadar birok semptomun tedavisinde baz bitkileri kullanmaktadrlar (Strobel and Daisy, 2003).

Pasteurun, mayalanmaya, yaayan canllarn neden olduunu kefedene kadar kimse organizmalar doal biyoaktif rnler iin kaynak olarak incelememitir. Daha sonra bilimsel ans ve gzlem gc, antibiyotik an balatmak iin Flemingi tevik etmi ve fungus Penicillium notatumdan penisilini kefetmesini salamtr. O gnden sonra, insan, hayvan ve bitki patojenlerine kar aktif mikrobiyal metabolitlerin kefi, bilim insanlarnn ilgi oda olmutur. Ayrca tp, tarm ve endstri alannda geni kullanma sahip uygulamalar iin saysz mikroorganizmann kefi, tp ve tarmda yeni ve gelimi tarama srelerinin gelitirilmesiyle daha pratik hale gelmitir. Bu sreler bireysel organizmalar, enzimler, hcreler ve blge-ynlendirilmi teknikleri otomatik testlerde birok defa kullanarak umut vadeden doal rnlerin hzl bir ekilde belirlenmesi ve gelitirilmesine yol amaktadr. Takzoln kefi ve gelitirilmesi tpta r aan doal rnlerin modern bir rneidir. Doal rnlerin modern uygarlklardaki nemi ve deerini gsteren ok sayda rnek verilebilir (Strobel and Daisy, 2003). Dnya ila pazarnn %30a yakn doal rn temellidir. Yalnzca ABDde reeteli ilalarn %25i bitkilerden elde edilmi en az bir aktif bileen iermektedir. Tptaki saysz rnek, yeniliki doal bileiklerin potansiyeli ve bunlarn ila kefi ve gelitirmesine etkilerini gstermektedir (Tejesvi et al., 2007). Endofitler, canl bitki dokularnda barnan, tbbi, zirai ve endstriyel adan potansiyel yeni doal rn kayna ve greceli olarak allmam bir mikroorganizma grubudur. Endofitler bitki dokularnn iinde herhangi bir nemli semptoma neden olmadan yaayan organizmalardr (fungus, bakteri, maya). Bu organizmalar, ksilem ve floem de dahil olmak zere bitkinin btn ksmlarnda bulunurlar. Endofitlerin byk ounluu aalardan izole edilmi, ancak; al veya otsu bitkilerin birka endofit varl bakmndan incelenmitir. Endofitik funguslar giderek yararl biyolojik aktivitelere sahip, yeni sekonder metabolitlerin kayna olabilecek ekolojik bir mikroorganizma topluluu olarak tanmlanmaya balanmtr. Teorik olarak yeni sekonder metabolit gruplar bulma olasl, daha iyi bilinen fungus gruplarna (toprak funguslar) gre daha yksektir (Tejesvi et al., 2007). Bugne kadar btn bitki trlerinde bulunan fungal endofitlerin kimyasal eitlilikleri allm, bu organizmalarn bu kadar ilgi toplamasna neden olan

biyolojik eitlilikleri allmamtr. Dnya zerindeki 300 bine yakn bitkiden her birinin, bir ya da daha fazla endofit iin konak oluturmas dikkate deerdir. Bu bitkilerden ok az endofit biyolojileri ile ilgili btnyle allmtr. Bu nedenle farkl koul ve ekosistemde yaayan saysz bitkiden yeni ve ilgin endofitik mikroorganizmalar bulmak nem arzetmektedir (Strobel and Daisy, 2003). Yaplan aratrmalar fndk (Corylus avellana) ve yan rnlerinde ok geni aralkta biyoaktif doal rnlerin bulunduunu gstermitir. zellikle fndn yaprak ve kabuk ksmlarnda nemli bir kanser ilac olan paklitakzel ve eitli takzan trevi bileikler saptanmtr. Fndk kk ve dal ksmlar zerinde yaplan dier bir almada paklitakzel ve ilgili takzan trevlerinin varl ktle spektrometresi ile tespit edilmitir. Ayrca fndk bitkisinin hcre kltrleri ile yaplan almalarda, baz fndk trlerinin takzol sentezi iin gerekli metabolik sentez mekanizmalarna sahip olduu gsterilmitir (Shahidi ve Alaalvar, 2004; Hoffman and Shahidi, 2008; Bestoso et al., 2008). Paklitakzelin temel kayna olan porsuk aalarndan izole edilen endofit mikroorganizmalarn takzol rettii belirlenmi olmasna ramen, fndk bitkisinden izole edilen ve takzol reten herhangi bir mikroorganizma gnmze kadar rapor edilmemitir. Bu noktadan hareketle, tezimizin amac lkemizde ekonomik adan nemli bir deere sahip fndk bitkisinin farkl (kk, gvde, yaprak, dal vb.) dokularndan endofit funguslarn izole edilmesi ve bu izolatlardan elde edilecek ekstreler zerinde biyoaktivite almalarnn gerekletirilmesidir. Ayrca izole edilen funguslarn paklitakzel retme yeteneklerinin belirlenmesi iin DNA izolasyonlarnn gerekletirilerek, elde edilen DNA rneklerinin paklitakzel biyosentezinde yer alan temel enzimlerden biri olan taksadiyen sentaz gen blgesinin varl asndan taranmas planlanmtr. Daha sonra izole edilen funguslarn mikrobiyolojik yntemler kullanlarak tayin edilmesi ve belirlenen trlerin byk lek fermentasyonlarn takiben biyoaktif bileiklerinin saflatrlmas hedeflenmitir.

2. LTERATR ZET

2.1. Sekonder Metabolitler

Sekonder metabolitler organizma tarafndan retilen fakat organizmann bymesi iin gerekli olmayan ve sadece snrl taksonomik gruplarda mevcut olan bileiklerdir. zellikle bitkilerde ve mikroorganizmalarda yaygn olarak bulunurlar (Kk vd., 2003). Primer metabolitler, organizma geliimine paralel olarak mikroorganizmann gelime faznn balangcnda oluurken, sekonder metabolitler, sklkla gelime faznn sonuna doru ya da durgun fazda sadece baz organizmalar tarafndan retilmektedir. Sekonder metabolitlerin temel zellikleri aadaki gibi sralanabilir; Gelime ve reprodksiyon iin gerekli olmayan bir zelliktedirler. Ekstra byme artlarnda zellikle besiyerinin bileimine bal olarak retilirler. Genellikle yakndan ilikili bir grup bileik olarak sklkla retilir. rnein, Streptomycesin bir trnn tek bir suunun, 30un zerinde ilikili metabolitleri rettii bulunmutur. Fakat bunlar, farkl antraksiklin antibiyotikleridir. Sklkla sekonder metabolitlerin yksek retimi mmkn iken, genellikle primer metabolitlerin yksek oranda retilmeleri mmkn deildir (Onbal ve Aslm, 2011). Bugne kadar 10 binden fazla mikrobiyal metabolit olduu tespit edilmi fakat bunlardan olduka az bir ksm uygulama alan bulmutur. Mikrobiyal sekonder metabolitler, hormon, antibiyotik, toksin, anti-migren ajan, anti-kanser ajan veya insektisit gibi eitli biyolojik aktivitelere sahiptir. Mikrobiyal sekonder metabolitler, gnmzde daha ok tarmda, endstride ve salk alannda kullanlmaktadr. Genel olarak sra d yaplara sahiptirler ve oluumlar; besinler, byme oran, feedback kontrol, enzim aktivasyonu ve

enzim

indksiyonu

ile

dzenlenmitir.

Sekonder

metabolitlerin

sentezi,

kromozomal DNA ve nadiren de plazmit DNAsndaki genler tarafndan kodlanmtr. Primer metabolizmadan farkl olarak sekonder metabolizma sreleri hala tam anlamyla anlalamamtr. Bu yzden sekonder metabolitler, enzimoloji, kontrol ve farkllama zerine temel aratrmalar iin frsatlar tamaktadr (Onbal ve Aslm, 2011). Sekonder metabolizma; besin, biyosentez, indkleyicilerin ilavesi ile veya geliim oranndaki azalma ile ortaya kar. Birok sayda bakteri ve mantar sekonder metabolit ad verilen bu metabolizma atklarn retmektedirler. Bugne kadar sekonder metabolit reten 2000'in zerinde bakteri karakterize edilmitir. Mikroorganizmalarn yardm ile zellikle Pseudomonas cinsine ait trlerden polisakkaritler, antibiyotikler, enzimler, antijenler ve zehirler gibi ok sayda sekonder metabolit retilmektedir. Endstride, sekonder metabolitler daha kararl rn oluturduu ve daha az enerji gerektirdii iin tercih edilmekle birlikte, bu metabolitlerin seiminde, sularn endstriyel ihtiyalar ve yksek retim kapasiteleri nemli olmaktadr. Antibiyotik ve dier sekonder metabolitler mikroorganizmalarn ticari nemini artrmaktadr (Onbal ve Aslm, 2011).

2.1.1. la olarak kullanlan sekonder metabolitler

Tarihle ilgili eriilebilen yazl kaynaklarda, ilk insanlarn eitli hastalklarn tedavisi iin bitkilerden yararlandklar belirtilmektedir. Elbette bu kullanm biimi etken madde olan sekonder rnden ok, bitkinin kendisine veya deiik yollarla elde edilen ztlerine dayanmaktadr. Bugn bile dnya nfusunun ounluu iin bitkiler ilalarn ham maddesi olarak kullanlmaktadr (Karaku, 2008). Dnyada en iyi bilinen ve evrensel olarak kullanlan Aspirin bile, Salix ve Populus bitki cinslerinin birok trnde bulunan glikozit salisinden tretilmitir (Strobel and Daisy, 2003). Dier bir sekonder metabolit kkenli ila, kukusuz getiimiz yzyln en nemli keiflerinden biri olan ve antibiyotiklerin altn an balatan penisilindir. Bu doal rn, Fleming tarafndan Penicillium notatumdan izole edilmitir ve halen en fazla kullanlan antibiyotiklerden biridir. Vinkristin, digitoksin, paklitakzel, streptomisin,

kloramfenikol, rifampisin, artemisinin gibi sekonder metabolit kkenli ila olarak kullanlan birok biyoaktif bileik rnei mevcuttur.

Aktr ki doal rn temelli bileiklerin bugn modern tpta nemli bir yeri vardr. 2000 ile 2005 yllar arasnda, kanser, nrolojik ve genetik bozukluklar, enfeksiyoz ve kardivazkler hastalklar, metabolik ve immnolojik hastalklar gibi eitli durumlarda kullanlan bitki ve mikroorganizmalardan elde edilen 23 yeni ila piyasaya srlmtr. 1993 yln takip eden 9 ylda fungus kaynakl antitmr ya da antibiyotik aktivite gsteren 1500e yakn metabolit rapor edilmitir. rnein reete ilalarnn %40 doal rn temelli ve 1981-2002 yllar arasnda FDA tarafndan antikanser, antimigren ve antihipertensif olarak kaydedilen yeni kimyasal rnlerin %50den fazlas doal rn ve trevlerinden olumaktadr. Biyolojikler hari, 1989 ve 1995 arasnda onaylanan ila ve ncl yeni ila uygulama adaylarnn (NDA) %60 doal orijinlidir. 1983ten1994e kadar onaylanan ve ncl yeni ila uygulama aday aamasndaki ilalarn %60tan fazlas doal orijinli antikanser ajan ve %78i yeni onaylanan antibakteriyel ajanlardr (Suryanarayanan 2009; Strobel and Daisy, 2003).

2.1.2. Besin

katk

maddeleri

olarak

kullanlan

sekonder

metabolitler

nsanolu iin yaamsal deeri tartlmaz olan bitki primer metabolitlerinin yan sra, tat ve koku verici maddeler de besin endstrisinde nemli yer tutmaktadr. Sentetik katk maddelerinin mutajenik, karsinojenik ve teratojenik etkilerinin ortaya k ile birlikte; et, st, meyve, sebze, deniz rnleri ve merubat sektrlerinde doal rnlere olan talep giderek artrmaktadr. rnein, Thaumatococcus danielli'den elde edilen tatlandrc, thaumatin, bir tek kimyasaldan ibarettir. Thaumatinin hem dk kalorili olmas hem de skrozdan (ay ekeri) 2000 kat daha tatl olmas nedeniyle, bu tatlandrcya olan ilgi giderek artmaktadr . Gda sektrnde kullanlan en nemli mikrobiyal sekonder metabolitler ise pigmentlerdir. Birok sentetik boyann potansiyel riskler tamas nedeniyle doal pigmentler tercih edilmektedir. Enok kullanlan pigmentler

karotenoidlerdir. Krmz renge sahip bir pigment olan -karotenoid, geni bir aralktaki mukoral funguslar tarafndan retilirken, salmonid et ve halanm kabuklulardaki turuncu-pempe-krmz renkten sorumlu karotenoid astaksantin Phafa rhodozymaden elde edilebilmektedir (Karaku, 2008).

2.1.3. Zirai ila olarak kullanlan sekonder metabolitler

Zirai mcadelede de sekonder metabolitlerin olduka nemli bir yeri vardr. Suni ilalarn; topraa, bitki rtsne, havaya ve dier yararl organizmalara olan zararl etkisinden dolay yasaklanmaya balanmas, zellikle organik tarm alannda, bakteri, bcek ve virslere kar doal sekonder metabolitlerin kullanlmasn tevik etmektedir. Bunlarn en ilgi ekici olanlar Chrysanthemum cinerariaefolium ieklerinden elde edilen ve insektisit olarak kullanlan piretrinlerdir. Benzer ekilde birok fungus ve bakteriden elde edilen fermentasyon svlarnn nemli bitki patojenlerine kar inhibe edici ya da ldrc etkisi olduu saptanmtr (Kharwar and Strobel, 2011 ).

2.2. Yeni Doal rn Araylar

Genellikle yksek aktivite gsteren toksisitesi dk antibakteriyel, antifungal, antiviral ve kemoteraptik ajanlara ynelik bir aray vardr. Bu yeni aratrma yaklam, enfeksiyz mikroorganizmalarn (Staphylococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Bacillus, Aspergillus spp.) var olan ilalara diren gelitirmesi ve doal direnli organizmalarn tehdit etmesiyle beslenmektedir. Birinci kuak ilalara kar gelitirilen bu diren, daha pahal ikinci ve nc kuak ajanlarn gelitirilmesine neden olmutur. Eer bu ilalara da diren ortaya karsa, tedavi seenekleri tkenmi olacaktr (Sreekanth, 2008 ). HIV, Ebola ve SARS gibi hastalk kaynakl ajanlarn insan topluluklarna girmesi, bunlarla mcadele iin yeni ilalarn kefedilmesi ve gelitirilmesini gerekli klmtr. Sadece AIDS gibi hastalklara spesifik ilalara deil, ayn zamanda bu hastalklarn neden olduu immn sistem zayflndan kaynaklanan yan enfeksiyonlar iin de yeni tedavilere ihtiya duyulmaktadr. Dahas baklk

sistemi zayflam (organ nakli ve kanser durumlarnda) kiilerde, normalde insan poplasyonlarnda nemli olmayan Aspergillus, Cryptococcus ve Candida gibi frsat patojenlerin neden olduu enfeksiyonlar nemli bir risk oluturmaktadr. Ayrca malarya, leishmaniasis, trypanomiasis, ensefalit ve filariasis gibi parazitik protozoa ve nematodlarn neden olduu enfeksiyonlarn etkili bir ekilde tedavi edilmesi iin de daha fazla ila gerekmektedir. Yllk lm saylar gz nne alndnda malarya tek bana AIDS ve tberkloz dhil olmak zere dier enfeksiyz ajanlardan daha tehlikelidir (Strobel and Daisy, 2003). Btn bu sebeplerin yan sra bitkileri etkileyen eitli hastalklar ve fungal enfeksiyonlarn tesadfen dnyann nfusunda byk art gstermesi ve dnyann baz yerel blgelerindeki insan nfusu iin yeterli gda salanamamas bu problemlerle baa kmaktaki yetersizliimizi gstermektedir. Ayrca evresel bozulma, biyoeitliliin kaybolmas, toprak ve sularn bozulmas karmza kan dier problemlerdir ve her biri salk ve alk ile ilgili sonular dourabilir (Tejesvi et al., 2007). Enfeksiyon kontroln gelitiren, daha etkili ila keifleri iin doaya bavurma ve hastalk yapc ajanlara kar daha uygun ila kullanma ynnde aratrmalarn balatlmas gerekmektedir. Son zamanlarda byk ila irketleri iin doal rn aratrmalar poplaritesini kaybetmi ve baz durumlarda yerini tamamen yapsal olarak ilgili kk molekllerin otomatik sentezi olan kombinatoryal kimyaya brakmtr. Bununla birlikte ila irketleri anti-infeksiyz ilalardan daha fazla potansiyel rnler gelitirmeye ilgi gstermeye balamlardr. Bu rnler, sosyal yararlar salayan, artrit ve alerji semptomlarn azaltan ya da mide yattrc bileikleri kapsamaktadr. Bu ilgi kayb, doal rn kaynaklarnn seilmesi, toplanmas, bu kaynaklardan aktif bileiklerin izole edilmesi, yaplarnn belirlenmesi ve rn gelitirme iin uzun zaman, ok byk aba ve masraf gerektirmesinden kaynaklanmaktadr. Ayrca basit kimyasal yaplar etrafnda dnen kombinatoryal kimya ve sentetik kimya, ila endstrisinin tarama robotlarn beslemek iin sonsuz bir rn kayna olarak hizmet etmektedir. Pek ok byk ila irketinde yeni rnlerin bulunmas ncelikle retilebilir ve tarama makinelerine gnderilebilir bileik saysna dayanmaktadr. Bu durum bir rn bulmak iin bile ok sayda basamaa ihtiya duyan doal rn kefine bir kar eilim gelitirmektedir. Ancak unutulmamaldr ki kombinatoryal kimyann ncelikli

amac, doal rn keif almalarnn yerini almak deil, bu almalar desteklemek ve tamamlamaktr. Doal rnler ou zaman kombinatoryal ve sentetik kimya mdahaleleri ile aktivitesi arttrlan nc molekller olarak hizmet etmektedir. Doal rnler en byk kombinatoryal veri tabanlarnda bile anlatlmam eitli kimyasal yaplar sunan geleneksel yol gsterici bileiklerdir (Strobel and Daisy, 2003).

2.3. Doal rn Kayna Olarak Bitkiler

Bitkiler geleneksel doal rnlerin aktif ieriklerini ounu oluturmakla birlikte bitki ekstreleri uzun yllardan beri niversite ve farmastik irketlerinin tarama programlarnda kullanlmaktadr. Bitki leminin ounun, biyolojik aktif molekl aratrmalarnda incelendii dnlebilir. Ancak durum byle deildir. Dnyada 250 bine yakn bitki tr olduu ve bunlarn muhtemelen %10unun biyolojik aktivite ynnden test edildii tahmin edilmektedir. in ve Hindistan gibi geleneksel tp sistemleri olan lkelerde, bitkiler, yeni ila keiflerinin temelini oluturmaktadr. Dier birok kltrde geleneksel tpta kullanlan bitkiler geni bir ekilde belgelenmitir. Bitki temelli sistemler salk alannda nemli bir rol oynamakta ve Dnya Salk rgt verilerine gre dnya sakinlerinin yaklak %80i salk bakmlarnda arlkl olarak geleneksel tbba gvenmektedir. Bitki rnleri ayrca ounlukla gelimi lkelerde kalan dnyann geriye kalan %20lik poplasyonun salk sistemlerinde de nemli yer tutmaktadr. Bir alma 90 bitkiden tretilmi 119 kimyasal maddenin bir ya da daha fazla lkede kullanlan nemli ilalar olduunu gstermitir. Bu 119 ilacn %74 dorudan geleneksel tpta kullanlan bitkilerden aktif madde izolasyonu almalaryla elde edilmitir (Sreekanth, 2008 ). Geleneksel tp rnekleri, biyoaktif doal rn bolluuna yol amtr. Baz son teyitler bu kaynak zenginliini iaret etmeye yeterlidir. Artemisinin (qinghaosu) (ekil 2-1) in tbbi bitkisi Artemisia annua (pelinotu) bitkisinden izole edilen antimalaryal bir seskiterpendir ve antik alardan beri bitkisel ila olarak kullanlmaktadr. Forskolin (Bkz. ekil 2-1), Hint Ayurvedik yaztlarnda tanmlanan tbbi bitki Coleus forskohlii Briq. (Labiatae)den elde edilen

10

antihipertansif bir ajandr. M. 2800 in tbbi kitaplarnda antiastmatik ve antitssif olarak bahsedilen Gingko aac, gingkolipitler ve yapsnda tersiyer butil grubu (Bkz. ekil 2-1) bulunduran benzersiz diterpenler retmektedir. Gingko aac ekstrelerini klinik etkileri 1987 ylnda rapor edilmitir (Sreekanth, 2008 ). Kastanospermin (Bkz. ekil 2-1) Avustralya bitkisi Castanospermum australeden elde edilen, HIVin replikasyonunu inhibe eden

tetrahidroksindolizidin alkaloididir (Kharwar and Strobel, 2011).

ekil 2-1 Bitki kkenli baz doal biyoaktif rnler

11

2.4. Doal rn Kayna Olarak Mikroorganizmalar

Fleming 1929da ans eseri filamentz fungus Penicillium notatumdan penisilini bulmu ve 1940larda bu ajann geni teraptik kullanma sahip olduunu kefetmitir. Bu keif, Antibiyotiklerin Altn a olarak adlandrlan tpta yeni bir dnem balatmtr. Ayn zamanda doann youn bir ekilde yeni biyoaktif ajanlarn kayna olarak incelenmesini tevik etmi ve baz mikroorganizmalar, farmastik endstrisinin en nemli rnleri olan yapsal olarak eitli biyoaktif metabolitlerin en verimli kayna olarak kantlanmtr. Bu penisilinler (Penicillium trleri), sefalosporinler (Cephalosporium cryptosporium), aminoglikozitler, tetrasiklinler ve dier eitli yapsal tipteki dier poliketidler (Actinomycetales) gibi antibakteriyal ajanlar; immnosppresif ajanlar, siklosporinler ve rapamisin ajanlar (Streptomyces trleri) gibi fungal (Penicillium trleri) gibi trleri) gibi

metabolitler; mevastatin (compactin) ve lovastatin kolesterol-dren ve ivermektinler

(Streptomyces

antihelmintik ve antiparazitik ilalar ieren daha fazla yeni bileiklerin kefine yol amtr. Antrasiklin, bleomisin, aktinomisin, mitomisin ve aureolik asit familyalarna dhil yeleri ieren kanser kemoteraptik ajanlar da kefedilmitir. Bunlardan bazlar daunomisin trevli ajanlar, daunomisin, doksorubisin, idarubisin ve epirubisin, glikopeptidik bleomisinler A2 ve B2 (Blenoxane); aktinomisin D peptolidleri, mitomisin C gibi mitosanlar, glikozillenmi antrasenon ve mitramisin, klinik olarak nemli bileikleridir. Bu bileiklerin ou eitli Streptomyces trlerinden izole edilmitir (ekil 2-2).

Myxomycetalesden izole edilen epotilonlar, ilk bakta topolojik olarak olduka farkl olmasna ramen paklitakzele benzeyen etki mekanizmasna sahip potansiyel antitmr ajan olarak aratrmaclarn dikkatini ekmitir. nem kazanan dier mikrobiyal trevli ilalar, klinik Faz I denemelerinde olan staurosporin ve basit trevi UCN1 gibi indolokarboksazoller ve yine klinik Faz I denemeleri devam eden 17-alliloamino-geldamisin gibi geldamisin trevi bileiklerdir (Sreekanth, 2008 ).

