Institutionen fr fysik, kemi och biologi

Examenarbete

Alternativ splicing i mnsklig sjukdom

Joel Edin Examensarbetet utfrt vid IFM Biologi Datum 31/5
LITH-IFM-G-EX--10/2325SE

Linkpings universitet Institutionen fr fysik, kemi och biologi 581 83 Linkping

Avdelning, Institution Biologi, IFM Division, Department Biology, IFM

Datum Date 31/5 - 2010

Sprk Language X Svenska/Swedish Engelska/English ________________

Rapporttyp Report category Licentiatavhandling Examensarbete x C-uppsats D-uppsats vrig rapport

ISBN __________________________________________________ ISRN __________________________________________________

Serietitel och serienummer Title of series, numbering

ISSN

_______________

URL fr elektronisk version

LITH-IFM-G-Ex10/ 2325--SE

Titel Title

Alternativ splicing i mnsklig sjukdom Alternative splicing in human disease

Frfattare Author

Joel Edin
Sammanfattning Abstract

Exons are the sequences in DNA that hold the code for proteins in humans and all other organisms. Introns fill the space between exons and hold non-coding sequences and control elements. Exons from a particular gene do not always have to be included in the final mRNA, this allows for one gene to code for more than one mRNA. Therefore more than one protein can be created from one gene. Alternative splicing is a fast growing field and the importance of this process in disease has become apparent. This paper reviews articles and research about many of these diseases. New research of the importance of alternative splicing in the diseases is the focus. Diseases that are reviewed are cystic fibrosis, inherited frontotemporal dementia, systemic lupus erythematosus, aniridia, myotonic dystrophy, amyotrophic lateral scleros and familial dysautonomia. All these diseases have involvement of alternative splicing. The genetic processes that affect them are different though and show that the alternative splicing of involved proteins can affect the cell or organism in many different ways. The goal of the paper is to give a good view over current progress of research in the field.

Nyckelord Keyword

alternative splicing, splicing, alternativ splicing, ALS, demens, SLE, aniridi, familial dysautonomia, cystisk fibros, cystic fibrosis, mutation, sjukdom

Abstrakt ...................................................................................................................................................... 4 Introduktion: ............................................................................................................................................... 4 Metod: ........................................................................................................................................................ 7 Resultat ....................................................................................................................................................... 9 Cystisk Fibros ......................................................................................................................................... 9 CF transmembrane conductance regulator (CFTR) ................................................................................. 9 rftlig frontotemporal demens .............................................................................................................. 10 Microtubule-associated protein tau ....................................................................................................... 11 Systemisk lupus erythematosus............................................................................................................. 11 CD72..................................................................................................................................................... 11 Aniridi................................................................................................................................................... 12 PAX-6 ................................................................................................................................................... 12 Myotonisk dystrofi ................................................................................................................................ 12 DM protein kinase ................................................................................................................................ 14 Amyotrophic Lateral Scleros ................................................................................................................ 14 SLC1A2 ................................................................................................................................................ 15 SOD1 .................................................................................................................................................... 15 TARDBP (TDP-43) .............................................................................................................................. 16 Familial dysautonomia .......................................................................................................................... 16 IkappaB kinase complex-associated protein ......................................................................................... 17 Medicinska framsteg och alternativ splicing. ........................................................................................ 17 Diskussion ................................................................................................................................................ 18 Referenser ................................................................................................................................................. 19

Sammanfattning Exoner r de sekvenser i DNA vilka rymmer koden fr proteiner i mnniskan och i alla andra organismer. Intronerna, vilka utgr utrymmet mellan exoner, bestr av ickekodande sekvenser och kontrollelement. Exoner tillhrande en gen mste inte alltid inkluderas i den slutliga mRNA produkten, alternativ splicing tillter exkludering av vissa sekvenser och gr att en gen kan ha mer n en mRNA produkt, drigenom kan en gen koda fr flera olika proteiner. Alternativ splicing r ett flt som snabbt utvecklas och dess relevans fr mnga sjukdomar har blivit uppenbar. Detta arbete gr igenom ett flertal av dessa sjukdomar fr att sammanstlla ny forskning och tydliggra rollen av alternativ splicing i dem. De sjukdomar som underskts r cystisk fibros, rftlig frontotemporal dementia, systemisk lupus erythematosus, aniridi, myotonisk dystrofi, amyotrophic lateral sclerosoch familial dysautonomia. Dessa sjukdomar har involvering av alternativ splicing, de genetiska processerna bakom dem r dock mycket olika och kan visa p de mnga stt alternativ splicing kan pverka cell och kroppsfunktion. Mlet med arbetet r en versiktlig bild av framstegen som gjorts och vilken forskning som nu bedrivs. Introduktion: Splicing r frndringar av sekvenser, mer specifikt om-arangering av exoner p RNA niv vilket frndrar pre-mRNA till mRNA i denna process tas ickekodande regioner av baser (introner) bort och kodande regioner(exoner) behlls. Alternativ splicing r cellens frmga att reglera om en exon skall tas bort eller inkluderas i en gen. Detta gr det mjligt att med samma stycke DNA koda fr flera olika proteiner(Black D. L. 2003). I varje intron finns en 5 splicesite och en 3 splice region. I 3 regionen finns tre konserverade sekvenselement: frgreningspunkten fljd av ett polypyrimidin omrde, och i slutet ett terminalt AG. Splicing utfrs i huvudsak av spliceosomen (vissa sjlv-splicande sekvenser r undantag frn detta). Spliceosomen r ett stort makromolekylkomplex vilket ansamlas vid dessa sekvenser och katalyserar splicingen. Processen som sker vid splicing frklaras i texten och fig1 nedan.

Figur 1. Splicing av en intron mellan 2 exoner. Under denna process utfrs tv transesterifieringssteg. Under det frsta steget attackerar en A nukleotid i frgreningspunkten en fosfat i 5 splice site. Detta leder till lsgrning av 5 exonen frn 5 splice-siten och i samband med detta inbindning av 5 nden av intronen till frgreningspunktens 2 hydroxylgrupp. De tv produkterna av detta steg, 5 exonen och lariatform-intronen bunden till 3 exonen ligger kvar i spliceosomen efter detta. Nsta transesterifieringssteg bestr av en attack av den fria exonens 3 hydroxylgrupp mot fosfatet i 3 nden av intronen. Detta steg ligerar de tv exonerna och frigr intronen i lariatform (en gla, se fig1). Samma process kan utfras mellan splicing-siter i olika nrliggande introner vilket leder till