12

ekil 2-2. Mikrobiyal kaynakl baz biyoaktif doal rnler

Yaklak 10 bin farkl mikrobiyal kaynaktan elde edilmi doal rn bilinmektedir. Bunlarn ounu antibiyotikler oluturmaktadr ve aktinomiset grubu bakteriler antibiyotik retiminde byk paya sahiptirler. Antibiyotiklerin yaklak %70i aktinomisetler iinde yer alan Streptomycetes snfndan elde edilmitir. izelge 2-1de kaynaklarna gre antibiyotiklerin dalmlar verilmitir (ner, 2011).

izelge 2-1 Kaynaklarna gre antibiyotiklerin dalmlar Kaynak Antibiyotik Says Bakteri Aktinomiset Fungus Toplam 2900 8700 4900 16500 10-12 100-120 30-35 140-160 Klinikte Kullanlan Say

13

Getiimiz 50 ylda toprak kkenli aktinomisetler zerinde yaplan almalarda ok iyi sonular elde edilmi, birok yeni biyoaktif molekl literatre gemitir. almalar ayn hzla devam etmesine ramen, toprak kkenli aktinomisetlerden elde edilen yeni bileiklerin oran gittike dmektedir. Toprak aktinomisetleriyle yaplan almalarda yeni bileiklerin bulunma orannn olduka dt, yeni almalarda karlalan molekllerin genellikle bilinen bileikler olduu, bu bileiklerin %95iyle tarama almalarnda tekrar karlald grlmtr (ner, 2011). Dahas yeni bileik tarama almalar endofitlerin toprak izolatlarndan nde olduunu gstermitir (Endofitler %51, yeni yap toprak %38) (Kharwar and Strobel, 2011 ).

2.4.1. Endofitik funguslar

1904te Darnel, Almanyada endofitlerin kefinden bu yana eitli aratrmaclar, genellikle endofitin izole edildii ve hangi amala test edildiine bal olarak farkl yollardan endofit tanmlar yapmtr. Bacon ve White (2000) endofitler iin geni ve kabul gren bir tanmlama yapmtr; bitkilerin canl i dokularnda kolonize olan ve herhangi bir olumsuz etki gstermeyen organizmalar. Bitki dokularnda endofitlerin bulunmasnn herhangi bir yan etkisinin olmamas bitki ile fungus arasnda simbiyotik ya da mutualistik bir ilikiye odaklanlmasna yol amtr. Ayrca endofitlerin biyoeitlilii ile ilgili gzlemler endofitlerin etkin saprofitler ya da frsat patojenler olabildiini de gstermitir. Bakteri ve funguslar en yaygn olarak bulunan endofitlerdir. Bitkilerde endofit olarak bulunan dier mikrobiyal formlar Mycoplasma, Rickettsia, Streptomyces ve Archae olarak grlmektedir ancak bunlarla ilgili henz yeterli bilgi bulunmamaktadr. En ok izole edilen endofitler, funguslardr. Ancak balang olarak bitkilerin byk ounluunun endofit etkileimler ynnden henz allmam olmas nemlidir. Dolaysyla yeni genuslar, biyotipler ve trler ieren yeni fungal formlarn elde edilmesi iin allmam ok byk sayda bitki olmas byk bir frsattr. Hawksworth ve Rossman (1987)n tahminlerine gre 1.5 milyon farkl fungal trden u ana kadar sadece

14

100 bini tanmlanabilmitir. Yeni kantlar elde edildike tahmin edilen saylar gittike artmaktadr. rnein Dreyfuss ve Chapela (1994) sadece endofit fungus trlerini en az 1 milyon olarak tahmin etmilerdir. yle grnyor ki, endofitler genetik eitliliin zengin ve gvenilir kayna olmakla beraber daha nce tanmlanmam birok tr sunmaktadr. Esasnda, bitkilerde bulunan organizmalarn ounun yaygn laboratuar teknikleriyle kltre alnamamas, bitkilerdeki varl ve roln daha da ilgi ekici yapmaktadr. Son olarak edinilen tecrbelere dayanarak yeni mikroorganizmann yeni doal rn kefedebilmek anlamna geldii sylenebilir. Bu bile tek bana bileik kefinde ortay kan dereplikasyon sorunlarn elimine etmeye yetecektedir (Strobel and Daisy, 2003; Bacon and White, 2000; Hawksworth and Rossman, 1987; Dreyfuss and Chapela, 1994). Endofitler, tp, tarm ve endstri alannda geni potansiyeli olan, biyoaktif ve kimyasal olarak yeni bileikler iin bol ve gvenilir bir kaynak sunan az aratrlm bir mikroorganizma grubudur. Bu snrsz kaynak sunan az anlalm mikroorganizmalarla ilgili almalar yeni balam olmasna ramen, bu alanda kefedilecek organizma, rn ve yararlarn byk potansiyelinin umut verici olduu belirginlemektedir (Tejesvi et al., 2007). Endofitik funguslarn ayn zamanda, onlar endstriyel tarama

programlarnda arzu edilir klan dier karakteristikleri de vardr. Birok tarama almas toprakta yaayan funguslara younlarken ok az endofitlerle ilgilenmektedir. Dolaysyla youn tarama programlarna girmeyen bu organizmalarn byk ounluu kefedilmemi olarak kalmaktadr. te yandan, endofitler yaayabilmek iin zel mekanizmalara ihtiya duyabilecei, ok zel habitatlarda kolonize olmaktadrlar. Bu da biyoteknolojideki yeni sekonder metabolitler iin kaynak olmasnn muhtemel aklamas olabilir. Baz spesifik hastalk hedeflerine kar kimyasal olarak eitli metabolitlerin rastgele taranmas yeni farmastiklerin kefedilmesini salamaktadr. Bu molekller dorudan canl organizmalardan alnm olabilir ya da sentetik olarak retilmi olabilir. Doa, sentetik ve kombinatoryal kimya gibi dier kaynaklarn saptayamayaca kadar, saysz eitlilikte, son derece kompleks ve daha sofistike molekller sunmaktadr. Organizmalarn geni metabolik yetenekleri gz nne alndnda, endofitlerin bu ilalarn kayna olmas ve bu yzden bitkinin basit olarak endofit gelimesi

15

iin uygun artlar salad muhtemeldir (Tejesvi et al., 2007). Kombinatoryal sentez ile bileikler rastgele retilirken, sekonder metabolitler saf kltrlerde byme iin ihtiya duyulmayan, doada baz spesifik durumlara adaptasyon salamak iin retilen dk molekl arlkl bileiklerdir. Schulz (2001)a gre belli mikrobiyal metabolitler belli evresel ve organizma seviyesindeki biyotoplarn karakteristii olarak grnmektedir. Buna gre yeni sekonder metabolit aray, benzersiz biyotoplar barndran organizmalar zerinde odaklanmaldr. Bu nedenle aratrmaclara den, ileme balamadan nce kaynak materyalini rastgele semek yerine dikkatli bir ekilde almak ve biyolojik kaynan semektir. Dikkatli almalar, srekli metabolik ve evresel etkileimler iinde olan organizmalar ve biyotoplarnn daha fazla sekonder metabolit retebileceine iaret etmektedir. (Strobel and Daisy, 2003; Schulz et al., 2002).

2.4.2. Endofitik funguslarn eitlilii ve sistematii

Hayattaki genel biyoeitlilii barndran dnyadaki saysz ekosistem ayn zamanda ok eitli ve sayda endofitleri de barndrmaktadr. Tropikal ve lman yamur ormanlar en ok eitlilik gsteren karasal ekosistemlerdir. Tehlike altndaki bu yerlerin dnyann yalnzca %1.44n kaplamasna ramen karasal eitliliin %60n barndrmaktadr. Ayrca eitlilik ynnden nemli ad edilen her 20-25 yerden biri ayn zamanda yksek seviyede bitki endemizmi de barndrmaktadr. Yksek bitki endemizmi, bu endemik bitki trlerinde bulunabilecek spesifik endofitler olarak alglanabilir. Evrimsel yarn en ok aktif olduu ekosistemlerde hayatta kalabilmek iin srekli kimyasal yenilenme art olduundan, biyolojik eitlilik ayn zamanda kimyasal eitlilik anlamna gelir. Tropikal yamur ormanlar bu tip evrelere verilebilecek en dikkate deer rnektir. Rekabet ok, kaynaklar snrl ve seim basks en zirvededir. Bunun sonucu olarak da yamur ormanlar yeni molekler yaplar ve biyolojik olarak aktif bileikler iin yksek olaslkl bir kaynak oluturmaktadr. Yaplan almalarda, tropikal blgelerden izole edilen endofitlerin rettii biyoaktif doal bileik saysyla lman blgelerden izole edilenler istatistiksel olarak

16

karlatrldnda, tropikal ve lman endofitler arasnda anlaml metabolik farkllk olduu ortaya koyulmutur. Bu karlatrma tropikal endofitlerin daha aktif bileik rettiini ortaya koymakla beraber ayn zamanda dier ortamlardaki funguslara oranla daha ok sayda endofitin daha ok sayda bileik rettiini gstermitir. Bu gzlem ekosistemin de an az konak bitki kadar endofit canllarn genel metabolizmalarnda etkili olduunu desteklemektedir (Kharwar and Strobel, 2011 ). Taksonomi, canl snflandrmasnn sklkla deitii dinamik ve ilerici bir disiplindir. Hatta trlerin ne olduu ve taksonomideki temel pozisyonlar, mikologlar tarafndan farkl gsterilebilmektedir. Bu nedenle, fungal trleri tanmlamak iin ok sayda farkl gr mevcuttur. Bu grler, morfolojik karakterleri, bu karakterlerin kombinasyonu ve zel evrelere adaptasyon gibi eitli yaklamlara dayanmaktadr. Ancak, bazlar herhangi bir seksel ya da aseksel fungusa uygulanabilir deildir. Filogenetik yaklamlardaki ilerlemeler ve molekler biyoloji teknikleri ile birletirilmesi, zellikle DNA nkleotid dizi analizleri, geleneksel sistematii derinden etkilemi ve nemli deiikliklere yol amtr. Yeni filogenetik kavram, prensip olarak herhangi bir eeyli remeye rastlanmayan fungal gruplar iin uygundur. Funguslarn snflandrma sistemi, tarihsel olarak basite gzlenebilir morfolojik zellikleri ve bunlarn kyaslanmasna dayanmaktadr. Bu nedenle, tanmlamada bavurulan temel yaplarn bymesini salamak iin fungal kltrler zorunludur. Gzlenecek en nemli karakteristikler konidia ve oluumundaki sretir. Ek olarak, pigment oluumu ve hif ekli, septann olup olmamas, sklerotia, klamidosporlar veya dier bir zel hifal element, hem anamorf hem de telemorf fazlarn snflandrlmasna ok yardmc olabilir (Gallo et al., 2008). Fungi alemi iinde yer alan organizmalarn yaam dnglerinde hem eeyli hem de eeysiz reme safhalar yer almaktadr. Funguslarn snflandrlmasnda kullanlan temel kriterler, yaam dnglerinin eeyli safhasnda oluturduklar bu reme yaplardr. Ancak eeyli reme yaplar zel koullar altnda oluturulduu iin baz funguslarn eeyli safhas ya henz belirlenememi ya da baz funguslarda bu safha tamamen ortadan kalkm olabilir. Bundan dolay gnmzde funguslar iki ekilde snflandrlmaktadr. Bunlardan, funguslarn yaam dnglerinin eeyli safhalarnda oluturduklar fruktifikasyon yaplar,

17

eeyli sporlar ve tallus yaplar kriter alnarak gerekletirilen snflandrma telemorfik snflandrma olarak adlandrlr. Eeyli reme yaplar tespit edilemedii iin, baz funguslar tallus yaplar ve eeysiz sporlar gz nne alnarak snflandrlrlar, bu snflandrma biimi ise anamorfik snflandrma olarak adlandrlr. Anamorfik snflandrmada kullanlan yntemlerin ortak zellii gzlemlere dayal olmas, fazla zaman almas ve hata yapma olaslnn fazla olmasdr. Baz funguslarn snflandrlmasndaki bu belirsizlik ou zaman ayn taksona iki farkl isim verilmesine hatta farkl organizmalara da ayn ismin verilmesine neden olabilmektedir. rnein mayalarn taksonomisinde en nemli kaynaklardan biri kabul edilen Lodder ve Kreger-van Rij (1952) literatrne gre, Saitoella complicata olarak tehis edilmi 2 maya izolatyla (Himalayalardan izole edilen) daha sonra yaplan bir takm molekler almalar (mevcut trn morfolojik benzerliine ramen) bu iki izolatn farkl trler olduklarn ortaya karmtr. Yamazaki ve Komagata (1981)nn almasna kadar nceki tehisten hi kimse phe duymamtr. Literatrde, fenotipe dayal hatal tehis konusunda olduka fazla alma vardr (Klolu ve zko, 2008). Sekonder metabolit retim modellerine gre funguslarn snflandrlmasna ynelik birok giriim gerekletirilmitir. Ancak bu metodun fungal taksonomiye uygulanmas bu bileiklerin evresel ve kltr koullarna bal olarak deitii iin sorgulanmaldr. Morfolojik, genetik, mikotoksin ve metabolit profilleri ieren kimyasal zellikler ve metabolomik gibi birletirilmi metotlar, genel fungal taksonomi iin kemotaksonomik karakterlerin yararn vurgulamaktadr. Benzer ekilde, hcresel ya asidi profillerinin grevi fungal genusa ve kltre alnan fungusun scaklk deiimine bal olarak daha ok ya da daha az spesifiktir. Basidiomycetes ve Ascomycetes gibi baz gruplar tutarl bir biimde birbirinden ayrt edilemez. Bununla birlikte, edinilen bilgiler, farkllklarn snrl olduu ve funguslar gibi miselya sterilia ve vezikler-arbuskler mikorizal endofitler gibi morfolojik farkllamalarn minimal olduu intraspesifik seviyede de deerlidir (Gallo et al., 2008). Hcre duvar polisakkaritleri ayrca fungal taksonomi ve evrim asndan nemli rol oynayan bir zelliktir. Basit polisakkarit yapsndaki ince modifikasyonlar yakn genera (Eupenicillium, Talaromyces, Neosartorya, Chaetosartorya, vb.) veya Penicillium, Paecilomyces, ve Fusarium gibi ayn

18

genusa ait tr gruplar iinde farkllklar oluturan yapsal bileikler retir. Ayrca, farkl eker dizileri, yksek taksonlar snrlayabilir; rnein, Onygenales ve Eurotiales seviyeleri tek eker dizileri ierirken, Hypocreales kompozisyonunda glukuronik asit bulundurur (Gallo et al., 2008). Elektroforetik metotlarla yaplan izoenzim analizleri, fungal genetik, poplasyon biyolojisi ve taksonomideki bir ok problemi zmekte kullanlan dier gl ve uyarlanabilir bir tekniktir. zellikle generik ilikiler ve bakalam geiren trlerin belirlenmesinde de kullanlabilir. zoenzim analizinin kusuru DNA-temelli markrlere gre daha dk polimorfizm seviyesi olmasdr. Bununla birlikte, test edilen enzim sistemlerinin miktarlar ykseltilerek bu kusuru giderilebilir (Gallo et al., 2008). Bu tr karklklarn nlenmesi iin gnmzde gvenilirliinden dolay molekler yntemler sklkla kullanlmaya balamtr. Molekler yntemlerde arlkl olarak kullanlan molekl DNAdr. Evrimsel deiikliin ilk olarak yansd molekller olan DNA ile yaplan aratrmalar daha gvenilir ve hzl sonulara ulamamz salayabilir (Klolu ve zko, 2008). Molekler tanmlama ve filogenetik almalar byk lde ribozomal DNA (rDNA) zerindeki dizi polimorfizmine dayanmaktadr. rDNAnn bu kadar popler olmasnn nedeni, ok sayda kopyas olmas, protein kodlamayan ama hemen hemen her zaman tek lokus geni olarak davranmasdr. Ek olarak ribozomlar ortak bir evrimsel kkeni gsteren btn canllarda bulunmaktadr. Bu metoda gre funguslar snflandrmak iin, DNA ekstraksiyonu, PCR ile oaltma, DNA dizileme, dizi ve filogenetik analizi gibi prosedrlerin izlenmesi gerekir. Fungal kltrlerden DNA ekstraksiyonu, tamamlanmas bir saatten fazla zaman alan zahmetli bir admdr. Bununla birlikte daha hzl ve verimli bir ekstraksiyon iin gelitirilen sreyi 15 dakikaya kadar dren, filtre kartlar teknii kullanlabilir. PCR ile ilgili olarak, molekln transkribe edilecek blgeleri, genellikle 5.8S, 18S veya 25S ile birlikte i ve d transkribe ayrclar (ITS ve ETS)dr. Her ayrc kopya transkripte katlr. Her bir kme (Cluster) arasnda kromozom zerindeki tekrarlar arasnda bir ayrm salayan transkribe olmayan ya da intergenik ayrclar (NTS ya da IGS) bulunur. Sonra dizi reaksiyonlar gerekletirilir ve diziler hizalanr. Filogenetik analiz, parsimoni,

19

komu katlm ya da Metropolis-coupled Markov chain Monte Carlo (MCMC) yaklamn kullanan ve MRBAYES bilgisayar programna uygulanm filogenetik interferansn Bayesian metodu gibi metotlarla yaplabilir. Nklear rDNA dizileri ok bilgi ieren ve genustan intra ya da interspesifik dzeylere karlatrma olana sunmaktadr. rDNA ile ilgili ok fazla bilgi olmasna karn, belli genuslarda baz trler hala ayrt edilemez durumdadr. rnein Fusariuma ait 11 trn ayrt edilmesi iin ITS1, ITS2 ve 5.8S ile evrili rDNA fragmentlerine ek olarak, tek kopya genleri olarak bulunan cellobiohidrolase-C ve topoizomeraz II genleri analizin doruluunu arttran yeni molekler markrler olarak kullanlmtr. Dahas, rDNAnn geni altnite (LSU) geni, arbuskler mikoriza funguslarnn taksonomik snflandrmas ve filogenetik ilikilerinin belirlenmesinde olduka kullanl molekler markrlerdir. Dizi analizine dayal daha iyi tanmlama amal, bilinen dizilerin multilokus veritaban, oligonkleotid barkod TrichOKEY ve TrichoBLAST programlar gelitirilmitir. Balantl olarak, bu ilerleme 100 Trichoderma trnn snflandrlmasna olanak salamtr. yi ekilde korunmu LSU rRNA kodlayan dizi ve deiken kodlanmayan ITS1 dizisini ezamanl kullanlmas genetik olarak ayrt edilemeyen Hint erkek misetomasndan izole edilen Polycytella hominis ve misetomaya neden olan Pseudallescheria boydii anamorfu Scedosporium apiospermum arasnda balant kurulmasn salamtr. Benzer bir zellik yeni Ascomycetes taksonu

Arthroderma olidum ve insan derisinden izole edilen Trichophyton eboreum arasnda da bulunmutur. Genel izolasyon prosedrleri srasnda eitli mikroorganizmalar sklkla gzden kam olabilmektedir. nk ilk fungusun remesi dier funguslarn remesini inhibe edebilir. Ayrca birok mikroorganizmalar yapay ortamlarda reme gstermezler ve bunlarn kltre alnmas zordur. Ara sra herbarium trleri; taksonomik etkiler, filogenetik ilikiler ve kompleks fungus dalmlarn deerlendirmek iin incelenmektedir. Bu durumlarn hepsinde, kltrden bamsz rRNA ve rDNA genlerine dayanan molekler teknikler, izolasyona gerek duymadan birok sayda mikroorganizmann tespit edilmesini salayabilir. Bitki dokusundaki fungal rDNA fragmentlerinin oaltlmas iin yzeydeki btn epifitik organizmalar yzey sterilizasyonu ile uzaklatrlr ve standart

20

protokollerle DNA ekstraksiyonu iin segmentler kurutulur. RFLP analizi ve rDNA ITS ya da 5.8S blgesinin dizilenmesi gibi molekler biyoloji tekniklerinin kullanlmasyla bitki dokusunda yaayan endofitik fungus topluluklarnn eitlilii ounlukla genus ve tr seviyesinde belirlenebilir (Gallo et al., 2008; Klolu ve zko, 2008). Funguslarn sistematii olduka deikendir. Fungi lemi iindeki gruplarn belirlenmesi ve snflandrlma abalar olduka eski olmakla birlikte, 2004 ylnda balatlan ve u anda da devam eden AFTOL ad verilen ortak bir alma ile (yeni molekler filogenetik yntemler kullanlarak) funguslarn tm gruplarnn en yksek seviyede molekler (filogenetik) snflandrlmas hedeflenmitir. Bu almada toplam 195 taksonu ieren bir fungus grubuyla allm ve sonuta 7 filum [Chytridiomycota, Neocallimastigomycota, Blastocladiomycota, Microsporidia, Glomeromycota, Dikarya: (Ascomycota, Basidiomycota)], 10 subfilum, 35 snf, 129 ordo eklinde bir snflandrma elde edilmitir (Klolu ve zko, 2008). Molekler veriler fungi lemindeki yksek seviyeli taksonomik gruplarn ve byk evrimsel soylarn belirlenmesinde, dk taksonomik seviyelerde ise trlerin, ksmi poplsyonlarn ve bireylerin tehisinde kullanlmaktadr. Ancak molekler verilerin yaygn kullanmnda baz snrlandrmalar da mevcuttur. Bunlardan bazlar, farkl fungal gruplar arasnda yntemlerin karlatrlabilirlii ve uyumluluuyla ilikiliyken bazlar fungusun adapte olduu hayat dngsnn eitliliiyle ilikilidir. Molekler verilerdeki mevcut snrlandrmalara ramen, fungal sistematii anlamamz kolaylatrd ve bu konuyla ilgili verilerdeki arta bal olarak gelecekte sistematik uygulamalarda daha aklayc olabilecei dnlmektedir (Klolu ve zko, 2008). Fungal trler arasndaki polimorfik DNA dizilerinden biri olan ITS blgesi, gnmzde bir trn doru olarak tespiti asndan iyi bir aday olarak grlmekte ve bu uygulama ile dier tm trlerden byk lde ayrlabilmektedir. Bununla birlikte, ITS dizilerindeki varyasyon ve bu varyasyonu dorudan deerlendirebilen PCR temelli teknikler sayesinde fungusun izolasyonuna gerek duyulmakszn konuku bitkiler iindeki ve evresindeki birok fitopatojenik fungal trn belirlenmesi mmkn hale gelmitir. Kodlanmayan iki deiken

21

blgeden meydana gelen ITS blgesi, olduka korunmu kk alt birim (SSU) ile 5.8S alt birimi arasnda (ITS1 blgesi) ve de byk alt birim (LSU) rRNA genleri ile 5.8S alt birimi arasndaki blgede (ITS2) yer almaktadr (ekil 2-3).

ekil 2-3 Funguslarda rDNA blgesi

ITS blgesi 4 temel nedenle funguslarda molekler karakterizasyon almalar iin zellikle kullanldr: i. ITS blgesi nispeten kktr (500-800 bp) ve evrensel tek bir primer ifti (rRNA alt birimleri iindeki korunmu blgelerin komplementeri) kullanlarak PCR ile kolaylkla oaltlabilir. ii. rDNA birimlerinin ok sayda tekrarlarnn olmas nedeniyle, seyreltik ya da olduka paralanm DNA rneklerinden bile ITS blgesi kolaylkla oaltlabilir. iii. Morfolojik adan farkl trler arasnda ITS blgesi yeterince deiken olabilir ve bundan dolay ITS-RFLP restriksiyon verileri genetik uzakl tahmin etmek iin kullanlabilir. analizler iin karakterler salayabilir. iv. ITS tre zg problar, bir kromozomal ktphane oluturmaya gerek kalmakszn hzl bir ekilde PCR ile retilebilir. Birok aratrc dizilerin tekrarlayan birimler eklinde olmas ve trler arasnda deiken, tr iinde benzer olma eiliminde olmasndan dolay, tre zg problar gelitirmek iin dizileri ITS blgesinden semektedir (Klolu ve zko, 2008). Bylece filogenetik ve sistematik

22

Getiimiz 10 yl kapsayan literatre baktmzda 770 fungal trn endofit olarak izole edildii grlmektedir. Buna karn bu trlerin byk bir ksm tanmlanmamtr. Tanmlanan trler arasnda Alternaria sp.; A. infectoria,

Aspergillus sp.; Colletrotrichum sp.; C. gloeosporioides; C. musae; Guignardia sp.; Nigrospora oryzae; N. sphaerica; Penicillium sp.; Phomopsis sp.; Rhizoctonia sp.; Xylaria sp. bulunmaktadr. Endofitik funguslarla ilgili almalarn byk ounluu, tropikal almalarn says artm olmasna karn lman bitki endofitlerine odaklanmtr. Tropikal endofitler zerine almalar, bu organizmalarn global fungal eitlilik tahminlerindeki rol ve yeni doal biyoaktif bileik kayna ve tropikal yaylta kullanmak iin biyolojik kontrol ajanlar kayna olarak bitki topluluu dinamikleri tarafndan tevik edilmektedir. Tropikal fungal eitlilik hakknda bilgilerin geniletilmesi iin, Guyana, Panama, Hindistan, Porto Riko, Brezilya, Avustralya ve Ekvadordan eitli trler allm ve global trlerin miktarnn ve fungus bitki ilikilerinin doru belirlenmesi asndan ok nemli olmutur. Bu balamda, baz yazarlar, zenginlik ve ncelii konak bitki ve tropikal blgelere spesifik olabileceini destekleyen, konak ncelii, allan substratta uzman (tropikal monokotiledon konak aile gibi) ve morfo trler arasnda sonsuz eitlilik iin kantlar bulmulardr. Aksine May (1991)in hipotezine gre, tropikal funguslar lman zdelerine gre daha az konaa zgdr. nk yksek eitlilikteki tropikal ormanlar, konak dalmnn ayrlmas nedeniyle konak spesifikliine kar davranabilir (May, 1991; Gallo et al., 2008).

2.4.3. Endofitlerin izolasyon ve saklama teknikleri

Mikrobiyal endofitlerin izolasyonuyla ilgili detayl teknikler birok derleme ve makalede belirtilmitir. Eer endofitler kutup blgelerinden, kurak tropiklerden ya da lman blgelerden elde edilecekse, bitki rnei bana (0.5 -10 cm para) 02 endofit kltr elde edilebilir. Ancak daha nemli ve slak blgelerde bu say bitki paras bana 20-30 ve daha fazla olabilir. Snrl fermentasyon

23

koullarnda, taze izole edilmi organizmalarn etiketlenmesi ve saklanmas ileriki almalar iin kritik neme sahiptir.

2.4.3.1.

Bitki seimi

Bitkisel ilalar dnyann bilinen en eski salk amal formlarndan biridir. Dnyadaki her bitki en az bir endofitik organizma barndrmaktadr (Tejesvi et al., 2007). Bitki seimi yaplrken kullanlacak metot ve yollarn; genus, tr ya da biyotip seviyesinde yeni endofitik mikroorganizmalar izole etmek iin en iyi frsat sunmas nemlidir. Dnyadaki bitki says ok fazla olduundan, biyoaktivite gsteren endofit arayn hzl, yaratc ve yeniliki metotlar kullanlmaldr (Kharwar and Strobel, 2011 ). Endofit izolasyonu ve doal rn kefi iin toplanan her bir bitki iin spesifik yntemler kullanlr. Bitki seim stratejilerini belirleyen birka hipotez vardr (Kharwar and Strobel, 2011; Yu et al., 2010); i. zel habitatlarda zellikle bozulan ekolojik evrelerde yaayan ve yaamak iin zel yeteneklere sahip bitkiler alma iin seilmelidir. Byle evrelerde bitkilerin yaama gcnn, dokular iinde barndrd endofitlerden kaynakland dnlebilir. Bunun rneklerinden biri s deniz kylarndaki gelgitlerde yetien zel ekosistem mangrov ormanlardr. Bu mangrov ormanlarnda yaplan almalarda 12 endofit tr izole edilmitir. ii. Baz yerlerde insanlar iin geleneksel ila olarak kullanlan etnobotanik tarihe sahip bitkiler tercih edilmelidir. Bu bitkiler dorudan yerli insanlarla grerek ya da yerli kaynaklar incelenerek bulunabilir. Bu yaklam ayn zamanda ortak aratrma program bnyesinde yardmlar belgelemek suretiyle yerli ve kabilelerin de yararnadr. Bilimsel etik, zellikle yerli insanlarn bilgisi kullanld durumlarda, aratrclarn parasal ve entelektel faydalar tek bana almasn snrlandrmaktadr. Bununla birlikte dokmantasyon srasnda, bilim adamlar bavurduklar kaynaklara ve yerli insanlara gereken nemi vermezler ve bu durum aratrma toplumunun kutsalln salamak iin kontrol edilmelidir. Eninde sonunda

24

belki botanik kaynan iyiletirme gcnn bitkinin doal rnlerinden deil de bitkide barnan endofitlerden olduu ortaya kabilir. iii. Endemik bitkiler, benzersiz ekilde uzun mrl ya da Gondwanaland gibi antik olduu kesin olan topraklarda yaayan bitkilerin aktif doal bileik reten endofit bulundurma ihtimali dier bitkilere gre daha fazladr. iv. Byk biyoeitlilie sahip alanlarda yetien bitkilerin geni biyoeitlilie sahip endofitleri barndrmas muhtemeldir. Dolaysyla, dnyadaki en byk eitlilie sahip tropikal yamur ormanlar endofitler iin bir hazine konumundadr. v. Herhangi bir belirti olmadan patojenler tarafndan enfekte edilmi bitkilerle evrili bitkiler, dier bitkilere gre antimikrobiyal aktivite tayan metabolitler bakmndan daha byk potansiyele sahip olabilir. Endofitiklerin konaklar kyaslandnda (ekil 2-4) bugne kadar antimikrobiyal endofit taramalar iin, tbbi bitkiler, tahllar ve zel evrelere sahip bitkilerin younlukla alld grlmektedir.

ekil 2-4 Biyolojik aktivite ynnden test edilen izolatlarn kaynaklarna gre dalm

Tbbi zelliklere sahip bitkilerin says gda kayna olarak kullanlan bitkilerin saysndan ok fazladr. Tbbi adan nemli ve etnofarmakolojik olarak kullanlan bitkiler Hindistan yarmadasnda olduka yaygndr ve insanlarn bitkilerden ve dier doal kaynaklardan ilalar nasl trettiklerini aklamaktadr. ifal bitkiler hakknda yerel bilgilerin kefi hastalklarn tedavileri iin ipular

25

verebilir. Charakasamhita ve Sushrutasamhita gibi nemli antsal Ayurveda almalarnda, Ayurveda, Homeopathy, Siddha ve Unani tp sistemlerinde kullanlan 700e yakn bitki listelenmitir. Bu liste; astm, kardiyovaskler problemler, diyabet, mikrobiyal enfeksiyonlar ve bronit gibi eitli hastalklarn tedavisinde kullanlan bitkisel ilalar iermektedir. Ayrca birka bitki tr endofitleri iin sistematik olarak allmtr. Belgelenen btn bitki trleri daldklar nokta ve taksonomilerinden balanarak ve ayn zamanda kimyasal ve mikrobiyal profilleri de ele alnarak deerlendirilmelidir (Tejesvi et al., 2007). Avustralyann kuzey blgesinde bulunan ve zsuyu geleneksel tara ilac olarak kullanlan ylan asmas, Kennedia nigriscans, etnobotanik tarihe sahip bitki rnei olarak verilebilir. Aslnda bu blge dnyann en uzun sre yaayan insan toplumu Avustralya aborjinlerine ev sahiplii yaptndan bitki toplamak iin seilmitir. Gneybat Arnhemland blgesindeki Aborjinler, kesik, yara ve enfeksiyonlarda kullanmak zere ylan asmasn toplar, tr ve su iinde stp demlerler. in asl, bitki, bir takm streptomisetler iermektedir. Bunlardan biri olan Streptomyces NRRL 30562, GenBanktaki dier trlerle karlatrldnda kendine zg paral 16S rDNA sekansna sahip olduu grlmtr. Bu tr, aktinomisin D, Xo, ve X2 gibi antibiyotikleri ieren bir dizi aktinomisin retmektedir. Ayrca yeni ve geni spektrumlu peptid antibiyotikleri olan munumbisinleri de retmektedir. Bu bitki, yerli insanlar ve aratrclarn bilgisine bavurmann yararlarn gsteren iyi bir rnektir (Kharwar and Strobel, 2011). Yerli insanlarn kefettii iyiletirici etkinin, bitki rnlerinden kaynakland gibi bitki ile birlikte yaayan bir ya da birka endofitin rettii bileiklerden kaynaklanabileceini kabul etmek gerekir. Ayrca, biyoaktif doal rnler reten baz bitkiler, ayn doal rn reten endofitleri barndrrlar. Son derece fonksiyonel bir diterpenoid olan ve Taxus brevifolia ve dier porsuk aac trlerinde bulunan nl antikanser ajan Paklitakzel bunun en iyi rneidir. Paklitakzel ayn zamanda Taxus brevifoliadan izole edilen fungus Taxomyces andreanae tarafndan da retilmektedir (Kharwar and Strobel, 2011 ). Akll ve etkili endstriyel mikroorganizma taramalar, yksek eitlilikte organizmalarn ele alnmasyla beraber, ayn zamanda, taranan taksonlar

26

arasndaki fark en aza indirmeyi gerektirir. Buna ulamann yolu, rneklerin alnaca bitki zerindeki zel ekolojik oyuklarda mikroorganizmalarn kolonize olma ekli ve floristik kompozisyonu anlamaktan geer. Bu zel endofitik konaklarda yaayan muhtemel trler ve greceli okluklar nedir, bir rnek ya da bireysel bir aa rneinden ka tane muhtemel tr izole edilebilir, tr zenginlii ve floristik kompozisyon bir blgedeki rnekler arasnda deimekte midir, izolasyon ortam ve zel bitki organlar tr kazanmn etkiler mi gibi sorular anlamak gerekir. Endofitler genellikle konak bitkiyle intergenerik-genetik deiimlere maruz kalmaktadr. Bu tarz bir deiimin olabilmesi iin muhtemelen bitki hcreleri ile mikrobiyal orta arasnda ileri ortaklklarn kurulmas gerekmektedir. Gl antikanser ajan takzol reten fungus ve onun kona porsuk aac ve klasik eltik bitkisinden elde edilen fitohormon reten fungus (Gibberella fujikuroi) rnekleri nemli kimyasal bileikler reten mikroorganizma araylarna bitki dokularndan balanmas gerektiini gstermektedir. Bitkilerin ou, antimikrobiyal bileiklerin retilmesiyle ksmen bitki igalci patojenlere kar koruma salarken, baz durumlarda bu bileikler bitkinin ortak mikroflorasnn rn olmaktadr. Bu tr bitkilerin endofitik izolasyonu iin aratrlmas yeni ve ilgin organizmalarn bulunmasna yol aabilir. Bu, rastgele taramalara ek olarak nc ve ynlendirilmi bir yaklam salamaktadr (Tejesvi et al., 2007). Endofitik funguslarn izolasyonu

2.4.3.2.

Endofit izole etme almalarnn ou temel mikrobiyolojik teknikleri bilen herkes iin olduka basittir. Genellikle endofitlerin izolasyonu ilk olarak seilen bitkinin grnrde salkl olmas prensibine dayanmaktadr. Ardndan devam eden prosedrler, greceli olarak basit ve balang olarak epifitik mikroorganizmalarn sterilizasyonuyla ilgilidir. Endofit izolasyonunda en hayati ihtiyalardan biri taze bitki materyallerinin elde edilmesidir. Kurumaya kar nlem ihtiyac yeterli havalandrma ile dengelenmelidir. Kurumaya kar nlem, doku lmlerini yavalatrken; havalandrma, bakteri ve fungus kontaminasyonlarnn remesini minimize eder. Az kapal plastik torbalarda uzun sreli tanmadan kanlmaldr. Salam kat torbalar, balmumu kat

27

torbalar, zincir-kilitli, sebze tanmas iin tasarlanm delikli torbalar birok bitki dokusunun geici depolanmas ve tanmas iin uygundur. Eer bitkiler daha uzun sre, zelikle derin dondurucularda, depolanacaksa doku kurumas olur. Buna ramen bir yldan fazla dondurulmu halde depolanan odunsu dokulardan artc sayda fungal tr izole etmek mmkn olabilir (Gallo et al., 2008; Tejesvi et al., 2007) . Yzey ilemleri genellikle, dardan gelen maddeleri uzaklatrmak iin bitki materyallerinin musluk suyu altnda deterjanla ya da deterjansz ykanmasyla balamaktadr. Ardndan, bitki materyalleri tamamen kuruyana kadar steril filtre kad ya da kurutma kad zerinde hava akm altnda braklr. Etanol (EtOH) ve Tween 80 gibi yzey aktif ajanlar ile bitki materyalleri alkalanr ardndan yzey sodyum hipoklorit (NaOCl) ya da hidrojen peroksit gibi sterilizasyon ajanlar ile sterilize edilir. Standart metot; bitki materyallerinin birka dakika EtOH ve NaOCl iine daldrlmasn ierir. Bitki materyalleri bazen aleve tutulur ve laminer-flow kabinde kurumaya braklr. Bu ilemler yzeyde bulunan kontaminasyonlar uzaklatrmak iin yaplmaktadr. EtOH srfektan olarak i grrken NaOCl esas sterilizasyon ajandr. NaOCl seyreltme oran ve daldrma sresi konak bitki ve dokusuna gre deiir. Genellikle daha kaln st derisi olan odunsu dokular, narin olanlara gre daha sk sterilizasyona tabi tutulur. Testler, bir seri EtOH- NaOCl -EtOH uygulamasnn ok yaygn kontaminant funguslarda bulunan kaln duvarl sporlar etkili bir ekilde ldrdn gstermitir. Yzey aktif ve sterilizasyon ajanlarnn konsantrasyonu bitki doku trne gre deimektedir. Yzey sterilizasyon ileminden sonra, steril bir bak ile d yzeyler ayklanr ve i dokudan epidermis, kambium, ksilem ve floem elde etmek iin dikkatlice rnekler alnr ve farkl organizmalar izole etmek iin besin ynnden zengin ortamlarn olduu petrilere yerletirilerek lk bir odada 3-4 hafta inkbe edilir (izelge 2-2). Kloramfenikol ya da gentamisin gibi antibiyotikler bakteriyel kontaminantlar engellemek iin kullanlabilir ve petrilerde fungus kolonilerini saf halde elde edebilmek iin hifal ularn bymesi takip edilir. Baz Streptomyces trleri gibi bakteriyel formlar da dk bir ihtimalle bitki dokularndan gelebilir. Spesifik bitki materyalleri zerinde spor oluturmas tevik edilen endofitler, morfolojik ve molekler biyolojik teknikler kullanlarak tanmlanr. Endofitler saf halde elde

28

edildikleri zaman farkl koul ve ortamlarda reme yetenekleri test edilir. Msr unu ya da Brainheart infzyon gibi birka zenginletirilmi ortam, termal dimorfik funguslar iin bymeyi salarken, patates dekstroz agar, Sabouraud gibi orta zenginlikte ortamlar, dekstrin ve dier kompleks karbonhidrat tabanl ortamlar ilgin endofitler izole etmek iin kullanlr. Siklohekzimid ve Rosebengal, ortamlarda hzla byyen ve yava byyen funguslar basklayan saprofit funguslar inhibe etmek iin kullanlabilir. Son olarak, en son alkalama suyundan bir rnek de sterilizasyonun baarsn deerlendirmek iin petrilere ekilebilir. Fungal oluumlar antibiyotik iermeyen taze bir ortama alnarak fungal kltrler dikkatle incelenir ve konidya oluum mekanizmas ve konidiyal karakterlerine gre morfolojik olarak tanmlanmaya allr. Bununla birlikte baz izolatlarn spor oluumunu indklemek iin, muz yapra emdirilmi PDA, oatmeal (yulaf unu) agar, malt ekstrakt agar, bitki kaynakl doku fragmentleri ve eitli endstriyel ortamlar gibi farkl ortamlarda kltre alnabilir (Strobel and Daisy, 2003; Gallo et al., 2008; Tejesvi et al., 2007). Ne amala kullanlacana baklmadan referans bir stok ya da materyal tipi olarak fungal trlerin saklanmas, tekrar retilebilir bir sonu almak asndan stratejiktir. Bununla birlikte canl funguslar da ieren ticari biyokimyasal retim yapan btn laboratuarlar, funguslar canl tutacak uygun bir yol bulunduran kltr koleksiyonlarna sahip olmak zorundadr. Tercihen saklanan sular uzun periyotlar boyunca canl kalmal ve morfolojik, fizyolojik ve metabolik bakalamlara neden olabilecek mutasyonlara kar dormant olmaldr. Canlln yan sra fungal konidyalarn test altndaki ekipman ve malzemelere yaylp remeye neden olan yaplar oluturmas nedeniyle fungusu sporulasyonda tutmak daha nemlidir. Buna ramen saklama metodunun seimi, istenen hizmete, eldeki laboratuara ve dier faktrlere baldr. rnein eitim amal bir koleksiyon iin istikrarl ve uzun mrl ulusal bir kltr deposu gerekli deildir. Taksonomik koleksiyonlar fungusun konidyal formunun korunmasn gerektirirken endstriyel koleksiyonlarda stabil metabolik durumu salamak gerekmektedir. Getiimiz yzyldan bugne fungal kltrlerin saklanmas iin eitli metotlar gelitirilmitir. Srekli ya da sspanse fungus metabolizmalarna gre bu metotlar iki gruba ayrlabilir. lk grup, steril suda, agarda seri transferler, standart soutucularda 5-8 0Cde saklamak, -20 0C dondurucularda saklamak, tuzlu suda,

29

mineral ya da parafin yanda, oda artlarnda tahl ve toprakta saklamak gibi yntemleri iermektedir. kinci grupta ise, silika jel, dondurarak kurutma ya da liyofilizasyon, sv azot ve -70
0

C de kriyojenik dondurucu boncuklar

kullanlmaktadr. Kriyo-saklama metotlar, sekonder metabolit retimini stabil kalmas ve canlandrma sonras baz funguslarda nemli polimorfizm gsteren genetik farkllamalarn minimize edilmesi nedeniyle uzun sreli saklamalarda en uygun metot olarak kabul edilmektedir. Bununla birlikte bu yntem pahal ve zellikle tip ve patent bavurularnda kullanlan deerli stok ve izolatlar iin uygundur. Ek olarak fungus hcrelerinin geri kazanlmasna etki eden, kriyoprotektan, soutma hz, saklama scakl ve eritme hz gibi baz faktrler vardr. Liyofilizasyon byk koleksiyonlar iin daha uygun ve tercih edilen bir metottur. 20-40 yl saklama durumlarnda, saklanan izolatn ldrc bir hasar olmadan optimum canllkta elde edilmesi iin zdrme sresi gibi kstlamalar olmasna ramen, dikkatlice tasarlanm ve kontrol edilen protokoller gerekmektedir. Bunun dnda bu teknikle yalnzca fungal konidya canl kalmamaktadr. Daha makul bir metot, Castellani metotu, kk laboratuarlar iin ekonomik ve basit olmasnn dnda, birok fungus trnn saklanmasnda, canlln zel organizmalara bal olduu ve bu nedenle uzun sreli saklamalarda canllk ve morfolojik kararlln korunmas iin ikinci bir saklamann saland durumlarda bile tatmin edici koruma salamaktadr. Castellani metodunda, fungal kltr paralar, iinde steril distile su bulunan kapakl tplerde ve oda scaklnda saklanmaktadr. Silika jel iinde saklamann ucuz, basit ve genetik markrler iin gvenli olduu gsterilmitir. Ancak funguslar yl spor oluturmas deimektedir. gerekmektedir Tekrarlanan ve agar genellikle pasajlar, Zygomycetes, zaman alan, Ascomycetes ve Deuteromycetes gruplarna yneliktir. Ek olarak saklama 2 ile 4 arasnda kontaminasyonlara ak ve sentetik ortamlarda fungus sporulasyonlarnda canlln kaybna yol amasna ramen, birok koleksiyon bu ekilde korunur. Son olarak bu metot Sporothrix schenckii izolatlarnda deerlendirilmitir. Morfolojik zelliklerin korunduu ancak niasta hidroliz kapasitesi ve potasyum iyodit duyarll gibi fizyolojik zelliklerin deitii bildirilmitir (Castellani, 1967; Hartung de Capriles et al., 1989; Gallo et al., 2008).

30

izelge 2-2 Endofit fungusalarn izoalsyonunda kullanlan yzey sterilizasyon teknikleri

Ykama EtOHde alkalama Yzey EtOHde Distile Su le nkbasyon alkalama (gn, scaklk) Musluk suyunda ykama (MSY) Su Deterjan MSY d ve %70,
c

Dezenfeksiyonu alkalama

%70

%3, 3 dakikaa

%70

2 kez

3-15, 28oC

%15, 1 dakikab

%70, dakika

1 Belirtilmemi c

Belirtilmemi

1 dakika %70,1 dakika %5, 5 dakikaa

Belirtilmemi 2 kez, 1 dakika

30 0Ce

MSY

%75, 1 dakika

%6, 3 veya 5 dakikaa 1 %5.3, 5 dakikaa

%75, 0.5 dakika %75, 0.5 dakika

3 kez

30, 25oC

MSY

%70, dakika

Belirtilmemi

Birka 27oC 30 0C

gn,

MSY d

%70, dakika

1 %6, 5 dakikaa

Belirtilmemi 2 kez, 1 dakika

MSY

%95, dakika

1 %6, 5 dakikaa

%95, 0.5 dakika

3 kez

4-5, 25oC

Su Deterjan MSY f

ve %70, dakika %75, dakika

1 %3, 4 dakikaa

%70, 0.5 dakika

1 kez

3-8, 18oC

1 %34, 10 dakika

%75, 0.5 dakika Kullanlmad

Belirtilmemi

22oC

Su Deterjan
a

ve Kullanlmad %0.5, 20 dakika

1 kez

22oC

: NaOCl zeltisi b: Hidrojen peroksit zeltisi c:steril filtre kadyla kurutma d: ak havada

kurutma e:muz yapra agarda kltivasyon f: tohumlarda kullanlan teknik

31

Sonu olarak, belli ideal bir metot olmamakla beraber, eitli metotlar mikroorganizma ve eldeki kaynaklara gre deimektedir. Ayrca endofitik funguslarn korunmasn hesaba katarak yaplan almalar yoktur.

2.4.3.3.

Fermentasyon koullar

Endofitik fungus, saf kltrden elde edildikten sonra farkl ortam ve koullarda reme yetenei incelenmelidir. Devamnda en iyi ortam ve reme artlar belirlendikten sonra, organizma fermente edilir, retim ortam ekstre edilir ve ekstrede ilgili rnlerin elde edilmesi iin etili kromatografik prosedrler uygulanr. Fiilen btn yaygn ve gelimi izolasyon ve karakterizasyon prosedrleri, ilgilenilen bileiin elde edilmesine dayanmaktadr. Btn bu izolasyon ilemlerinin merkezinde bileiin saflatrma prosesine rehberlik edecek bir ya da daha fazla biyolojik aktivite taramas yer almaktadr. Herhangi bir doal rn izolasyon faaliyetinin nihai baars dorudan uygun biyoaktivite prosedrleri gelitirme veya seme ile ilgili olduundan bu nokta ok fazla neme sahiptir. Bu prosedrler, yeni bileiin ihtiya duyulduu amaca uygun hedef organizmalar, enzimler, dokular ya da model kimyasal yaplar ierebilir (Strobel and Daisy, 2003; Gallo et al., 2008). Scaklk, pH, ortamn ierii, kltrn reme periyodunun uzunluu ve havalandrma derecesi ounlukla zel funguslar tarafndan retilen rn miktarn ve eidini etkiler ve biyoaktif nemi olan rnlerin verim ve eitliliini arttrmak iin maniple edilebilir. Filamentz funguslarn kltre alnmasnda kullanlan eitli ortamlar vardr ve ama ve allacak tre gre seilebilir. rnein belirli bir sekonder metabolitin maksimum retimini destekleyen ortam bulmak iin Stinson et al.. (2003), patates dekstroz agar (PDA), msr unu agar (CMA), oatmeal agar (OMA) ve doal patates dekstroz agar (NPDA) ile yapt bir dizi testten sonra, Eucryphia cordifoliadan izole edilen Gliocadium sp.nin rettii uucu antimikrobiyal bileik karmlar iin en verimli ortamlarn PDA ve OMA olduunu gstermitir. Genellikle sv ortamlar fizyolojik almalar iin seilmektedir. Bununla beraber, bol miktarda trn taksonomik karakterlerini belirlemek amacyla yaplan hzl taramalar iin agar

32

ortamlarn daha uygun olduu ispatlanmtr. Okratoksin A retimini analiz etmek amacyla, zm endofitleri Aspergillus ochraceus ve siyah aspergilli, Czapek maya ekstrakt agar (CYA)da 25 0C de 7 gn boyunca kltre edilmitir. Buna karn arpa tohumlarndan izole edilen A. flavus ve A. parasiticus zde aflatoksin retimi iin Aflatoxin Production Ability (APA) Broth kullanlarak test edilirken A. ochraceus ve A. niger 5% (w/v) ar poleni ile desteklenmi Yeast Extract Sucrose (YES) Broth ortamnda kltre alnmtr. Ayn aratrmada mikotoksin retimini analiz etmek iin Alternaria trleri iin Malt Broth (MB) kullanlrken, Fusarium izolatlar msr ekirdekleri ya da eltik tohumlar zerinde kltr edilmitir. Konidya retimini stimle etmek iin yaplan giriimlerde Potato Sucrose Agar (PSA), taze glukoz-pepton agar, Lactrimel Medium ve CMA, hifal ve konidyal sspansiyon olarak steril suda saklanan trlerde test edilmitir. Biyolojik aktivitelerini ve kimyasal profillerini taramak iin Schulz et al.. (2002) yar sentetik biyomalt ve malt ekstakt soya ortamlarnda kltre alnan 6500 endofitik fungus izole etmitir. Bunun yan sra Fusarium izolatlarnn drt farkl sv ortamda remesini karlatrm ve fasulye apoplastik ykama svsnn (AWF) dier sentetik ortamlara gre daha iyi olduu sonucuna varmlardr. Benzer ekilde 500 endofitik tr, antimikrobiyal, sitotoksik, fitotoksik ve nematisidal aktivitelerine gre test edilmitir. Kltr koullarnn optimizasyonunu takiben, en yksek nematisidal aktivite, kartrmal ve havalandrmal YMG ortamnda elde edilmitir. CYA ve YES ortamlarnda farkl bitkilerden elde edilmi eitli Phoma trleri tarafndan retilen sekonder metabolitler, fungus sistematiinde kullanlmak zere TK ile tespit edilmitir. Devamnda molekler tanmlama amacyla DNA ekstraksiyonu iin izole edilen funguslar Sabourauds (SACglukoz-pepton-0.05 mg/ml kloramfenikol) ortamnda 30 0C de kltre alnmtr (Gallo et al., 2008; Schulz et al., 2002). ntra ve ekstraseller enzim ve sekonder metabolit taramalar iin endofitlerin kltr ounlukla, kat ortama gre daha homojen olduu iin nerilen, sv kltrlerde gerekletirilmektedir. Canl ieriin oksidatif biyokimyasal yolaklarn gerekletirmesini salamak ve erken otoliz olmadan verimli bir reme elde etmek iin tatmin edici bir havalandrmann salanmas nemlidir. Duraan kltr metotlarnda, kltrden kk bir hacim ieye alanr ve sonra ie eimli bir ekilde inkbe edilir. alkalamal kltrler gaz deiimine

33

olanak salamak iin sadece 1/5i kltr ortamyla dolu geni konik flasklarda ve orbital alkalayclarda alkalanr. Genellikle sv ortamlardaki retim kat ortamlardakine gre daha hzl olmaktadr, ancak morfolojik farkllklar sporulasyona eilim, miselya uzunluu vb. farklar olarak belirlenebilir (Gallo et al., 2008). Baar, ya ve a kltrn miktar filamentz funguslarn biyokimyasal aktivite ve zellikleri belirlemekte nemlidir. A kltrndeki destekleyici besinlerin test ortamna transfer edilmemesi gerekir. Bu transferden kanmamn bir yolu inokulumun besin ynnden zayf ortamlarda retilmi birka saklama rn ile birlikte kullanlmasdr. Bu, ilk olarak PDA zerinde 3-7 gn boyunca remi daha az besin ieren agar plakalarnn kesilmesi ile salanabilir. Bu agar plaklar ounlukla kat ortam a kltr olarak kullanlmasna ramen alkalamal kltrler iin de kullanlabilir. Bununla birlikte bu durumda zel inokulum oluturmak zere plaklarn kesilmesi daha iyi retim elde edilmesine yol amaktadr. Konidyal ya da hifal sspansiyonlar da ayn zamanda sv kltrleri iin inokulum olarak kullanlabilir. Her iki durumda da sspansiyon fermentasyon ncesi remeyi uyarmak iin ortama inokule edilir ve 12 rpm, 30
0

Cde 24-48 saat inkbe edilir. Sonra elde edilen miseller vakum filtrasyonu ile

toplanr, steril su ile alkalanr ve seilen koullardaki sv ortama aktarlr (Gallo et al., 2008).

2.4.4. Endofitik fungus-bitki etkileimleri

Baz endofitlerin belli fitokimyasallar retmesinin esasnda konak bitki karakteristii olduu ve evrimin bir aamasnda gereklemi olan endofit ile bitki arasndaki genetik kombinasyonlarn neden olduu dnlmektedir. Bu, Taxomyces andreanaenn takzol retme mekanizmasn aklamak iin nerilen bir grtr. Endofitler ve bitkileri arasndaki iliki ve biyoloji byk ilgi odadr ve youn bir inceleme altndadr. Dolaysyla bitki tr ve mikroorganizma biyolojisi ile ilgili daha fazla bilginin, yeni biyoaktif bileik bulma almalarnda yardmc olmas beklenmektedir. Endofitlerin doadaki rolleri ve deiik konak bitki trleri ile ilikilerinin ne olduu henz tam olarak bilinmemektedir. Baz

34

endofit funguslar ( Fusarium spp., Pestalotiopsis spp., Aspergillus spp. ve Xylaria spp. ) birden ok bitkide bulanabilmesine karn, endofitlerin dorudan bitki spesifik olduu ya da bitki iinde ans eseri sistemik olduu sylenemez. ounlukla bir tre ait pek ok endofit ayn bitkiden izole edilebilmektedir ve bir ya da birka biyotip kltre alndnda yksek aktivite gsteren bileikler retebilmektedir. Endofitlerin doada ve kltr ortamnda ne retebildikleri ynndeki belirsizlik de ayrca ilgi konusudur. Endofit tarafndan in situ olarak retilen biyoaktif bileikler endofitin bitki dokularndaki hkimiyetini kolaylatrd veya bitkiyi zararl saldrgan patojenlere, haerelere ve evresel strese kar koruduu muhtemel grnmektedir. Endofit ile konak bitki arasndaki ilikinin fizyolojisi ve biyokimyas hakknda ok az bilgi mevcuttur. Endofitlerin biyolojisini etkileyen, mevsim, ya, evre ve lokasyon gibi bitkide deiimlere yol aan ok sayda etken vardr. Esasnda molekler dzeydeki ileri almalar bitki ile endofit arasndaki iliki ve ekolojiye odaklanmaldr. Btn bu etkileimler muhtemelen doada bir ama iin kimyasal olarak ortaya kmtr. Bu organizmalarn doadaki rol ile ilgili ekolojik farkndalk, en yksek potansiyele sahip endofitik aktivitenin hedeflenmesine yardmc olacaktr (Strobel and Daisy, 2003; Kharwar and Strobel, 2011 ). Funguslar tamamen heterotrofik olmalar nedeniyle fotosentez yapmann olanakszl gibi evrensel bir karakteristik sunarlar. Ayn zamanda, funguslar besinlerini evrelerindeki canl, lmekte olan veya l organizmalardan salamak zorundadrlar. Birok farkl konak canlya o kadar dmanca saldrabilirler ki onlar ldrebilir ve sonra yaylan besinleri alabilirler. Ayrca baz funguslar konaklar ile karlkl mutualizmden parazitizme kadar simbiyotik ilikiler gelitirme yeteneine sahiptir. Bitki ve funguslar arasndaki simbiyoz iliki, doada sk rastlanan, eitlilii tevik etmenin bir sonucu olan, yaygn, eski ve evrimsel bir fenomendir ve onlar; kolonizasyon, rekabet, birlikte yaama ve toprak besi dinamikleri ile etkileyerek bitki topluluklarnn yaplanmasnda temel rol oynar. Hepsi deilse de allm bitkilerin ou herhangi bir d hastalk grn olmadan funguslar tarafndan istila edilmitir. Tanm olarak bu funguslara endofit denir ve artc bir eitlilikte bulunurlar. Endofit terimi grn itibariyle tartmaldr ve endofitlerin belli koullar altnda parazit olabileceini belirten eitli raporlar vardr. Birok bamsz evrimsel olgu

35

olduundan, mutualistik ve parazitik funguslar arasndaki fark kanlmaz bir ekilde bulanktr. Buna ramen endofit funguslarn bitki koruyucu mutualistler olduunu geleneksel bilgilere dayanarak belirten almalarn says da az deildir. Mutualizm iki ortaa da fayda salayan en nemlisi ekolojik ve evrimsel nemi olan bir iliki olarak bilinir. Bu balamda, fungus-bitki arasndaki ayarlamalar, rnein, endofit ile konak arasndaki reme atmalar, endofiti barndrmann enerji maliyeti, endofitin ihtiya duyduu besin, sadece endofitin barnmas iin deil dier fungal patojenlere kar duyarllnn arttrlmas iin de konak immn sisteminin basklanmas ve bitki iinde fungal remenin konak tarafndan kontrol gibi ilikileri dengeli bir mekanizmaya oturtmak gerekmektedir. Bu nedenle, bu mutualistik iliki, birbirine fiziksel olarak ok yakn iliki iindeki partnerini dezavantajlarndan korumak iin byk enerji tketimi ile ince ve dengeli bir antagonism durumu oluturan hcreler arasnda gelimitir. Bu grne gre, hastalk simbiyoz durumunun dengelenmedii bitki-organizma ilikisinin istisnas olarak grlmektedir. u anda endofitik yaam biimlerinin geliimini etkileyen unsurlar, konak bitkiyle dorudan ya da dolayl olarak iliki kuran btn tr alar (mutlu tr etkileimleri), biyotik ya da abiyotik evre koullar tarafndan ynlendirilir, genetik faktrlerden etkilenir ve mutual kullanm zelliklerine sahiptir. Endofitler bitkiden besin salamak, barnmak ve bir sonraki konak jenerasyonuna gei eklinde yararlanrken, konak bitki, dier enfekte olmayan bitkilere gre, daha gl, kurakla dayankl ve nematod, otullar ve patojenlere kar toksik olmaktadr. Bu durum Neotyphodium endofitleri ve belli im trleri arasnda bitkiyi otullara kar koruyan, saysz alkaloidlerin senteziyle sonulanan simbiyotik ilikide grlebilmektedir. Bazen bu kazan yar parazitik bitkiler gibi simbiyozun 3. bileenine de geniletilebilir. Bu durumda endofit ayn zamanda bir dzeltme performans olarak yar parazitik bitkinin de direncini arttrr, ancak bu performans konak imlerin bymesini drr. Yar parazitik bitki olduu durumlarda endofit fungus mutualistik olmaktan ok parazitik olmaktadr. Ayrca mutualistik birliktelikler kimyasal dengedeki modifikasyonlara yol aabilir. Bu durum yabani im Brachiaria plantaginea trlerinde grlmektedir. Bu bitki, dier rekabeti imlerin tohumlarnda Fusarium solani endofitik fungusunun remesini uyaran akonitik

36

asiti retmektedir. Ayn zamanda bu fungusun uyarlmas rekabetilerin imlenmesi zerinde de olumsuz etkiler gstermektedir. Endofitik yaam biiminden parazitik yaama geiin molekler ve biyokimyasal temelini, farkl konak kolonizasyonunun elien yaam biimlerinde funguslar benimsemesini de aklayan, besin deiimindeki dengesizlik belirler. Bu konuda, su kaba bitkilerine antraknozu tetikleyen fungal patojen Colletotrichum manga, su kaba olmayan tr yelpazesinde semptom gstermeden endofitik yaam biimi sergilemektedir. Uzun tutulan bu etkileimlerin bir sonucu olarak, baz endofitik organizmalarn, kendileri ve konak bitki arasnda bilgi transferi salayan genetik sistemler bulduunu dndrmektedir. Sonu olarak bu mikroorganizmalar, konaa zg rnleri retmek iin renebildikleri kadar biyokimyasal yolaklar renebilir veya tam tersi normalde barndklar bitki dndaki uygulamalar edinebilirler. Aslnda bitki ve endofitlerinden doal rn eldesi almalar bu hipotezin muhtemel olduunu gstermitir. Hayvanlar iin zararl (locoweed) toksik Astragalus mollissimus, Oxytropis lambertii ve O. Sericeadan izole edilen endofitik funguslarn, ayn zamanda konaklar tarafndan da retilen svainsonin retebildii belirlenmitir. Bu bileik Locoism denilen ruminant hayvanlarda grlen hastala neden olmaktadr. Gl bir antimikobakteriyel ajan olarak bilinen 3-nitropropiyonik asit, endofitler ve eitli bitki trlerinden izole edilmitir. lgin bir ekilde baz yararl bitki kaynakl antikanser ilalar da endofitlerden elde edilmitir. Yumurtalk ve meme kanserinde kullanlan en nemli antikanser ilalarndan biri olan paklitakzel (Taxol) , pasifik porsuk aac Taxus brevifolia dan izole edilen endofitik fungus Taxomyces andreanaedan elde edilmitir. Catharanthus roseusun yapraklarndan izole edilen endofitik fungusun gl antilsemi ajan vinkristin sentezledii bildirilmitir. Nothapodytes foetida (Icacinaceae) endofiti Entrophospora infrequens in akcier, yumurtalk ve rahim kanserine kar etkili ve ilk olarak Camptotheca acuminate (Nyssaceae)den izole edilen kemoteraptik ajan kamptotesin retebilmektedir. Yararl antikanser ajan doal rn nc maddesi (prekrsr) podofilotoksin Podophyllum hexandrumdan elde edilen yeni endofit Trametes hirsute tarafndan sentezlendii bulunmutur. ekil 2-5te hem bitki hem de endofiti tarafndan retilen bileikleri gsterilmektedir. Bu rnekler

37

temel alndnda, bitki-mikroorganizma ilikileri hakkndaki bilgiler, farmastik ya da tarm endstrisi amal yeni biyoaktif doal rn aratrmalarn ynlendirebilir (Gallo et al., 2008).

ekil 2-5 Konak bitki ve endofiti tarafndan retilen biyoaktif bileikler

2.4.5. Endofitik funguslardan elde edilen sekonder metabolitler

Endofitler; alkaloidler, peptidler, steroidler, terpenoidler, izokumarinler, kinonlar, fenilpropanoidler lignanlar, fenoller ve fenolik asitler, alifatik bileikler, laktonlar ve dier byk kimyasal eitlilie sahip rnler retme yeteneine sahiptirler. Bu bileikler arasnda eitli rnler biyolojik aktivite gstermektedir (Gallo et al., 2008). Her endofitin fermentasyon svsna ait ekstreler ncelikle kat disk difzyon, agar dilsyon, disk difzyon ve miselyal radyal byme gibi yaygn olarak kullanlan metotlarla test edilmektedir. Aratrmaclar, belli bir bileiin izole edilmedii, ok sayda antimikrobiyal aktivite gsteren endofitlerin izole

38

edildiini rapor etmitir. Geleneksel tbbi bitki Paris polyphylla var. yunnanensisin rizomlarndan izole edilmi 62 endofitten 5i, 4 gram-negatif bakteriye (Escherichia coli, Xanthomonas vesicatoria, Agrobacterium tumefaciens ve Pseudomonas lachrymans) kar ve 2 gram-pozitif bakteriye (Bacillus subtilis, Staphylococcus haemolyticus) gl antimikrobiyal aktivite gstermitir. Tbbi bitkilerden (Cyrtomium, Ophiopogon) herhangi belli bir bileiin izole edilmedii 353 endofit fungus elde edilmitir. Bunlardan Alternaria solani ve Botrytis cinereann remesini inhibe edici zellik gsterenlerin oran srasyla %15.9 ve %11.3tr. Phongpaichit et al.. (2006) Garcinia bitkisinden izole ettii endofitik fungustan fermentasyon svs elde etmi ve disk difzyon yntemiyle S. aureus, C. albicans ve C. neoformansa kar test etmitir. Sonulara gre toplam 377 trn 70 (%18.6)i en az bir patojenik mikroorganizmaya kar aktivite gstermitir (Phongpaichit et al., 2006). Endofit aratrmalarnn ou daha tarama aamasndadr ve aktif ieriklerinin izole edilmesi gerekmektedir (ekil 2-6). Test bakterilerine kar biyoaktivite tad kantlanan belli endofitlerin ekstrelerinden aktif bileiklerin izole edilmesi bir sonraki aama olmaldr. nce Tabaka Kromtaografisi (TK) ya da biyo-otografi aktif ierikleri takip etmek iin kullanlabilir. Ham ekstre TK tabakas zerine aktarlmal ve uygun bir solvent ile ayrlmaldr. Test organizmalar (bakteriyal ya da fungal sporlar) komponentleri ayrlm TK tabakas zerine inokle edilir ve nemli bir ortamda birka gnlk mikrobiyal kltivasyon yaplr. Antimikrobiyal maddeler TK tabakas zerindeki inhibisyon blgelerine gre gzlenebilir. En sonunda aktif maddeler yaygn kromtografik metodlarlar (ktrme, ince tabaka kromtaografisi, sv hazrlama kromatografisi, kolon kromtagorafisi vb.) izole edilebilir (Yu et al., 2010).

39

ekil 2-6 Endofitlerden biyoaktif doal rnlerin izolasyonu ak emas

Mays 2006ya kadar endofitik mikroorganizmalarn tad kimyasal eitlilii dair geni bir derleme rapor edilmi ve ayn zamanda endofitlerin biyoaktif doal rn eldesi iin ekici bir kaynak olduuna gsteren biyolojik aktiviteler de yaynlanmtr. Mays 2006 sonras rapor edilen ve endofitlerin rettii nemli sayda kk molekller endofit kimyasna olan ilgilinin artmaya devam ettiini gstermektedir. Son birka ylda endofitlerden, aralarnda alkaloidler, peptidler, steroidler, terpenoidler, kinonlar, flavonoidler, alifatik bileikler ve fenollerin olduu ok sayda biyoaktif doal bileik izole edilmitir. eitli endofitlerin antimikrobiyal aktivite rnekleri izelge 2-3de gsterilmitir. izelge 2-3den de anlald gibi, Pestalotiopsis sp., Streptomyces sp. ve Phomopsis sp. bitki konaklarndan en ok izole edilen antimikrobiyal aktivite tayan trler ve test edilen organizmalar ounlukla nceki almalarda kullanlan C. albicans, S. aureus, E. coli, Aspergillus sp., Fusarium sp.ve Pyricularia oryzae gibi trlerdir (Yu et al., 2010).

40

ekil 2-7 Endofitlerden elde edilen nemli biyoaktif bileikler

izelge 2-3 Baz organizmalara kar endofitiklerin aktiviteleri Antimikrobiyal Bileik Tr Konak Bitki
Excoecaria agallocha Ginkgo biloba Alifatik Bileikler Quercus variabilis

Kaynak Endofit
Phomopsis sp. Chaetomium globosum Cladosporium sp

Test Organizmas
Candida albicans ve Fusarium oxysporum Mucor miehei Trichophyton rubrum, C. albicans, Aspergillus niger, Epidermophyton floccosum, Microsporum canis Mycobacterium tuberculosis Mucor miehei Aspergillus Fusarium verticillioides avus,

Garcinia dulcis Ginkgo biloba Msr

Phomopsis sp. Chaetomium globosum Acremonium zeae

Alkaloidler

Juniperus cedre Flavonoidler

Nodulisporium sp.

Bacillus megaterium, Microbotryum violaceum, Septoria tritici, Chlorella fusca Staphylococcus aureus, C. albicans sp., Mayalar Candida albicans Candida albicans

Acrostichum aureurm Pinus sylvestris, Fagus sylvatica Peptidler Tripterigium wiflordii eitli yamur ormanlar Tropikal aa ve asma

Penicillium sp. Cryptosporiopsis Pezicula sp. Cryptosporiopsis quercina Muscodor albus

41

izelge 2-3 Baz organizmalara kar endofitiklerin aktiviteleri (devam) Antimikrobiyal Bileik Tr Konak Bitki
Cerbera manghas Saurauia scaberrinae Fenoller Tanmlanmam

Kaynak Endofit
Penicillium sp. Phoma species Pestalotiopsis adusta

Test Organizmas
Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus Fusarium culmorum, Gibberella zeae, Verticillium aiboatrum Phythophtora capsici, Phythophtora parasitica, Fusarium oxysporum, Alternaria solani Fusarium culmorum, Gibberella zeae, and Verticillium aiboatrum S.aureus, Staphylococcus epidermidis ve Enterococcus faecalis Phytophthora capisici, Rhizoctonia cerealis, Gaeumannomyces graminis var. tritici, Helminthosporium sativum. Bacillus megaterium, Microbotryum violaceum, Septoria tritici, Chlorella fusca

Callicarpa acuminata

Edenia gomezpompae

Kinonlar

Tanmlanmam

Pestalotiopsis adusta

Urospermum picroides

Ampelomyces sp.

Artemisia annua

Colletotrichum sp.

Steroidler Juniperus cedre Nodulisporium sp.

Cassia spectabilis

Phomopis cassiae

Cladosporium sphaerospermum Cladosporium cladosporioides Staphylococcus aureus Enterococcus faecalis S.aureus Enterococcus faecalis B. subtilis, S. aureus, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhimurium

Daphnopsis americana Terpenoidler Daphnopsis Americana Taxus cuspidate

Belirtilmemi Belirtilmemi Periconia sp.

42

2.4.5.1.

Endofitik funguslardan elde edilen antibiyotikler

Antibiyotikler,

mikroorganizmalar

tarafndan

retilen

ve

dier

mikroorganizmalara kar dk konsantrasyonlarda etkili olan dk molekl arlkl doal organik rnler olarak tanmlanmaktadr. Bu antibiyotiklerin genellikle kayna endofitlerdir. Endofit organizmalardan elde edilen doal rnlerin, fitopatojenler, bakteriler, funguslar, virsler ve protozoanlar gibi insan ve hayvanlar etkileyen geni bir aralktaki hastalk yapc ajanlara kar inhibe edici ya da ldrc etkileri olduu gzlenmitir. Cryptosporiopsis cf. quercina Avrupada aalarda yaygn olarak bulunan Pezicula cinnamomeann dzensiz formudur. Avrasyaya zg tbbi bitki Tripterigeum wilfordiiden izole edilmitir. C. quercinann petrilerde C. albicans ve Trichophyton spp. gibi insanlar iin nemli fungal patojenlere kar mkemmel aktivite gsterdii bulunmutur. Ekinokandin ve pnmokandinlerle ilikili benzersiz bir peptid antimikotik ajan olan kriptokandin, C. quercinadan izole edilmitir. Bu bileik saysz kendine zg hidroksillenmi amino asit ve yeni bir amino asit olan 3-hidroksi-4-hidroksimetil prolin iermektedir. Genellikle endofitin, bir deil birka ilgili biyoaktif bileik rettii kabul edilmektedir. Dolaysyla C. quercinann kriptokandin ile ilikili dier antifungal ajanlar da rettii sylenebilir. Kriptokandin ayn zamanda bitki patojeni olarak bilinen S. sclerotiorum ve Botrytis cinerea gibi saysz patojene kar aktivite gstermektedir. Kriptokandin ve ilgili bileiklerinin trnak ve deri hastalklarna neden olan funguslara kar kullanm ilgi grmeye balamtr. Benzersiz bir tetramik asit olan kriptosin de yine C. quercina tarafndan retilmektedir. Bu allmam bileik, dier birok patojenik fungus gibi dnyann en kt bitki hastal olarak grlen eltik patlamas (rice blast) hastalna neden olan Pyricularia oryzaeye kar gl bir aktivite gstermektedir. Bu bileik genellikle bir dizi insan ve bitki patojenine kar etkili deildir. P.oryzaeye kar minimum inhibisyon konsantrasyonu 0.39 g/mL olmasna karn, bu bileik rice blast hastalna kar doal kimyasal ajan olarak test edilmekte ve dier antifungal ajanlarn sentezi iin model olarak kullanlmaktadr.

43

Ekomisinler, bitkiyle birlikte yaayan floresan bir bakteri grubunun yesi Pseudomonas viridiflava tarafndan retilir. Genellikle birok im trlerinin yapraklarnn stnde ve iinde barnrlar. Ekomisinler, molekl arl 1.153 ve 1.181 Da olan yeni bir lipopeptid grubu sunmaktadr. Alanin, serin, treonin ve glisin gibi yaygn aminoasitlerin dnda homoserin ve -hidroksiaspratik asit gibi allmam amino asitler de ekomisinlerin yapsnda bulunmaktadr. Ekomisinler, C. neoformans ve C.albicans gibi insan patojeni funguslara kar aktiftirler. Dier bir bitki ile ortak yaayan Pseudomonaddan elde edilen antifungal bileikler psdomisinlerdir. Psdomisinler, bitki ve insan patojeni olarak geni bir aralktaki funguslara kar aktif bir lipopeptid grubudur. Bu nemli hedef organizmalarn bazlar C. albicans ve C. neoformans, Ceratocystis ulmi (Hollanda karaaa hastal) ve Mycosphaerella jiensis (muzda Black Sigatoka hastal) gibi trleri ieren geni aralktaki bitki patojenleridir. Psdomisinler Lklorotreonin, L-hidroksiaspartik asit ve hem D- hem de L-diaminobutirik asit gibi geleneksel olmayan aminoasitler iermektedir. Bu molekller memelilere kar toksisitesi, yapsal modifikasyonlarla giderlilikten sonra tbbi amala kullanlacak adaylar arasndadr. Psdomisinlerin saysz Ascomycetes tr fungusa kar etkili olmas nedeniyle tarmda da kullanlmas dnlmektedir. Pestelotiopsis microspora yaygn bir yamur orman endofitidir. Bu organizmann muazzam bir biyokimyasal eitlilie sahip olduu ve ok geni dalm gsteren bu organizmann birok trnn ok sayda sekonder metabolit rettii grlmtr. Bu sekonder metabolitlerden biri olan antifungal ajan ambuik asit, dnyann birok yamur ormanndaki izolatlarn temsilcisi konumundaki P. microsporann yakn zamanda tanmlanan birka izolatndan elde edilmitir (ekil 2-8). Tehlike altndaki Torreya taxifolia aacndan izole edilen bir P.microspora suu, antifungal aktivite gsteren, aromatik -glukozit pestalozit, iki piron; pestalopiron ve hidroksipestalopiron gibi birka bileik retmektedir. Bu bileikler ayn zamanda fitotoksik zellikler de tamaktadr. Karyofilen sesquiterpenleri pestalotiopsin A ve B, 2-hidroksidrimeninol ve son derece fonksiyonel humulan gibi dier yeni izole edilmi sekonder rnler Taxus brevifolia endofiti olan P. microsporadan elde edilmitir. Bu fungustaki

44

bileiklerin miktar ve tiplerindeki farkllk fungusun izole edildii organizma ve kltr koullarna bal olarak deimektedir. Pestalotiopsis jesteri Papua Yeni Gine Sepik nehri blgesinden izole edilen yeni bir fungal trdr ve farkl bitki patojenlerine kar antifungal aktivite gsteren son derece fonksiyonel siklohekzanon epoksitler, jesteron ve hidroksijesteron bileiklerini retmektedir. Jesteron sonradan biyolojik aktivitesi tamamen korunarak sentezlenmitir (Bkz. ekil 2-8). Jesteron endofitlerden izole edilip total sentezi gerekletirilen birka rnden biridir. Phomopsis trlerinden elde edilen bir metabolit olan fomopsikalasin, sitokalasin makrolid halkann yerine l halka bulunduran ilk sitokalasin tipi bileiktir. Bu metabolit disk difzyon testlerinde (4 g/disk) B. subtilis (12-mm inhibisyon ap), S. gallinarum (11-mm inhibisyon ap) ve S. aureusa (8-mm inhibisyon ap) kar antibakteriyel aktivite gstermitir. Ayrca C. tropicalis (8mm inhibisyon ap) mayasna kar da ortalama bir aktivite gstermitir. Kosta Rikann Guanacaste doal alanlarndan toplanan Selaginella pallescensden izole edilen endofitik Fusarium trleri antifungal aktivite ynnden taranmtr. Yeni bir pentaketid antifungal ajan olan CR377 bu fungusun kltr svsndan izole edilmi ve agar difzyon testlerinde C. albicansa kar gl aktivite gsterdii saptanmtr. Artemisia mongolicadan izole edilen Colletotrichum gloeosporioidesin rettii bir metabolit olan kolletrik asit bakterilere kar antibakteriyel aktivite gsterdii gibi, Helminthsporium sativuma kar da antifungal aktivite gstermitir. Corafik olarak birok blgede adapte olabilen ve antimalaryal ila artemisinin sentezlemesi ile tannan geleneksel in bitkisi Artemisia annuadan izole edilen dier bir Colletotrichum trnden antimikrobiyal rnler elde edilmitir. Bu fungusun rettii metabolitler sadece insanlar iin patojen olan fungus ve bakterilere kar deil, bitki patojenlerine kar da fungistatik zellik gstermektedir. Antimalaryal bileikler reten A.annua endofitleri gibi baz endofitler ayn zamanda protozoal hastalklara kar da gl etki gstermektedir. K. nigriscans endofiti Streptomyces sp. NRRL 30652 suu geni spektrumlu antibiyotikler retmektedir. Munumbisin denilen bu antibiyotikler hedef organizmaya bal

45

olarak deien geni biyolojik aktiviteler gsterirler. Genellikle munumbisinler Bacillus antharcis ve oklu ila-direnli M. tuberculosis ve dier birok direnli gramnegatif bakterilere kar aktivite gsterir. Bununla birlikte munumbisinler iinde en ilgin aktivite munumbisin Dnin malaryal parazit Plasmodium falciparuma kar gsterdii (%50 inhibisyon konsantrasyonu 4.5 0.07 ng/ mL) biyolojik aktivitedir. Munumbisinler son derece fonksiyonel ve her biri treonin, aspratik asit (ya da asparajin) ve glutamik asit (glutamin) amino asitleri ieren peptidlerdir. Bu peptidler sar-turuncu renkte olduklarndan bir ya da daha fazla kromofor grup tamaktadrlar. Ktleleri 1,269 ile 1,326 Da arasnda deimektedir. Endofitik Streptomycete Streptomyces sp.nin izolazyonu, bitkilerin dnyann en byk antibiyotik kayna olan Actinomycetes grubu iin bir rezerv olduunun ilk kantdr. Bununla birlikte gemite antibiyotik retimi iin kullanlan btn trler topraktan izole edilmitir. uanda ise bunlardan 30 tanesi endofit olarak izole edilmitir ve ou da biyolojik aktivite gstermektedir. Bununla birlikte endofit Actinomycetes grubu, bitki hastalklarnn kontrol edilmesinde dnlmekte ve test edilmektedir. Avustralyann kuzey blgelerinde yaayan erelti yaprakl Grevillea (Grevillea pteridifolia) aacndan elde edilen dier bir endofitik Streptomycete (NRRL 30566), kltr ortamnda kakadumisin denilen yeni bir antibiyotik grubu retmektedir. Bu antibiyotiklerin her biri amino asit ierikleri olarak, alanin, serin ve bir bilinmeyen amino asit ierirler. Kakadumisin A, munumbisin D gibi geni spektrumlu, zellikle gram-pozitif bakteriler kar, ve genellikle ekinomisinden daha iyi biyoaktivite gsteren bir antibiyotiktir. rnein B. anthracise kar kakadumisin Ann MIC deeri 0.2-0.3 g/mL iken ekinomisinin MIC deeri1.0 1.2 g/mLdir. Hem kakadumisin A hem de ekinomisin, P.falciparum kar olduka etkilidirler ( 50% letal doz 7-10ng/mL). Kakadumisin A ve ekinomisin ierdikleri amino asitler ve kinoksalin halkalar bakmndan birbirine yakn bir kimyaya sahiptirler. Ancak spektral nitelik ve biyolojik aktivite ynnden bakldnda, elementel ieriklerine gre biraz farkllk gstermektedirler. Bu gelecek vaat eden antibiyotik zelliklere sahip baka bir endofitik actinomycetes rneidir (Strobel and Daisy, 2003).

46

ekil 2-8 Endofitlerden elde edilen baz antimikrobiyal bileikler

2.4.5.2.

Endofitik funguslardan elde edilen antiviral bileikler

Endofit fungus rnlerinin dier bir byleyici kullanm alan virslerin inhibisyonudur. ki yeni insan sitomegalovirus (hCMV) proteaz inhibitr, sitonik asit A ve B (ekil 2-9A), endofitik fungus Cytonaema sp.n kat kltrnden elde edilmitir. Ktle Spektrometresi (MS) ve Nkleer Manyetik Rezonans (NMR) kullanlarak, yaplar p-tridepside izomerleri olarak aydnlatlmtr. Endofitlerden antiviral aktivite gsteren bileiklerin bulunmas potansiyelinin henz balang aamasnda olduu aktr. Yine de imdiden bulunan baz bileikler umut vericidir. Gnmze kadar bileik keiflerindeki esas kstlama muhtemelen bileik tarama programlarnda yaygn bir antiviral tarama sisteminin olmaydr. Virlent bitki patojenlerine kar test edilen endofitlerden izole edilmi herhangi

47

bir antiviral bileik olmad iin eitli bitki patojen virslerine kar etkili olabilecek, potansiyel antiviral bileiklerin tanmlanmas iin youn bir aratrmaya ihtiya duyulmaktadr.

2.4.5.3.

Endofitik funguslardan elde edilen uucu antibiyotikler

Muscodor albus, Cinnamomum zeylanicumun kk paralarndan yeni izole edilmi endofitik bir fungustur. Bu spor retmeyen (xylariaceaous) fungus, rettii uucu bileik karmyla belli baz funguslar ve bakterileri etkin bir ekilde inhibe etmekte ya da ldrmektedir. Bu bileiklerin ounluu GC/MS ile tanmlanm, sentez ya da elde edilmi ve sonra fungusun rettii uucu bileiklerin antibiyotik etkilerini taklit edebilmesi iin yapay bir karm halinde hazrlanmtr. Fungus tarafndan retilen uucu bileiklerin 5 snf ayr ayr test edilen fungus ve bakterilere kar baz antimikrobiyal etkiler gstermesine ramen hibiri ldrc olmamtr. Ancak toplu halde sinerjik olarak geni bir aralktaki bitki ve insan patojeni fungus ve bakterilerin lmne neden olabilmektedirler. nhibitr grubu bileikler iinde en ok etki gsteren grup izoamil asetatn biyolojik olarak en aktif en olduu esterlerdir (Bkz. ekil 2-9B). Mikofumigasyonun toprak, tohum ve bitkiler iin potansiyel kullanmnn yakn zamanda gereklemesi beklenmektedir. Uucu bileiklerin yapay karm ayrca tohum, meyve ve bitki paralarnn saklama ve tanmas ilemleri srasnda da kullanlmas yararl olabilir. Ek olarak M. albus hali hazrda insan atklarnn ilenmesinde de kstl bir pazara sahiptir. M. albusun bir tarama arac olarak kullanlmas, uucu bileik reten baka endofit funguslarn izole edilmesini mmkn klmtr. Yeni tanmlanan M. roseus, Avustralyann kuzey blgesindeki aa trlerinden elde edilmitir. Bu organizma laboratuardaki test organizmalarnn inhibe edilmesi ve ldrlmesinde M. albus kadar etkilidir. Muscodor olmayan (non-muscodor) bileiklerinden trlerin farkllk (Gliocladium sp.) de uucu bileikler retebildii bulunmutur. Bu organizmann uucu bileenleri M. albus ve M. roseusun gstermektedir. Aslnda en verimli uucu inhibitr olan ve daha nce roket yakt olarak kullanlan [8]-annulen, ilk defa doal rn olarak buradan izole edilmitir.

48

Ancak Muscodor trleri ile karlatrldnda, Gliocladium sp. uucu bileiklerinin biyokaktivitesinin o kadar iyi olmad grlmtr.

2.4.5.4.

Endofitlerden elde edilen antioksidant ajanlar

Pestasin ve izopestasin, Papua Yeni Gine de Sepik nehri sistemlerinde yaayan iekli bitki (combretaceaous) Terminalia morobensisten izole edilen Pestalotiopsis microsporann kltr svsndan elde edilmi iki bileiktir. ki bileik de antimikrobiyal ve antioksidan aktivite gstermektedir. zopectinin antioksidan aktivitesi yapsal olarak flavonoidlere benzemesine dayandrlmaktadr (Bkz. ekil 2-9C). Elektron Spin Rezonans Spektroskopi lmleri, zeltide bu bileiin speroksit ve hidroksil serbest radikalleri temizlemesinin mmkn olduunu gstererek bu antioksidan aktiviteyi dorulamtr. Pestasin doal halde razemik karm halinde bulunur ve bir E vitamini trevi olan Troloxtan enaz bir kademe daha gl antioksidan aktivite gsterir. Pestasinin antioksidan aktivitesi ncelikle reaktif C-H balarn paralamas ve bir dereceye kadar O-H balarna doru ayrmasndan ileri gelmektedir.

ekil 2-9 Endofitlerden elde edilen baz antiviral (A), uucu antibiyotik (B) ve antioksidan ajanlar (C)

49

2.4.5.5.

Endofitik funguslardan elde edilen antikanser ajanlar

Paklitakzel ve baz trevleri endofitler tarafndan retilen antikanser ajanlarnn ilk grubudur. Son derece fonksiyonel diterpenoid paklitakzel, ilk olarak 1960larda son on yln en nemli ve en ilgin antikanser ajan olarak kefedilmitir (ekil 2-10A). Sitotoksik aktivitenin paklitakzelden kaynakland 1962 ylnda Washington eyaletinde Taxus brevifolia Nutt.a ait aa kabuu ve dallarn toplanp ekstre edilmesi ve biyoaktivite iin analiz edilmesi sonucunda kefedilmitir. Taxus brevifoliadan elde edilen ekstrenin baz lsemiler, karsinosarkomaya kar aktivite gsterdii bulunmutur. Paklitakzel bu ekstreden (ve dier Taxus trleri T. cuspidata ve T. baccata ekstrelerinden) 1967 ylnda izole edilmitir. Paklitakzelin preklinik formlsayon ve toksikoloji almalar 1982de tamamlanm ve 1984de Faz 1, 1985de de Faz II almalarna balanmtr. Molekle FDA 1992 ylnda yumurtalk kanserine, 1994de de meme kanserine kar klinik kullanm iin onay vermitir. Paklitakzel, hcre blnmesi srasnda tblin molekllerinin depolimerize olmasn nleyerek aktivite gstermektedir. Bu bileik dnyann ilk milyar dolarlk ilacdr. Dier birok insan doku proliferasyon hastalklarnda da kullanlmaktadr. Taxus trlerinde paklitakzel varl, bu trn endofitlerini almay tevik etmitir. Bununla birlikte 1990larn bana kadar dnyadaki hibir porsuk aacndan endofit izolasyonu yaplmamtr. Birka yllk almadan sonra yeni bir paklitakzel reten fungus Taxomyces andreanae, T. brevifoliada kefedilmitir. Bu fungusun kltr svsnda paklitakzel varlna iaret eden en nemli kant, T. Andreanaedan izole edildii varsaylan paklitakzelin Elektrospray Ktle (ESIMS) spektrumlardr. ESI-MS ile paklitakzel genelde biri 854 (M+H+) dieri 876 (M+Na+) olan iki pik verir ve fungal paklitakzelin klte spektrumu da otantik paklitakzelin spektrumu ile ayndr. Daha sonra 14C iaretleme almalar kltr ortamlarnda inkar edilemez bir biimde fungal trevli paklitakzelin varln gstermitir. Bu nc alma dier Taxus trleri ve dier bitkilerin paklitakzel reten endofit salama yeteneklerinin daha detayl incelenmesine yol amtr (Strobel and Daisy, 2003; Sreekanth, 2008).

50

ekil 2-10 Antitmor doal biyoaktif bileikler paklitakzel (A) ve toreyanik asit (B)

Dnyadaki porsuk trlerinde ska rastlanan endofitlerden bazlar Pestalotiopsis spp.dir. En ok izole edilen endofitik tr P. microsporadr. Taxus wallichianadan elde edilen P. microsporann monoklonal antikor testleri ile yaplan ilk denemelerde paklitakzel retebilecei gsterilmitir. Preparatif TK ile bileik izole edilmi ve paklitakzel olduu spektroskopik
14

tekniklerle

belirlenmitir. Bu organizma kendisine uygulanan birka

C iaretli nc

maddelerden iaretli paklitakzel retmitir. Dahas gney Carolinada birka servi trnden elde edilen dier P. microspora izolatlarnn da paklitakzel rettii saptanmtr. Bu, Taxus spp. dndaki bitkilerden izole edilen endofitlerin de paklitakzel retebileceini gsteren ilk rnektir. Dolaysyla yerli Taxus trleri ile bilinmeyen ktalarda paklitakzel reten endofitler iin zel bir aratrma balatlmtr. Bu aratrma paklitakzel reten endofitlerin Gney Amerika ve Avustralyada var olabilecei bak asnn test edilmesini de kapsamaktadr. Son derece nadir bulunan ve daha nce soyu tkendii dnlen Wollemi am (Wollemia nobilis)ten Pestalotiopsis guepini izole edilmi ve paklitakzel rettii belirlenmitir. Yine srpriz bir ekilde rubiasz bitki Maguireothamnus speciosusdan elde edilen yeni bir fungus Seimatoantlerium tepuienseun da paklitakzel rettii bulunmutur. Bu endemik bitkiler gneybat Venezuellann Venzuelan-Guyana blgesini st ksmlarnda yetimektedirler. Bununla birlikte

51

fungal paklitakzelin dier endofitik fungus trleri olan Periconia sp. ve Seimatoantlerium nepalense trlerinde de olduu belirlenmitir. Basit bir ekilde grlyor ki bu paklitakzel reten endofitik funguslarn dalm dnya genelindedir ve sadece porsuk aac endofitleri ile snrl deildir. Paklitakzel reten endofitik funguslarn dnya apndaki dalmnn ekolojik ve fizyolojik aklamas, paklitakzelin bir fungisit olduu ve ona en duyarl organizmalarn da Pythium ve Pytophthora gibi bitki patojenleri olduudur. Pitiasz organizmalar dnyadaki en nemli bitki patojenlerinden bazlardr ve bitki zerindeki biyolojik oyuklarda endofit funguslarla gl bir rekabet iindedirler. Aslnda paklitakzele kar duyarllklar, hzl blnen insan kanser hcrelerine benzer ekilde tblin ile olan etkileimlerine dayanmaktadr. Dolaysyla iyi niyetli endofitler, konak bitkilerini bu patojenlere kar korumak iin paklitakzel retiyor olabilecei dnlmektedir. Zaman getike dier aratrmaclar da, gneybat inin Fujian eyaletinde yetien in porsuk aac (Taxus mairei)dan izole edilen ve paklitakzel reten Tubercularia sp. rneinde olduu gibi, paklitakzel reten endofitler zerine gzlemler yapmlardr. T.wallicianann Sporormia minima ve Trichothecium sp. trlerinin ieren en az 3 endofitinin paklitakzel rettii bilinmektedir. Yksek Performans kullanlarak Sv Kromatografisi avellana ve Elektrospray Gasaway Ktle Spektroskopisi da paklitakzel

Corylus

cv.

(fndk)da

bulunmutur. Fnda ait birka endofit tr kltr ortamnda paklitakzel retmektedir. Btn endofitler tarafndan kltrde retilen paklitakzelin miktar litrede mikrogram ya da altnda bir deerdedir. Ayn zamanda ounlukla kltr ortamnda endofitik fungus paklitakzel retimini drmektedir. Ancak kltr ortamna eklenebilecek aktivatr bileikler yardmyla paklitakzel retiminin geri kazanlmas muhtemeledir. almalar ticari dzeyde mikrobiyal paklitakzelin yaplabilirliinin belirlenmesi zerine younlamtr. Toreyanik asit, P.microspora suundan elde edilen seici sitotoksik aktif bir kinon dimeridir. Bu su yukarda da deinildii gibi esasen tehlike altndaki T. taxifolia (Florida torreya) ile birlikte yaamaktadr. Toreyanik asit (Bkz. ekil 210B) birka kanser hattna kar test edilmi ve protein kinaz C agonistlerine gre bu hatlara kar 5 ile 10 kat arasnda daha fazla etkili olduu ve apopitoz ile hcre lmne neden olduu saptanmtr. Yakn zamanda kademeli biyomimetik

52

oksidasyon-dimerizasyon gerekletirilmitir.

uygulamalar

ile

toreyanik

asitin

sentezi

Alkaloidler de endofitlerde sklkla bulunan bileiklerdir. Xylaria, Phoma, Hypoxylon ve Chalara gibi fungal cinsler, 20nin stnde tr tanmlanan ve sitokalasin olarak bilinen greceli geni bir grup bileikleri retmektedirler (ekil 2-11). Bu grup bileiklerin ou anti tmr ve antibiyotik aktivite gstermelerine ramen, hcresel toksisiteleri nedeniyle farmastik endstrisinde fazla geliim gsterememitir. Yakn zamanda Tripterygium wilfordii zerinde yaayan Rhinocladiella sp.den elde edilen 3 yeni Sitokalasin rapor edilmitir. 22-okza[12]-sitokalasinler olarak tanmlanan bu bileiklerin antitmr aktivite tadklar bulunmutur. Dolaysyla, endofitlerde bir ya da daha fazla sitokalasin bulmak sra d deildir ve bu alanda alanlar bu bollua kar dikkatli olmaldrlar. Kimyasal bolluk (dereplikasyon) genellikle daha nce biyolojik olarak aktif temel bileenlerinin kimyasal tanmlamas belirlenmi belli organizma gruplarnda olmaktadr. rnein sitokalasinler iin bu durum Xylaria tr funguslarda yaygn olarak grlmektedir.

53

ekil 2-11 Antitmor aktivite gsteren baz sitokalasin bileikleri

2.4.5.6.

Endofitlerden elde edilen insektisidal bileikler

Biyoinsektisitler insektisitlerin yalnzca kk bir blmn oluturmasna ramen pazar paylar artmaktadr. Anti-insekt olarak bilinen birka endofit tr vardr. Yeni bir indol diterpeni olan nodulosporik asit (ekil 2-12A) , bcek glutamat geili (glutamate-gated) klorit kanallarn aktive ederek, kurt sinei larvalarna kar gl bir insektisidal zellik gstermektedir. lk nodulosporik asit bileikleri, Bontia daphnoides bitkisinden izole edilen endofit Nodulisporum sp.den elde edilmitir. Bu keif daha fazla Nodulisporium spp. Ya da daha gl nodulosporik asit analoglarn reten dier trler iin youn almalarla sonulanmtr. nsekt toksinler keklik zm (Wintergreen, Gaultheria procumbens) bitkisinden izole edilen tanmlanmam funguslarda grlmtr. ki

54

yeni bileik 5-hidroksi-2-(1-hidroksi-5-metil-4-hekzenil)benzofuran ve 5hidroksi-2-(1-okso-5-metil-4-hekzenil) benzofuran, ladin aa kurtlarna kar, ikincisi ayn zamanda aa kurdu larvalarna kar toksik aktivite gstermektedir. Tropikal sarmak (Paullina paullinioides)dan izole edilen dier bir endofit Muscodor vitigenus majr bileik olarak naftalenleri retmektedir. Aktif ierii kafur (Mothball) olan naftalenler geni bir ekilde insekt kovucu olarak kullanlmaktadr. M.vitigenus insekt engelleyici olarak umut verici sonular gstermi ve buday sap testere sineine (Cephus cinctus) kar gl bir insekt kovucu etki sergilemitir. Dnyann sentetik insetktisidlerin ekolojik zararlar bakmndan daha dikkatli davranmaya balamasyla, gl, seici ve gvenli alternatiflerin bulunmas iin endofitik aratrmalar srmektedir.

2.4.5.7.

Endofitlerden elde edilen antidiyabetik ajanlar

Peptidal olmayan fungal metabolit L-783,281, Kinshasa

(Demokratik

Kongo Cumhuriyeti) yaknlarndaki Afrikan yamur ormanlarndan toplanan endofitik fungustan elde edilmitir (Bkz. ekil 2-12B). Bu bileik insulin taklidi gibi i grmekte ve insulin gibi sindirim sistemine paralanmadan oral olarak alnabilmektedir. L-783,281in diabet modeli iki fare zerindeki oral uygulamalarnda, kan glukoz seviyesini nemli derecede drd gzlenmitir. Bu sonular diyabet iin yeni tedavilerin nn aabilme potansiyeline sahiptir.

2.4.5.8.

Endofitlerden elde edilen immnspresif bileikler

mmnosupresif ilalar, organ nakli yapan hastalarda homogreft kabul etmeme durumlarn nlemek iin kullanlmakta ve gelecekte romatoid artrit ve insulin bal diyabet gibi otoimmn hastalklarn tedavisinde kullanlacaktr. Tripterygium wilfordiiden izole edilen endofitik fungus Fusarium subglutinans immnospresif ancak sitotoksik olmayan diterpen pironlar Subglutinol A ve Byi retmektedir (Bkz. ekil 2-12C). Subglutinol A ve B, Kark Lenfosit Reaksiyon (MLR) ve Timosit Proliferasyon (TP) testlerinde 0.1 m IC50 deeri ile e

55

gtedirler. nl immnosupresan bir ila olan ayn zamanda fungal kaynakl siklosporin A, MLR testlerinde kabaca gl iken TP testlerinde 104 kat daha gl bulunmutur. Subglutinol A ve Bnin toksik etkilerinin olmamas nedeniyle bunlarn potansiyel immnosupresanlar olarak daha detayl aratrlmas nerilmektedir. Sandoz LTD.nin Mikrobiyoloji Blm, funguslar biyoaktivite ynnden taramak ve deerlendirmek iin bilgisayar destekli bir program gelitirmitir. Bu program almalardan yaygn bilinen bileikler reten funguslar tanmakta ve elimine ederken bylece dikkatleri dorudan yeni biyoaktivitelere sahip muhtemel metabolitlere retebilecek nadir trler zerine ynlendirmektedir. Bu yaklam son derece yararl bir immnosupresan olan siklosporinin Tolypocladium inatumdan elde edilmesini salamtr. Bu rnek birok aratrmacnn ilgin ve olaand konak ve evrelerden nadir endofitleri bulma amalarn ok gzel betimlemektedir.

ekil 2-12 Endofitlerden elde edilen antiinsektisidial (A), antidiyabetik (B) ve immnspresif (C) bileikler

56

izelge 2-4 Endofit funguslardan elde edilen doal biyoaktif bileikler

Konak Bitki Artemisia annua L. (in) Artemisia mongolica Fisch. ex Bess. Bontia daphnoides L. Endofit Topland Yer Metabolit Metabolit Snf Biyoaktivite Testi nsan Patojeni Fungus ve bakterilere kar antimikrobiyal, bitki patojenlerine kar fungisitatik aktivite Antibakteriyal ve Antifungal (Helminthosporium sativum) Anti-insektisidal Antimikrobiyal (Rhizoctonia solani, Ustilago hordei F. Solani (basidiomycetes) Cercospora beticola, Candida spp. A. fumigatus (insan fungal patojenleri) Pythium ultimum ve Phytophthora cinnamomi (Oomycetes) Antibakterial (E. coli, S.aureus, Micrococcus luteus ve B. subtilis) Erythophelum chlorostachys Grevillea pteridifolia Knight Maguireothamnus speciosus Seimatoantlerium tepuiense Muscodor roseus Belirtilmemi Avustralya Blgesi Kuzey Uucu Antibiyotikler Uucu Antibiyotikler Belirtilmemi Belirtilmemi Antibakteriyel ve Antifungal 6-izoprenyl indol-3-karbokisilik asit, 3, 5 dihidroksi-6asetoksi-ergosta-7,22-dien ve Belirtilmemi 3, 5 dihidroksi-6-fenil asetiloksi-ergosta-7, 22-dien Tridepsid ndol diterpeni

Colletotrichum spp.

Nanjing, in

Colletotrichum gloeosporioides Nodulisporium spp

Zijin Dalar, Koletotrik asit Nanjing, in Belirtilmemi Nodulosporik asits

Cinnamomum zeylanicum (Tarn)

Nees Muscodor albus

Lancetilla Botanik Uucu Antibiyotikler Bahesi, La Ceibe, (1-btanol, 3-metil asetat) Honduras.

Ester

Muscodor roseus

Antibakteriyel ve Antifungal

Gneybat Venezuela-Guyana Taxol snr yksek ksmlar Belirtilmemi Naftalen

Diterpenoid

Belirtilmemi

Paullina paullinioides (Tropik Sarmak)

Muscodor vitigenus

Belirtilmemi

Yaprak arlarna kar bcek kovucu

57

Konak Bitki Quercus suber (Mantar meesi) L.

Endofit Diplodia mutila

Topland Yer Belirtilmemi Guanacaste Korunmu Kosta Rika Belirtilmemi

Metabolit Diplopiron

Metabolit Snf

Biyoaktivite Testi

Tetrahidropiranpir Fitotoksik an-2-on Pentaketid Antifungal, C. albicans Anti-oomycetes ve antikanser (melanoma G361, HT-144, Lsemi hcre hatlar HSB2,K-562) mmnspresif, Sitotoksik Antikarsinojenik (P-388, P-1534,-1210 murine lsemi, Walker 256 karsinoma, sarcoma 180 Antikanser (P388 hcreleri, KB cells) Antikanser

Selaginella pallescen (ereltiotu) Taxus baccata L.

Fusarium spp.

Blgesi CR377

Acremonium spp.

Lsinostatin A

Belirtilmemi Karyofilen seskiterpen,

Taxus brevifolia Nutt. (Pasifik Porsuk aac) Taxus brevifolia Nutt. (Pasifik Porsuk aac)

Pestalotiopsis microspora Taxomyces andreanae

Bozenan, Montana, ABD

Pestalotiopsin A ve B

Belirtilmemi Fujian, in Himalaya da etekleri Singhe-To, Khatmandu, Nepal

Taxol Taxol Taxol Altersolanol A, 2- hidroksi- 6metil benzoik asit

Diterpenoid

Taxus mairie (in Tubercularia spp. gney Porsuk aac) Taxus wallachiana (Nepa Porsuk aac) Taxus wallachiana (Himalaya aac) Porsuk Phoma spp. Sporormia minima, Pestalotiopsis microspora

Diterpenoid Diterpenoid

Belirtilmemi

Antibakteriyel

Taxus wallachiana (Himalaya aac)

Trichothecium spp. Shivapuri, Porsuk ve tanmlanmayan Khatmandu, Nepal dimorfik fungus

Paklitakzel

Diterpenoid

Belirtilmemi

izelge 2-4 Endofit funguslardan elde edilen doal biyoaktif bileikler (devam)

58

Konak Bitki

Endofit

Topland Yer

Metabolit

Metabolit Snf

Biyoaktivite Testi

Terminalia morobensis Coode

Pestalotiopsis microspora

Sepik nehri drenaj sistemi,Papua Yeni zopestasin Gine

zobenzofuranon

Antioksidant, ultimum)

antifungal

(Pythium

Terminalia morobensis Coode

Pestalotiopsis microspora

Sepik nehri drenaj sistemi,Papua Yeni Pestasin Gine Belirtilmemi

1,3,dihidro izobenzofuran

Antioksidant, ultimum)

antifungal

(Pythium

Antikanser ve antibiyotik Torreya taxifolia Arn Pestalotiopsis microspora Toreyanik asit Kinon dimmer

Tripterygium wilfordii Hook.f.

Cryptosporiopsis quercina

Belirtilmemi

Kriptosin

Tetramik asit

Antimikotik (Pyricularia oryzae ve dier bitki patojeni funguslar) Antimikotik (Sclerotinia

Tripterygium wilfordii Hook.f

Cryptosporiopsis quercina

Belirtilmemi

Kriptokandin

Lipopeptid

sclerotiorum, Botrytis cineria) insan patojenleri (Candida albicans, Trichophyton spp.)

Tripterygium wilfordii Hook.f. Wollemia nobilis (Wollemi am)

Rhinocladiella spp. Pestalotiopsis guepinii

Belirtilmemi

22-okza-[12]-Sitokalasin

Alkoloid

Antitmor Belirtilmemi

Wollemi Ulusal Park Sydney, Taxol Avustralya.

Diterpenoid

izelge 2-4 Endofit funguslardan elde edilen doal biyoaktif bileikler (devam)

59

Konak Bitki

Endofit

Topland Yer Yeni Gine Eyaleti Huangshan Park in Gney ulusal

Metabolit

Metabolit Snf

Biyoaktivite Testi

Fragrea (mee)

bodenii

Pestalotipsis jesteri Periconia spp.

Belirtilmemi Taxol

Belirtilmemi Diterpenoid Diterpenoid Belirtilmemi

Anti-oomycetes Antikanser Antikanser mmnspresif

Torreya grandifolia Taxodium Rich

distichum Pestalotiopsis microspora

Bataklk ormanlar Taxol Gney California Belirtilmemi Subglutinol A ve B

Triptergium wilfordii Fusarium Hook.f. subglutinans

izelge2-4 Endofit funguslardan elde edilen doal biyoaktif bileikler (devam)

60

3. MATERYAL

3.1. rneklerin Topland Blgeler

Fndk (Corylus avellana) bitkisine ait, kk, dal, yaprak ve tomurcuk rnekleri Karadeniz ve Ege blgelerinde 3 farkl yerden toplanmtr. rnekler nye/Ordu (Gleli Mahallesi Azmiler Mevki), Alapl/Zonguldak (Kasml Ky) ve Ege niversitesi Ziraat Fakltesi Bahe Bitkileri Blm Uygulama Alanlarndaki Fndk aalarndan toplanm ve plastik torbalarda kapal bir ekilde laboratuara getirilmitir. Yaprak rnekleri tercihen daha taze ve salkl rneklerden seilirken, kk rnekleri topran yaklak 10-15 cm altndaki kklerden alnmtr. Toplanan kk, dal, tomurcuk ve yaprak rnekleri ekil 31de gsterilmektedir.

ekil 3-1 Toplanan bitki rnekleri

3.2. Kullanlan Besiyerleri

3.2.1. Rose-Bengal kloramfenikol agar

32 g besiyeri (Oxoid Rose-Bengal Chloramphenicol Agar-CM0549; mikolojik pepton 5 g, glukoz 10 g, dipotasyum fosfat 1 g, magnezyum slfat 0.5 g, Rose-Bengal 0.05 g, agar 15.5 g, pH 5.5-6 @ 25C) 1 L distile suda tamamen zlnceye kadar kartrlm, 1.1 atmosfer basn altnda 121 0C de 15 dakika

61

otoklavlanarak sterilize edilmitir (pH 5.5-6). Bu besiyeri endofit funguslarn izolasyon almalarnda kullanlmtr (Andrews and Pitt, 1986).

3.2.2. Aktinomiset izolasyon ortam

22 g besiyeri (DifcoTM Actinomycete Isolation Agar-212168) tartlarak, 5 mL gliserol ile birlikte, 1 L distile suda tamamen zlnceye kadar kartrlm, 1.1 atmosfer basn altnda basn altnda 121 0Cde 15 dakika otoklavlanarak sterilize edilmitir (pH 5.5-6). Bu besiyeri endofit funguslarn izolasyon almalarnda kullanlmtr (ner, 2011).

3.2.3. Malt ekstrakt agar

48 g besiyeri (Malt Extract Agar Merck 1.05398; Malt extract 30 g; soya pepton 3 g; Agar 15 g) 1 L distile suda tamamen zlnceye kadar kartrlm, 1.1 atmosfer basn altnda 121 0Cde 15 dakika otoklavlanarak sterilize edilmitir (pH 5.5-6). Bu besiyeri endofit funguslarn izolasyon almalarnda kullanlmtr (Caruso et al., 2000).

3.2.4. Su agar
15 g agar (Merck) 1 L distile suda tamamen zlnceye kadar kartrlm, 1.1 atmosfer basn altnda 121 0Cde 15 dakika otoklavlanarak sterilize edilmitir (pH 5.5-6). Bu besiyeri endofit funguslarn izolasyon almalarnda kullanlmtr (Caruso et al., 2000).

3.2.5. Czapek Dox agar

45.4 g besiyeri (Oxoid Czapek Dox Agar Cm0097; sodyum nitrat 2 g, potasyum klorid 0.5 g, magnezyum gliserofosfat 0.5 g, ferrz slfat 0.01 g, potasyum slfat 0.35 g, skroz 30 g, agar 12 g, pH 5.5-6.2 @ 25C) 1 L distile suda tamamen zlnceye kadar kartrlm, 1.1 atmosfer basn altnda 121
0

Cde 15 dakika otoklavlanarak sterilize edilmitir. Bu besiyeri endofit

funguslarn izolasyon almalarnda kullanlmtr (Bills, 1996) .

62

3.2.6. Patates dekstroz agar

39 g besiyeri (Patates dekstroz agar Merck 1.10130; patates infzyon 4 g; D(+) Glukoz 20 g; agar 15 g) 1 L distile suda tamamen zlnceye kadar kartrlm, 1.1 atmosfer basn altnda 121 0Cde 15 dakika otoklavlanarak sterilize edilmitir (pH 5.5-6). Bu besiyeri endofit funguslarn izolasyon almalarnda kullanlmtr (Bills, 1996).

3.2.7. Malt ekstrakt broth

Aada belirtilen oranlarda bileenler 1 L distile suda tamamen zlnceye kadar kartrlm, 1.1 atmosfer basn altnda 121 0Cde 15 dakika otoklavlanarak sterilize edilmitir (pH 5.5-6). Bu besiyeri endofit funguslarn sv kltrlerinin yaplmasnda kullanlmtr (Bills, 1996). Maltoz 12.75 g/L Dextrin 2.75 g/L Gliserol 2.35 g/L Pepton 0.78 g/L

3.2.8. Mueller-Hinton agar

21 g besiyeri (Oxoid Mueller-Hinton Broth-CM0405, et infzyon 2 g, kazein hidrolizat 17.5 g, znr niasta 1.5 g, agar 20 g) 1 L distile suda tamamen zlnceye kadar kartrlm, 1.1 atmosfer basn altnda 121 0Cde 15 dakika otoklavlanarak sterilize edilmitir (pH 7.5). Bu besiyeri antimikrobiyal aktivitenin belirlenmesi almalarnda test bakterilerinin retilmesi iin kullanlmtr (ner, 2011).

3.3. Yzey Sterilizasyonu

Yzey temizleme ilemlerinde %70 EtOH (Merck), ve %1, %3, %5 NaOCl (amar suyu) kullanlmtr.

63

3.4. DNA zolasyonu

3.4.1. 50X TAE (Tris-Asetat-EDTA) tamponu

Tris baz Glasiyal asetik asit EDTA 0.5 M (pH 8) 242 g 57.1 mL 100 mL

242 g Tris baz 600 mL distile su ierisinde zldkten sonra glasiyel asetik asit, daha sonra da EDTA eklenmitir. Hacim, distile su kullanlarak 1 Lye tamamlanmtr (ner, 2011).

3.4.2. Potasyum asetat tamponu

Potasyum asetat 5 M: Glasiyel asetik asit: Distile su:

60 mL 11.5 mL 28.5 mL

3.4.3. Liziz tamponu

Tris (pH 8): EDTA (pH 8): SDS NaCl 10 mM 0.1 M %1 150 mM

64

3.4.4. Primerler
Taksadiyen sentaz (Ts) geni primeri (Zhou et al., 2007) TsF (5'-CAAACCCATGTCGAATTGAGAAG3') TsR (5'-AAGTTTGCATACACTCTGGAATCT3') Endofitlerin tanmlanmasnda kullanlan primerler (Van den ende); ITS1 (5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3) ITS4 (5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3) ITS5 (5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3)

3.4.5. PCR taq buffer( 10X buffer) :

KCl (NH4)2SO4 Tris-HCl (pH 8.75) Triton x100 BSA 100 mM 100 mM 200 mM %1 1 mg/mL

Toplam 15 L karm iin: 2 L 10X buffer 0.5 L (20mM) dNTP 1L (100pmol) R primer 1L (100pmol) F primer 0.25 L (5U/ L) taq polimeraz 4 L (50ng/ L) DNA

65

3.5. Test Organizmalar

rneklerden izole edilen endofitlerin antimikrobiyal aktivitelerini saptamak iin aadaki test organizmalar kullanlmtr. Enterecoccus faecalis ATCC 29212, Klebsiella pneumoniae CCM 2318, Escherichia coli O157:H7 (RSKK 232) Metisilin direnli Staphylococcus aureus (MRSA) (RSKK 95047) Sitotoksik aktivite testleri iin de aadaki hcre hatlar kullanlmtr. HT-29 (insan kolon adenokarsinoma) (ATCC katalog no: HTB-38TM) MDA-MB-231 (insan meme adenokarsinoma) (ATCC katalog no: HTB-26TM) DU-145 (insan prostat karsinomas, beyin metastaz) (ATCC katalog no: HTB-81TM) PC-3 (insan prostat adenokarsinoma, kemik metastaz) (ATCC katalog no: CRL-1435TM) HEK 293 (insan embriyonik transforme bbrek hcresi) (ATCC katalog no: CRL-1573TM)

3.6. Ekstraksiyon ve Kromatografik lemler

Fungus kltrlerinden elde edilen fermentasyon svlarnn

ekstraksiyonunda etil asetat (EtOAc) ve kloroform (Merck) kullanlmtr. Elde edilen ekstrelerin saflatrlmas iin silika jel ve RP C-18 (kart faz) adsorbanlar kullanlmtr. Younlatrma ilemi 37 0Cde rotary evaporatrde (Heidolph) yaplmtr.

66

4. YNTEMLER

4.1. Yzey Sterilizasyonu

Farkl blgelerden toplanan kk, dal, yaprak ve tomurcuktan oluan bitki ksmlar kapal torbalarda laboratuara getirilmi ve vakit kaybetmeden ilemlere balanmtr. Bitki ksmlar nce akan suda ykanarak toprak, amur ve d kirlilikler uzaklatrlmtr. rnekler yzey sterilizasyonuna tabi tutulmak zere nispeten daha kk paralara ayrlmtr. rnekler ilk olarak, farkl ksmlar farkl kavanozlarda olmak zere %70 EtOH iinde 5 dakika tutulmutur. Devamnda rnekler ayn ekilde farkl kavanozlarda 5 dakika steril distile suda bekletilmitir. Daha sonra %1, %3 ve %5 olmak zere farkl oranlarda NaOCl solsyonlar ile yzey sterlizasyonuna devam edilmitir. rnekler NaOCl iinde 5 dakika bekletildikten sonra, 3 kere steril su ile alkalanmtr. Son olarak rnekler %70 EtOH ile alkalanarak kurumaya braklmtr (ekil 4-1). Yzey sterilizasyonu iin yaplan ilem laminer kabinde, aseptik koullar altnda steril kaplar ve malzemeler kullanlarak gerekletirilmitir.

67

ekil 4-1 Yzey sterilizasyonu gerekletirilmi bitki rnekleri

4.2. Endofitlerin zolasyonu

Yzey sterilizasyonu gerekletirilen bitki rneklerinden, steril bistri ve pens yardmyla kk paralar alnarak hazrlanan farkl besi ortamlarna transfer edilmitir. Kk ve dal rneklerinin d kabuk ve yzeyleri uzaklatrlarak i dokudan paralar alnmtr. Yaprak ve tomurcuk rnekleri ise dorudan kk paralara blnerek besi ortamlarna aktarlmtr. zolasyon petrilerine aktarlan bitki paralar ekil 4-2de grlmektedir. Besi ortam olarak Patates Dekstroz Agar (PDA), Rose-Bengal (RB), Aktinomiset zolasyon Agar (AIO), Malt Ekstrakt Agar (MEA), Su Agar (SA) ve Czapek ortam kullanlmtr.

68

ekil 4-2 zolasyon petrilerine aktarlan bitki rnekleri Petriler oda scaklnda (24-28 0C) inkbasyona braklm ve 4-6 gn boyunca fungal reme bakmndan takip edilmitir. reme grlen petrilerdeki farkl koloniler steril koullarda farkl besi ortamlarna aktarlmak suretiyle pasajlamalar yaplmtr ekil 4-3te izolasyon petrilerindeki fungal reme ve pasajlama sonras kolonilerin oluumlar sunulmutur. Pasajlama ileminde, petrilerde oluan kolonilerden ze ile kk agar paralar steril koullarda alnp, taze agar ortamlarna aktarlarak gerekletirilmitir. zolasyon petrilerinde oluan, morfolojik olarak farkl koloniler, birka kez farkl ortamlarda pasajlanm ve koloniler saf halde elde edilmitir.

4.3. Kk lekli Fermentasyon almalar

zole edilen saf endofit fungus kolonilerini sv kltrde retmek iin Malt ekstrakt broth ortam kullanlmtr. Her bir izolat iin, 50 mL ortam ieren 250 mLlik erlenler hazrlanm ve 1.1 atmosfer basn altnda 121 0Cde 15 dakika otoklavlanarak sterilize edilmitir. Alama ilemi iin, petrilerde retilmi saf

69

kolonilerden steril koullarda ze ile kk agar paralar ya da miseller alnarak erlenlere aktarlmtr. Alanan erlenler 28
0

Cde rotary alkalaycda 150

devir/dakika alkalama hznda 15 gn inkbe edilmitir.

4.4. Byk lekli Fermentasyon almalar

zole edilen endofit funguslarn rettii aktif bileenleri belirlemek ve saf halde elde edebilmek iin yksek hacimli retimleri gerekletirilmitir. Ortam olarak Malt Ekstrakt Broth ortam kullanlmtr. Byk hacimli retim iki farkl ekilde yaplmtr. Birinci yntemde her bir izolat iin 200 mL ortam ieren 1000 mLlik erlenler hazrlanm ve 1.1 atmosfer basn altnda 121 0Cde 15 dakika otoklavlanarak sterilize edilmitir. Alama ilemi iin, petrilerde retilmi saf kolonilerden steril koullarda ze ile kk agar paralar ya da miseller alnarak erlenlere aktarlmtr. Alanan erlenler 28
0

Cde rotary alkalaycda 150

devir/dakika alkalama hznda 15 gn inkbe edilmitir. kinci yntemde ise sadece tek bir funugs tr iin, 10 Llik cam balonda 2 L retim ortam olacak ekilde hazrlanmtr. A kltr olarak, fungus nceden 100 mL ortam ieren 500 mLlik erlende retilmi a kltr kullanlmtr. Alanan 10 Llik balon oda koullarnda alkalayc zerine remeye braklmtr. Her iki yntemde de kltrler 3 hafta boyunca inkbe edilmitir.

70

ekil 4-3 zolasyon petrilerinde fungal oluumlar

4.5. Ekstraksiyon

Elde edilen fermentasyon svlar filtre kad kullanlarak szlm ve hcre kalntlarndan arndrlmtr. Elde edilen berrak sznt hacminin 1/2si kadar kloroform (CHCl3) ile 3 kez sv-sv partisyona tabi tutulmutur. Birletirilen kloroform fazlar rotary evaporatrde 37
0

Cde vakum altnda

uurulmutur. Elde edilen ekstreler 10 g/mL olacak ekilde EtOAcde zlerek 30 Lsi disklere yklenmi, disk difzyon yntemi ile patojenlere kar test edilmitir.

71

4.6. Disk Difzyon Yntemi

Disk difzyon ynteminde test mikroorganizmalar deneme ncesi aktif hale getirilerek 24 saatlik gen kltrler denemeye alnmtr. Aktivasyonda bakteriler iin Mueller-Hinton Agar kullanlmtr. 0.5 McFarland bulanklk standardna gre hazrlanan test organizmalar steril ekvyon ubuk yardmyla petrilere dklm besiyerlerinin zerine inokle edilmitir. Ardndan aktivitesi incelenecek ekstreler disklere emdirilmi ve kontrol antibiyotii ile birlikte petrilere steril bir pens yardmyla yerletirilmitir. Kontrol antibiyotii olarak 10 g gentamisin diske emdirilmitir. nkbasyon ncesi 2 saat +4 0Cde bekletilen petriler daha sonra 37 0Cye alnarak 24 saat inkbasyona braklmtr.

4.7. Sitotoksisite Testleri

Elde edilen ekstrelerin sitotoksik aktiviteleri MTT

(3-(4, 5-dimetil-2-

thiazolyl)-2, 5-difenil-2H-tetrazolium bromide) metoduyla test edilmitir (rgen et al., 2010). MTT solsyonu, 5 mg/mL olacak ekilde PBSte zlerek -20Cde stoklanmtr. 96 gzl plakalara 4x104 hcre/mL konsantrasyonda hcreler ekilmi (200 L/gz) ve %80-90 tutunmaya ulaana dek (yaklak 24 saat) inkbe edilmitir. Ardndan esktreler 200 Llik vasat ierisinde farkl konsantrasyonlarda hazrlanarak gzlere datlmtr. 48 saatlik madde uygulamasnn sonunda 20Cdeki MTT stok solsyonu zlm ve vasat ile 1/10 orannda seyreltilmitir. 96 gzl plakadaki vasat+ekstre yavaa uzaklatrlm ve her gze 200 L MTT + vasat solsyonu eklenerek plakalar 37C ve %5 CO2lik inkbatrlerde 3-4 saat inkbasyona braklmtr. nkbasyon sresi sonunda gzlerdeki MTT solsyonu dklerek ortama 200 L DMSO eklenmitir. Plakalar alkalaycda hafife alkalanarak (yaklak 500 rpm; Heidolph TITRAMAX) homojenize edilerek spektrofotometrede uygun absorbanslarda (570 nm, 690 nm; Molecular Devices VersaMax ELISA Microplate Reader) okutma yaplmtr.

72

4.8. DNA zolasyonu

4.8.1. Genomik DNA izolasyonu

Genomik DNA izolasyonu Liu et al.. (Liu et al., 2000) tarafndan tanmlanan metoda gre gerekletirilmitir. zolatlarn retimi malt ekstrakt agar ortamnda, 500 mLlik erlenlerde 100 mL ortam olacak ekilde, alkalamal inkbatrde 28 0Cde 3 gn sreyle yaplmtr. reme durdurulduktan sonra 50 mLlik falkonlara alnan reme ortam 5000 rpmde 10 dakika santrifj edilerek hcre ve ortam birbirinden ayrlmtr. Hcre pelletlerinden bir miktar alnp 1.5 mL eppendorfa konulmutur. Eppendorfa alnan hcrelerin zerine 500 L Liziz tamponu eklenerek 65 0Cde hcreler paralanana kadar bekletilmitir. Hcrelerin tamamen paralandklarndan emin olduktan sonra zerine 150 L 5 M potasyum asetat (pH 4.8) eklenerek 12000 rpmde 3 dakika santfrifj edilmitir. Santrifj sonras spernatant baka bir steril ependorfa alnarak zerine 2 mLye tamamlanacak ekilde souk izopropanol eklenmitir. 12000 rpm de 2 dakika santrifj yapldktan sonra spernatant uzaklatrlm ve pelletler elde edilmitir. Pelletlerin zerine 300 L %76 EtOH eklenerek 12000 rpm de 1 dakika santrifj yaplm ve spernatant atlmtr. Son olarak elde edilen pelletlerin zerine 50 L TE tamponu eklenerek sspanse edilmi ve genomik DNA, btnl ve safl asndan agaroz jel elektroforezi kullanlarak deerlendirilmitir.

4.8.2. Agaroz jel elektroforezi

%1lik agaroz jel hazrlamak amac ile 1 g agaroz 100 mL 1X TAE elektroforez tamponuna eklenmi ve mikrodalga frnda zlerek karmn homojen olmas salanmtr. Yaklak 40-45Cye kadar soutularak son konsantrasyonu 5 g/100 mL olacak ekilde 10000X GelRed boyas eklenmi ve jel kasete dklmtr. 30-60 dakika sre ile donmas beklenmitir. Taraklar karlm ve jel, iinde 1X TAE bulunan elektroforez tankna yerletirilmitir.

73

zole edilen genomik DNA rneklerinden 8 L alnarak 2 L jel ykleme tamponu (6X) ile kartrlm ve jel zerindeki kuyucuklara dikkatlice yklenmitir. lk kuyucua DNA standard yklenmi ve yrtme ilemi 100 V altnda gerekletirilmitir. Elektroforez sonucunda balang noktasna yakn, yksek molekl arlkl tek bir bant gzlenmesi, izole edilen DNAlarn btnlnn tam olduunu gstermitir (ner, 2011).

4.8.3. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)

Hedef molekl Paklitakzel, sentezleyen enzime ait spesifik gen blgesini polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile oaltmak iin Blm 3.4.4te dizisi verilen TsF ve TsR primerler kullanlmtr. PCR karm olarak Blm 3.4.5te verilen karm kullanlmtr. Karmdaki MgCl2 miktarlarn optimize etmek iin 0 mM, 10 mM ve 20 mM olmak zere farkl buffer hazrlanmtr. PCR metodu olarak; 94 0C 2 dakika denatrasyon, ardndan 32 dngde; 94 0C de 50 saniye, 55
0 0 0

C 1 dakika, 72

C 80 saniye ve 72

Cde 7 dakika uzama

uygulanmtr. PCR rnnn 5 lsi %1.5lik agaroz jelde 1 Kbplk marker kullanlarak yrtlmtr.

4.9. Ayrma Saflatrma lemleri

Biyolojik aktivite gsterdii dnlen ve byk hacimli retimden elde edilen ekstrelerden aktif ieriklerinin izolasyonu iin kolon kromatografisi kullanlmtr. Elde edilen ekstreler RP-C18 kart faz kromatografisine uygulanm ve sudan balayp metanole doru giden eitli elsyonlarla fraksiyonlar alnmtr. Uygulama iin 30 g RP-C18 su ile artlandrlarak 40 cm uzunluunda 6 cm apndaki cam kolona doldurulmutur. Elsyon her seferinde 50 mL elent geirilerek ve fraksiyonlar tplerde (yaklak 5 mLlik fraksiyonlar eklinde) toplanarak gerekletirilmitir.

74

Kromatografi ilemi ve toplanan fraksiyonlar nce Tabaka Kromtagorafisi (TK) ile takip edilmitir. TK analizinde yrtme sistemi olarak hekzan:etil asetat:metanol (10:10:3) kullanlmtr. TK tabakalarnn grntlemesinde iin hem UV lamba (256 ve 365 nm dalga boylar) hem de %30 slfrik asit pskrtme sonras starak zonlarn tespiti ilemi kullanlmtr.

4.10. Yap Tayini

Ekstrelerden elde edilen saf bileiklerin yap tayinleri iin spektral yntemler [1D-NMR (1H-NMR,13C-NMR), 2D-NMR (DQF-COSY, HMBC ve HMQC)] kullanlarak gerekletirilmitir. Analizler Varian AS400 (400 MHz) cihaznda gerekletirilmitir. rnekleri zmek iin CDCl3 kullanlmtr.

75

5. BULGULAR

5.1. Yzey Sterilizasyonu

Bitkilerin yzey sterilizasyonu %70 EtOH uygulamasn takiben %1, %3 ve %5 olmak zere 3 farkl konsantrasyonda NaOCl kullanlmtr. Her 3 konsantrasyonda da yzey sterilizasyonu sonras alkalama sularndan rnekler alnp besi ortam bulunan petrilere ekim yaplmtr. Petrilerde herhangi bir biyolojik reme gzlenemediinden, NaOClnin 3 konsantrasyonun da baarl bir yzey sterilizasyonu gerekletirdii sonucuna varlmtr.

5.2. Endofitlerin zolasyonu

zolasyon ilemi ayr zamanda, farkl blgeden toplanan fndk bitkisine ait kk, dal, yaprak ve tomurcuk rneklerinden yaplmtr. zolasyon petrilerinde 4-6 gnlk inkbasyon sonunda oluan fungal koloniler morfolojik yaplarna gre snflandrlm ve her koloni petriye aktarlarak hem farkl ortamlardaki reme yetenekleri test edilmi hem de koloniler saf kltr olarak izole edilmeye allmtr. Ard arda pasajlanan koloniler saf kltr olarak izole edilmitir ve kodlanmtr. Kk kaynakl izolatlar R, dal kaynakl izolatlar B, yaprak kaynakl izolatlar L ve tomurcuk kaynakl izolatlar T harfiyle kodlanmtr. (izelge 5-1). Saf kltrlerin tekrar petrilere ekimi yaplarak saflklar ve morfolojik zellikleri kontrol edilmitir. ekil 5-1de saf halde elde edilen morfolojik olarak farkl endofit funguslar gsterilmitir. Pasajlama ilemleri srasnda 2L6 kodlu izolat kontaminasyonlardan kurtarlamam ve kaybedilmitir. L2 ve L3 kodlu izolatlar ise morfolojik olarak ayn tr olduuna karar verilmitir. Benzer ekilde yaprak izolatlar 2L7, 2L8 ve 2L9 da yakn morfolojik zellikler gstermektedir. Saf halde elde edilen koloniler, iinde PDA ortam bulunan yatkagar tplere alnarak sonraki almalar iin stok kltr oluturulmutur. Morfolojik snflandrmadan farkl olarak elde edilen izolatlarn molekler biyolji teknikleri ile tr tayinleri yaplmtr.

76

izelge 5-1 zole edilen endofit funguslar Tarih 30.09.2011 30.09.2010 30.09.2010 30.09.2010 30.09.2010 07.01.2011 07.01.2011 07.01.2011 07.01.2011 07.01.2011 24.01.2011 24.01.2011 24.01.2011 24.01.2011 rnek Kodu rnek blgesi rnek tr 1R10 L1 L2 L3 R4 2R5 2L6 2L7 2L8 2L9 3L11 3L12 3T13 3B14 Ordu Ordu Ordu Ordu Ordu E.. B.B.B E.. B.B.B E.. B.B.B E.. B.B.B E.. B.B.B Zonguldak Zonguldak Zonguldak Zonguldak Kk Yaprak Yaprak Yaprak Kk Kk Yaprak Yaprak Yaprak Yaprak Yaprak Yaprak Tomurcuk Dal zolasyon metodu %3 NaOCl %3 NaOCl %3 NaOCl %3 NaOCl %1-3 NaOCl %5NaOCl %5NaOCl %3 NaOCl %3 NaOCl %3 NaOCl %5NaOCl %5NaOCl %5NaOCl %5NaOCl Ortam PDA Czapek RB Czapek/AIO AIO/MEA/SA/PDA MEA PDA MEA PDA MEA PDA PDA PDA PDA Morfoloji Siyah Beyaz Pamuksu Beyaz Griye Yakn Beyaz Griye Yakn Beyaz Pembeye Yakn Beyaz Sarya Dnen Kahve Rengi, Pas Yeil Mat Yeil Mat Yeil Mat Beyaz Kahverengi Beyaz Sarya Dnen Koyu Yeil Siyah Beyaz Fusarium oxysporium Phomopsis amygdali Tr

77

ekil 5-1 zole edilen saf endofit kolonileri

78

5.3. Kk ve Byk lekli Fermentasyonlar

Elde edilen endofitik fungus izolatlar DNA izolasyonu ve ekstrelerin elde edilmesi iin sv kltre alnmtr. Sv kltrler iin Malt ekstrakt broth (MEB) ortam kullanlmtr. DNA izoalsyonlarnda kullanlacak pelletlerin retimi, 10 mL MEB ortam ieren steril gaita kaplarnda 28 0Cde rotary alkalaycda 150 devir/dakika alkalama hznda 2 gn inkbe edilmitir. Aktivite testlerinde kullanlacak ekstrelerin elde edilmesi iin Blm 4.3te anlatld gibi fermentasyonlar yaplmtr. 2-3 haftalk fermentasyon sresi sonunda inkbasyon sonlandrlm ve her bir fungus iin ekstreler elde edilmitir (ekil 5-2).

ekil 5-2 Baz izolatlara ait kk inkbasyon sonras fermentasyon ortamlar

zolatlarn byk lekli fermentasyonlar Blm 4.4te anlatld zere iki farkl biimde yaplmtr. Btn izolatlara ait byk lekli fermentasyonlar 250 mL ortam ieren 1000 mLlik erlenlerde gerekletirilirken, L1 izolat hem erlenlerde hemde 10 Llik balonda olmak zere iki kere ve toplamda 7.5 L fermentasyon yaplmtr. ekil 5-3te byk lekli fermentasyon rnekleri sunulmutur.

79

ekil 5-3 Byk lekli fermentasyon ortamlar

5.4. Ekstraksiyon ve TK Analizleri

Fermentasyon sonras ortamlar hcrelerden uzaklatrmak iin filtrasyon ilemi kullanlmtr. Ortamlar pellet ve misellerden dolay olduka vizkoz olduundan ve ak salanamadndan filtre kd ile szme ileminde baarl sonu alnamamtr. Bunun yerine ortamlar iki katl tlbent bezinden szlmtr. Filtrasyon sonras her bir fungusa ait ortam svlar Blm 4-5de belirtildii gibi 3 kez CHCl3 ile ekstraksiyona tabi tutulmutur. Ekstraksiyon sonras elde edilen ekstrelerin kimyasal profillerini karlatrmak iin TK analizleri yaplmtr. TK plaklar hekzan:etil asetat:metanol (10:10:3) sisteminde yrtlmtr (ekil 5-4).

80

ekil 5-4 Elde edilen ekstrelerin TK profilleri

5.5. Aktivite Testleri

Elde edilen ekstrelerin antimikrobiyal aktiviteleri Blm 4.6da anlatlan disk difzyon yntemiyle, sitotoksik aktiviteleri ise Blm 4.7de anlatlan MTT metoduyla test edilmitir. Antimikrobiyal aktivite testlerinde L3 izolatndan elde edilen ekstre dnda belirgin bir aktiviteye rastlanmamtr (ekil 5.5). Testlerde kontrol olarak Gentamisin antibiyotii kullanlmtr. Sitotoksik aktivite testleri sadece L1 ve R4 izolatlarndan elde edilen ekstrelere uygulanmtr. Blm 4.7de belirtilen kanser hcre hatlarna kar testler edilmi ve kontrol olarak takzol kullanlmtr. lk aamada ekstreler sadece grsel olarak analiz edilmi ve IC-50 deerleri llememitir. Bata L1 olmak zere her iki izolattan elde edilen ekstrelerin sitotoksik aktivite gsterdii belirlendikten sonra, aktiviteden sorumlu molekllerin tesbiti iin preparatif TK yntemiyle her iki ekstreden iki farkl bileen izole edilmitir. Bu bileenler tekrar sitotoksik aktivite testlerine alnm ve IC50 deerleri llmtr. Sonular izelge 5-2de verilmitir.

81

ekil 5-5 Baz izolatlardan elde edilen ekstrelerin antimikrobiyal aktiviteleri

Hcre Hatt R4-1 PC-3 HT-29 MDA-MB-231 HEK 293

62.90 19.72 68.80 38.65

IC-50 deerleri (g/mL) R4-2

>250 70.02 >250 41.28

L1-1
20.54 16.69 41.70 11.83

L1-2
40.82 18.68 >250 13.84

izelge 5-2 L1 ve R4 ekstrelerine ait IC50 deerleri

82

ekil 5-6 L1 izolatndan elde edilen L1F3 bileiinin sitotoksik aktivitesi

5.6. DNA zolasyonu ve PCR

Elde edilen izolatlarn genomik DNAlar Blm 4.8de anlatld gibi izole edilmitir. L1 ve R4 izolatlarnn genomik DNAlar baarl bir ekilde izole edilirken dier izolatlarn genomik DNAlar izole edilememitir. zole edilen genomik DNA rnekleri, izolatlarn tr tayinin gerekletirmek zere Refgen Gen Aratrmalar ve Biyoteknoloji Merkezine gnderilmitir. ITS1 primerleri kullanlarak gerekletirilen sekanslama analizlerinde izolatlarn trleri belirlenmitir. L1 ve R4 kodlu izolatlarn srasyla Phomopsis amygdali ve Fusarium oxysporium olduklar belirlenmitir (ekil 5-7).

83

Tanmlanan izolatlara ait ITS rDNA dizileri; L1 GGGTTGGCTGGGACGCGCCTCGGCGCACCCAGAAACCCTTTGTGAACT TATACCTTACTGTTGCCTCGGCGCAGGCCGGCTCCCATCTGGGGGCCC CTCGTTTCTGACGAGGAGCAGGCTCGCCGGCGGCCAAGTTAACTCTTG TTTTTAATTTGAAACTCTGAGAATAAAACATAAATGAATCAAAACTTT CAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAT GCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTG AACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAGGGCATGCCTGTTCGAGC GTCATTTCAACCCTCAAGCCTGGCTTGGTGATGGGGCACTGCCTTTGTG TAAAAGCGAAGGCAGGCCCTGAAATTCAGTGGCGAGCTCGCCAGGAC TCCGAGCGCAGTAGTTAAACCCTCGCTTTGGAAGGACTGGCGGTGCCC TGCCGTTAAACCCCCAACTCTTGAAAATTTGACCTCGGATCAGGTAGG AATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA R4 GGCCTTCGGGAGGTCACTCCCAAACCCCTGTGAACATACCACTTGTTG CCTCGGCGGATCAGCCCGCTCCCGGTAAAACGGGACGGCCCGCCAGA GGACCCCTAAACTCTGTTTCTATATGTAACTTCTGAGTAAAACCATAA ATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGA AGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTG AATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGG GCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCACAGCTTGGTGTTG GGACTCGCGTTAATTCGCGTTCCTCAAATTGATTGGCGGTCACGTCGA GCTTCCATAGCGTAGTAGTAAAACCCTCGTTACTGGTAATCGTCGCGG CCACGCCGTTAAACCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAG GAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAGCCGGGAGGAAA

84

ekil 5-7 zolatlarn ITS analizleri sonucuna dayanarak oluturulan filogenetik aa

DNAlar izole edilen ve tr tayinleri gerekletirilen izolatlarda paklitakzel varln saptamak iin, paklitakzel biyosentezinden sorumlu enzimlerden biri olan Taksadiyen sentaz(Ts) gen blgesi varl Blm 4.8.3te belirtilen PCR metodu kullanlarak tespit edilmeye allmtr. ok ileri almalar yaplmam olmakla birlikte yaplan ilk denemelerde sz konusu gen blgesine rastlanamamtr.

5.7. Ayrma Saflatrma lemleri

Sitotoksik aktivitesi nemli bulunan L1 izolatnn biyoaktif bileenlerini saflatrmak iin ileri almalar yaplmtr. L1 izolatnn byk hacimli retimi gerekletirilmi ve Blm 4.9da belirtildii gibi kromatografik yntemlerle kimyasal bileenleri saflatrlmtr. Bileenler TK analizi yaplarak izole edilmitir. L1 izolat ekstresinden 3 farkl molekl izole edilmitir. Bu bileenler L1F0, L1F2 ve L1F3 olarak kodlanmtr. Bu bileiklere ait TK grnmleri ekil 5-8de gsterilmitir.

85

ekil 5-8 Saflatrlan bileiklere ait TK plakalarnn UV ve normal grnmleri

5.8. Yap Tayini

L1 izolatnn kltr svsndan izole edilen L1F2 ve L1F3 bileiklerinin yaplar Blm 4.10da belirtildii gibi aydnlatlmtr. 1D ve 2D NMR analizleri sonunda, izole edilen bileiklerden L1F2 (Bkz. ekil 5-8) kodlu bileiin daha nceden rapor edilen pestalotin ((R)-6-((S)-1-hidroksibtil)-4-metoksi-5,6dihidro-2H-piran-2-on) molekl olduu saptanmtr. L1F2 moleklnden elde edilen 1H ve 13C bilgileri literatrdeki pestalotin bilgileriyle (Kimura et al., 1980) karlatrldnda birebir rtt belirlenmitir (izelge 5-3).

86

1D-NMR spektrumlar deerlendirildiinde L1F3 moleklnn L1F2 ile ayn piran halkasn ve C-6 pozisyonundan bal yan zinciri tad saptanmtr. Bununla birlikte
1 13

H- ve

C-NMR spektrumlarnda ekstra sinyaller gze

arpmtr. Bu ekstra sinyaller ilk aamada 3 karbon ve 6 proton fazlas olarak belirlenmitir. COSY spektrumu yardm ile molekl iindeki ekstra proton sinyalleri deerlendirildiinde bir btanoil grubunun var olduu grlmtr (-OCH2-CH2-CH2-CH3). Bu bilgiler nda L1F3n C-4 pozisyonunda L1F2den farkl olarak metoksi yerine btoksi grubu tad anlalmtr. Buradan hareketle L1F3n kimyasal yaps, (R)-4-btoksi-6-(S)-1-hidroksibtil)-5,6-dihidro-2Hpiran-2-on olarak aydnlatlmtr. L1F3 moleklnn yaps ekil 5-9da sunulmutur.

KARBON C (ppm) C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 C-7 C-8 C-9 C-10 C-1 166.9 90.2 173.3 29.8 78.6 72.7 32.6 22.8 14.2 56.4

H (ppm) 5.14 (s) 2.79 (dd), 2.25 (dd) 4.29 (dt) 3.62 (s) 1.59 1.37 0.9 (m) 3.76

izelge 5-2 L1F2 moleklne ait 1H ve 13C datalar

87

ekil 5-9 L1F2 moleknn yaps

ekil 5-10 L1F3 moleklnn yaps

88

ekil 5-11 L1F2 moleklne ait 1H NMR spektrumu (CDCl3, 400MHz)

89

ekil 5-12 L1F2 moleklne ait 13C NMR spektrumu (CDCl3 100 MHz)

90

ekil 5-13 L1F3 moleklne ait 1H NMR spektrumu (CDCl3 400MHz)

91

ekil 5-14 L1F3 moleklne ait 13C NMR spektrumu (CDCl3 100 MHz)

92

ekil 5-15 L1F3 iin COSY Spektrumu

93

6. SONU VE TARTIMA

Endofitler, tp, tarm ve ila endstrisi alannda geni potansiyeli olan, biyoaktif ve kimyasal olarak yeni bileikler iin zengin ve gvenilir bir kaynak sunan az aratrlm bir mikroorganizma grubudur. Yksek bitkilerin izolasyon iin seilmesinin daha iyi anlalmas iin, endofitlerin varl ve evrelerine yantlarna baklmaldr. Bu, snrsz kaynak sunan az anlalm mikroorganizmalarla ilgili almalar yeni balam olmasna ramen, bu alanda kefedilecek organizma, rn ve yararlarn byk potansiyeli bulunmaktadr (Kk vd, 2003). Son zamanlarda bitki aratrmalar zerine odaklanma dnya genelinde artm ve birok geleneksel sistemde kullanlan tbbi bitkiler iin yksek potansiyellerini gsteren kantlar elde edilmitir. Bitkilerle ortak yaayan endofitlerin rettii sekonder metabolitlerin, hastalklarn tedavisinde kullanlabilecei kantlanmtr. Hem saylar hem de ekonomik ve evresel nemi bakmndan bitki ve dier ortamlarla ilikili organizmalarn anlalmas, ynetilmesi ve biyoeitliliklerinin uygun bir seviyede srdrlebilir bir biimde kullanlmas iin daha ok aratrma yaplmas gerekmektedir (Tejesvi et al., 2007). Bu alma kapsamnda Trkiyenin %80i, dnyann ise yaklak %60 Karadeniz blgesinden salanan fndk (Corylus avellana) bitkisinden endofit funguslarn izolasyonu ve bu funguslarn biyoaktiviteleri incelenmitir. Endofit funguslarn en byk eitlilik gsterdii blgeler yamur ormanlardr. Karadeniz Blgesi de zellikle iklimi bata olmak zere corafi zellikleri bakmndan Trkiyenin yamur ormanlar olarak tanmlanmaktadr. Besleyici zellii ve insan salna faydalar asndan byk nem arz etmesine ramen fndk zerinde yaplan bilimsel almalar olduka yetersizdir. Fndk ve yan rnleri ile ilgili yaplan az saydaki almada fndk ve fndk yan rnlerinin bir ok hastaln nlenmesinde kullanlan fitokimyasal maddelere sahip olduu ispat edilmitir. Analiz edilen rneklerde, fenolik asitler, flavon/flavonol glikozitler ve takzan grubu bileiklere rastlanlmtr. Fndk ve fndk yan rnlerinden elde edilen ekstreler kuvvetli antioksidan aktivite ve serbest radikal sprme (RSA) kapasitesi gstermektedirler. nsandaki dk

94

younluklu lipoproteinin (hLDL) oksidasyonunu nlemesi dier nemli bir zelliidir. zellikle hLDLin oksidasyona uramas damar tkanklgnn gstergesidir ve bu kalp hastalklarna yol amaktadr. Ayrca, fndk ve fndk yan rnlerinden elde edilen ekstraklar halkal DNAnn dier formlara bozulmasn ve krlmasn nlemektedirler. DNAdaki bu krlmalar ve bozulmalar kanserin balangcna neden olabilmektedir. zellikle paklitakzel ve takzan grubu bileikler daha ok fndn yenmeyen ksmlarnda mevcuttur. Bu rnlerdeki paklitakzel miktar porsuk aacndaki miktarlara hemen hemen yakn miktardadr (%0.004-0.1 kuru rnekte) (Shahidi ve Alaalvar, 2004). Benzer ekilde, fndk doku kltrleriyle yaplan baka bir almada takzan grubu bileiklere rastlanmtr. Fndn kk, yaprak ve tohum gibi farkl blgelerinden alnan rnekler farkl hormon ve kombinasyonlarda ortamlar kullanlarak kltre alnm ve kltr ortamnda paklitakzel dnda, paklitakzel sentezinde balang maddesi olarak kullanlan 10-deasetiltaksol ve 10deasetilbakatin III gibi takzan trevi bileikler tanmlanmtr. Bu bileiklerin antitmr aktiviteleri de test edilmi ve aktivite gsterdikleri tespit edilmitir (Bestoso et al., 2006). Fndk yan rnlerinde takzan trevi bileiklerin bulunmas, dnyann en byk kanser ilac Takzol iin alternatif bir kaynak oluturmakla beraber, takzoln esas kaynaklar porsuk aac ve endofitleri arasndaki ilikiyi de akllara getirmektedir. Takzol ve biyoaktivite gsteren bir ok dier bileik, hem konak bitki hem de o bitkinin endofit fungusu tarafndan retilebilmektedir. Dolaysyla fndk ve endofit funguslar iin ayn ilikinin muhtemel olabilecei gz nne alnmaldr. Fndk rnlerinin besleyici ve biyoaktif zellikleri bilinmesine ramen, fndktan izole edilen bir endofit fungus henz rapor edilmemitir. Bu almada greceli olarak az sayda tr izole edilmesine ramen, bu konudaki literatr gz nne alndnda izole edilen trlerin nemi daha iyi anlalmaktadr. Bu alma kapsamnda Ordu, zmir ve Zonguldak blgelerinden fndk bitkisine ait, kk, dal, yaprak ve tomurcuk rnekleri toplanmtr. Bu rnekler Blm 4.1de anlatld gibi yzey sterilizasyonua tabi tutulmu ve Blm 4.2de anlatld ekilde farkl besi ortamlar kullanlarak endofit fungus

95

izolasyonlar gerekletirilmitir. Ard arda pasajlamalar sonunda morfolojik farkl trler snflandrlm ve kodlanmtr. zolasyonlar sonunda 2 tane kk, 1 tane dal, 1 tane tomurcuk ve 10 tane yaprak kaynakl olmak zere toplam 14 izolat elde edilmitir. Bu izolatlardan elde edilen ekstreler, Enterecoccus faecalis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli O157:H7 ve Metisilin direnli Staphylococcus aureus (MRSA) mikroorganizmalarna kar antimikrobiyal aktiviteleri test edilmitir. Ancak ekstrelerin hibirinde nemli bir antimikrobiyal aktivite gzlenmemitir. Bu izolatlardan iki tanesi L1 ve R4n molekler biyoloji teknikleri ile tr tayinleri yaplm ve srasyla Phomopsis amygdali ve Fusarium oxysporium olarak tanmlanmtr. Phomopsis biyoaktif doal bileikler ynnden zengin bir filamentz fungus grubudur. u ana kadar Phomopsis ile yaplan almalarda, fomopsikalasin, fenokalasinler, fomalaktonlar, dikarandroller, fomoksantonlar, fomopsidin, fomopsinler, fomoenamid, fomoforbinler, benzofomosin A, ksilarinol A ve oblongolidler gibi deiik biyoaktivitelere sahip geni aralkta bileikler rapor edilmitir. P.amygdali ise zellikle eftali ve badem aalar iin minor dzeyde bitki patojeni olup ekonomik bir deeri yoktur. P.amygdaliden birka bitki bymesini dzenleyen metabolit dnda rapor edilen nemli bir metabolit bulunmamaktadr (Hemtasin et al., 2008). Bu nedenle bu endofitin daha derinlemesine incelenmesi ve biyoaktif ieriklerinin belirlenmesi nem arz etmektedir. Bu kapsamda P.amygdali olarak tanmlanan L1 izolat ele alnm ve biyoaktivite taramas iin byk lekli retimi gerekletirilmitir. 3 haftalk fermentasyonu sonunda elde edilen fermentasyon svs kloroform ile ekstrakte edilmitir. L1 ekstresi sitotoksik aktivivte testlerinde; PC-3, HT29 ve MDA-MB-231 hcre hatlarna kar test edilmi ve aktivite tespit edilmitir. L1 izolatndan elde edilen ekstre kromatografik ilemlere tabi tutularak baz bileenleri saflatrlmtr. Saflatrlan bileiklerden L1F2 ve L1F3n yap tayinleri gerekletirilmi ve piran-2-on trevi molekller olduu tespit edilmitir. L1F2 bilinen bir molekl olan pestalotin olarak tanmlanrken

96

L1F3n doa ve bilim iin yeni bir molekl olduu belirlenmitir. Piran-2-on bileikleri daha ok organik sentezlerde kullanlrken farkl kaynaklardan elde edilen trevlerinin eitli biyoaktiviteler gsterdii saptanmtr. Pestalotinin ise bitki byme hormonu giberellinlerin sinerjisti ve bitki byme dzenleyicisi olduu bilinmektedir. Tek bana bir aktivitesi olmayan pestalotin, giberellinlerin varlnda bitki bymesini tetikleyici etki gstermektedir. Test mikroorganizmalarna kar herhangi bir antimikrobiyal aktivite gstermeyen L1F3 sitotoksik aktivite testlerinde tmr hcrelerine kar aktivite gstermi ancak IC-50 deeri yksek olduundan zayf etkili bir bileik olarak deerlendirilmitir. Fusarium trleri daha ok bitki patojeni, toprak gda ve tahl kontaminant olarak bilinmektedir. Bununla birlikte Fusarium trlerinde izole edilmi bata bitki patojenlerine kar aktivite gsteren, iinde piran-2-on trevi bileiklerin de olduu birok biyoaktif doal rn bulunmaktadr. F. oxysporum da benzer ekilde bitkilerde ounlukla nematisidial zellik gstererek koruma salamaktadrlar. zole edilen ve Fusarium oxysporium olarak tr tayin edilen R4 izolatnn da sitotoksik aktivite testlerinde aktivitesi test edilmi ve L1 izolatna gre daha dk aktivite gsterdii belirlenmitir. R4 izolatndan elde edilen ekstrelerde herhangi bir ayrma saflatrma almas yaplmamtr. zole edilen ve tanmlanan her iki fungus tr de Paklitakzel biyosentezinde nemli enzimlerden biri olan Taksadiyen sentaz (Ts) enzimini kodlayan gen blgesi bakmndan incelenmitir. Aratrmalar ok ileri dzeyde olmamakla beraber, her iki fungusun genomik DNAlar ve Taksadiyen sentaz (Ts) enzimini kodlayan gen blgesine ait primerler kullanlarak PCR yaplm ve elde edilen rnler agaroz jelde yrtlerek ilgili blgede primerlerin balanp balanmad tesptit edilemeye allmtr. Enzim gen blgesine ait primerlerle birebir rten gen blgeleri bulunmamakla birlikte daha kk boyuttaki blgelerin oaltld grlmtr. Ts primerleri yaklak olarak 632 bplik bir bant verirken, funguslara ait DNA fragmentlerinin 400 bp civarnda bantlar oluturduu gzlenmitir. Paklitakzel biyosentezi tam olarak aydnlatlmam olmasna ramen 20den fazla enzimatik basamaktan olutuu tahmin edilmektedir. Taksadiyen sentaz enzimi

97

ise bu biyosentezi balatan paklitakzel yolaklarnn ilk enzimdir. Bu enzimden sonra 20ye yakn enzimatik basamak gereklemektedir. Bu nedenle DNA rneklerinde bu gen blgesinin varl ya da yokluu dorudan paklitakzel varlna ya da yokluunu iaret etmemektedir. Taksadiyen sentaz basamandan sonra biyosentez baka bir yolaktan devam edip baka bir rnle sonulanabilecei gibi, Taksadiyen sentaz enzimine ait gen blgesinin transkribe edilmeyip biyosentezin baka bir yolak zerinden devam etmesi de mmkn olabilir. Bu adan bakldnda izole ettiimiz fungus trlerinin paklitakzel retme yetenekleri daha detayl incelenmelidir. zellikle yukarda belirtildii gibi porsuk aalar ve barndrdklar endofitlerin ayn biyoaktif zellikteki paklitakzeli retebilmeleri, dahas bu yetenein evrimsel basamaklarda birinden dierine getii gz nne alndnda daha ileri aratrmalarn nemi anlalmaktadr. Fndk bitkisinin eitli ksmlarndan alnan doku rneklerinde paklitakzel ve takzan trevi bileiklerin bulunduu gz nne alndnda, fndk bitkisinden elde edilen endofitlerin de bu bileikleri retme yeteneine sahip olma ihtimali olduka yksektir. L1 izolatnn kimyasal bileenleri derinlemesine incelenmemi olmasna ramen izole edilen 2 bileikten birinin yapsnn yeni olmas bu endofitlerin potansiyelini ortaya koymaktadr. Henz kefedilmemi biyolojik eitlilik kaynaklarnn genellikle yeni kimyasal eitlilik ile ilgili olduunu dikkate almak nemlidir. Penisilinin kefiyle, kk biyoaktif molekller iin toprak mikroorganizmalar geni bir biimde aratrlmtr. Bununla birlikte endofitler, denizel mikroorganizmalar, ekstrem koullardaki mikroorganizmalar, dier mikroorganizma ya da bceklerle ortak yaayan mikroorganizmalar daha az incelenmitir ve bunlar yeni yararl doal rnlerin potansiyel kayna olarak grlmektedir (Gallo et al., 2008). zellikle tbbi bitki olarak bilinen ve geleneksel tpta kullanlan bitkiler, endofit biyolojileri ynnden deerlendirilmeli ve detayl bir ekilde incelenmelidir. Bu kapsamda yrttmz almada, dnya geneli retiminde Trkiyenin byk oranda sz sahibi olduu ve gda olarak birok faydasnn yannda, yaplan son almalarda paklitakzel dahil olmak zere bir ok biyoaktif bileikleri

98

bulundurduu spatlanan fndk bitkisi endofitleri aratrlmtr. Elde edilen sonular umut vericidir ve daha ileri almalarn yaplmas nerilmektedir. Dnyada btn bitkilerle ortak yaayan en az birka endofit trnn bulunduu tahmin edilmektedir. Dnyadaki bitki eitlilii gz nne alndnda yeni doal biyoaktif rnler iin endofit funguslarn ok byk bir kaynak oluturabilecei grlmektedir. Son zamanlarda endofitlerden elde edilen doal rnlerle ilgili alma saylar art gstermesine ramen, endofitler hala ok az incelenmi bir mikroorganizma grubudur. Bu nedenle endofitlere ynelik aratrmalar, doal rnlerin biyolojik ve kimyasal zellikleri iin umut vericidir.

99

KAYNAKLAR DZN

Andrews, S., And

Pitt, J. I,. 1986, Selective Medium for Isolation of

Fusarium Species and Dematiaceous Hyphomycetes from Cereals, Applied And Environmental Microbiology, p. 1235-1238 Bacon, C.W. and White, J.F. 2000, Microbial Endophytes, Marcel Dekker, New York Bestoso F., Ottaggio L., Armirotti A., Balbi A., Damonte G., Degan P., Mazzei M., Cavalli F., Ledda B. and Miele M., 2006, In vitro cell cultures obtained from different explants of Corylus avellana produce Taxol and taxanes. BMC Biotechnology 6:45. Bills, G. F. , 1996, Isolation and analysis of endophytic fungal communities from woody plants. Systematics, Ecology and Evolution of Endophytic Fungi in Grasses and Woody Plants. S. Redlin and L. M. Carris, eds. APS Press, St. Paul, MN. pp. 31-65. Caruso, M., Colombo, A.L., Fedeli, L., Pavesi, A., Quaroni, S.,Saracchi, M. and Ventrella G., 2000, Isolation of endophytic fungi and actinomycetes taxane producers, Annals of Microbiology, 50, 3-13 Castellani, A., 1967, Maintenance and cultivation of common pathogenic fungi of man in sterile distilled water, further researches. J Trop Med Hyg 70:181184 Dreyfuss, M.M. and Chapela, I.H., 1994, Potential of Fungi in The Discovery of Novel, Low-Molecular Weight Pharmaceuticals. In: Gullo, V.P. (eds) The Discovery of Natural Products with Therapeutic Potential. Butterworth-Heinemann, Boston, p. 49. Gallo, M.B.C., Guimaraes, D.O., Luciano da, S.M. and Pupo, M.T., 2008, Natural products from endophytic fungi. In: Saikia R, Bezbaruah RL, Bora TC (eds) Microbial Biotechnology. New India Publishing Agency, pp 138168

100

KAYNAKLAR DZN (devam)

Gerrits van den Ende, A.H.G., Executing a PCR with ribosomal DNA http://www.scedosporiumecmm.com/Protocols/Executing%20a%20PCR%20with%20ribosomal %20DNA.pdf (Eriim tarihi: 14 Aralk 2011) Hartung de Capriles C, Mata S and Middelveen M., 1989, Preservation of fungi in water (Castellani): 20 years. Mycopathologia 106:7380 Hawksworth, D.C. and Rossman, A.Y., 1987, Where are the undescribed fungi ? Phytopathology 87, 888891 Hemtasin, C., Kanokmedhakul, S., Kanokmedhakul, K.,

Hahnvajanawong, C., Soytong, K., Prabpai, S. and Kongsaeree, P., 2011, Cytotoxic pentacyclic and tetracyclic aromatic sesquiterpenes from Phomopsis archeri. J Nat Prod 74:609613. Hoffman, A. and Shahidi, F., 2009, Paclitaxel and other taxanes in hazelnut, Journal of Functional Foods 1 33 37 Karaku, Y. S., 2008, Sekonder metabolitler ve etkiler http://www.genbilim.com/content/view/3904/75/ (Eriim tarihi: 14 Aralk 2011) Kharwar, R.N. and Strobel, G., 2011, Fungal Endophytes: An Alternative Source Of Bioactive Compounds For Plant Protection in; Dubey, N.K. (Ed.), Natural products in plant pest management, Wallingford, Oxfordshire : CABI 306s. Klolu, M. . ve zko ., 2008, Fungal sistematikteki molekler gelimeler. OM Zir. Fak. Dergisi, 23(1):65-72. Kimura, Y., Suzuki, A. And Tamura, S., 1980, Pestalotin and Its Analogues, Agric. Biol. Chem., 44 (2), 451-452. Kk, ., Kvan, M., Knac, E. ve Knac,G., 2003, Antifungal
13

C -NMR Spectra of

Peptidler Orlab On-Line Mikrobiyoloji Dergisi 01(10): 1-8. Liu, D., Coloe, S., Baird, R. and Pedersen, J., 2000, Rapid mini-preparation of fungal DNA for PCR. J Clin Microbiol, 38: 471. May, R., 1991 A fondness for Fungi, Nature 352, 475 - 476

101

KAYNAKLAR DZN (devam)

Onbal, D. ve Aslm, B., 2011, Pseudomonas Cinsi Bakterilerin Biyoteknolojik Adan nemli Baz Sekonder Metabolitleri, Elektronik Mikrobiyoloji Dergisi 9 (2):25-34 ner, ., 2011, Denizel Kaynaklardan Aktinomiset Grubu Mikroorganizmalarn zolasyonu ve Antimikrobiyal Aktivitelerinin Aratrlmas, Yksek Lisans Tezi. Ege niversitesi zmir Phongpaichit, S., Rungjindamai, N., Rukachaisirikul, V. and Sakayaroj, J., 2006, Antimicrobial activity in cultures of endophytic fungi isolated from Garcinia species. FEMS Immunology & Medical Microbiology, 48: 367372 Schulz, B. , Boyle, C. , Draeger, S. , Rmmert, A.K. and Krohn, K., 2002, Endophytic fungi: a source of novel secondary metabolites. Mycol. Res. 106, 9961004. Shahidi F. ve Alaalvar Trkiye Sreekanth, D., 2008, Secondary Metabolites From Endophytic Fungi: Isolation, Purification, Characterization and Bioassay. Doktora Tezi, University of Pune Hindistan Strobel A., 2003, Endophytes as sources of bioactive products, Microbes and Infection, 5, 535544. Strobel, G. A. and Daisy, B., 2003, Bioprospecting for microbial C., 2004, Fndk ve Fndk Yan rnlerinde Fitokimyasal Maddeler ve Biyoaktif Bileikler, Fndk Tantm Grubu, biologically active

endophytes and their natural products. Microbiol Mol Biol Rev 67, 491 502. Suryanarayanan, T.S., Thirunavukkarasu, N., Govindarajulu, M.B., Sasse, F., Jansen and Murali, T.S., 2009, Fungal endophytes and bioprospecting. Fungal Biol. Rev., 23: 9-19 Tejesvi, M.V., Nalini, M.S., Mahesh, B., Prakash, H.S., Kini, K.R., Shetty, H.S. and Subbiah, V., 2007, New hopes from endophytic fungal secondary metabolites, Boletn de la Sociedad Qumica de Mxico 1(1):1926

102

KAYNAKLAR DZN (devam)

rgen, M., Kocaba, F., Nalbantsoy, A., Hame Kocabas, E.E., Uzel A. and Bedir, E., 2010, Bioassay-guided Isolation of Antibacterial and Cytotoxic Compounds from the Mesophilic Actinomycete M-33-5, Natural Product Communications, 5: 2, 249-252. Vatcharin, R., Ubonta, S., Souwalak, P. and Jariya S., 2008, Metabolites from the endophytic fungus Phomopsis sp. PSU-D15. Phytochemistry., 69: 783-787. Yu, H., Zhang, L., Li, L., Zheng, C., Guo, L., Li, W., Sun, P. and Qin, L., 2010, Recent developments and future prospects of antimicrobial metabolites produced by endophytes. Microbiol Res 165(6):437449 Zhou, X., Wang, Z., Jiang, K., Wei, Y., Lin, J., Sun, X., and Tang, K., 2007, Screening of Taxol-Producing Endophytic Fungi from Taxus chinensis var. mairei, Biochemistry and Microbiology, Vol. 43, No. 4, pp. 439443

103

ZGEM

sim: EREF AKAY

Meslei: Biyomhendis

Doum Tarihi: 20/08/1982 Cinsiyet: Erkek Src Belgesi: B

Doum Yeri:Nusaybin/Mardin Medeni Hali: Bekr Askerlik Durumu: Yapm

Adres: Ballkuyu Cad. 1047 sok No: 34/2 Konak ZMR Telefon: +90 2324467086, +90 535 450 29 39 E-mail: akayseref@gmail.com ETM: Ege niversitesi Fen Bilimler Enstits Biyomhendislik ABD Yksek Lisans (2008/-) Ege niversitesi Mhendislik Fakltesi Biyomhendislik Blm Lisans (2000/2005) Balkesir Lisesi (1997/2000)

DENEYMLER: Aratrma Grevlisi Ege niversitesi Mhendislik Fakltesi Biyomhendislik Blm (05/2010-) Aratrma Grevlisi Gmhane niversitesi Mhendislik Fakltesi Biyomhendislik Blm (09/2010-05/2011) Ar-Ge/Proje Mhendisi; Bionorm Doal rnler San. Tic. Ltd.ti. zmir (01/2008-09/2010) Teknik Servis efi- Dollvet Veteriner A la Biyolojik Madde retimi Sanayi ve Ticaret A.. anlurfa (08/2005 -11/2006)

104

ETMLER:

Salerno niversitesi Farmastik ve Biyomedikal Bilimler Blm (talya) Yksek Lisans Aratrma (YK bursu) 20/09-10/12/2011

CHRIST Gmbh Germany 24-28.07.2006 Freeze Dryer Operator Sertifikas Liyofilizasyon Makinesinin Kullanm ve Teknik bakm sertifikas Tarm ve Ky leri Bakanl ap Enstits 24.01.2006 - 24.03.2006 ap as retimi, btn birimler.

AKADEMK ALIMALAR: Yaynlar; Effects of process parameters on supercritical CO2 extraction of total phenols from strawberry (Arbutus unedo L.) fruits: An optimization study". Journal Of Separation Science, 34- 15 p1925-1931, 2011 Posterler; Secondary Metabolites from Phomopsis amygdali, an Endophytic Fungus Isolated from Hazelnut (Corylus avellana) - 59th International Congress and Annual Meeting of the Society for Medicinal Plant and Natural Product Research 4-9 September 2011 Antalya Turkey The Effect of Different Irrigation Levels on The Oleuropein Contents of Olive Tree (Olea Europaea L. Cv. Memecik) in The Western Coastal Region in Turkey. Medicinal And Aromatic Plants in Generating Of New Values in 21st Century 9-12. November 2011 in Sarajevo, Bosnia and Herzegovina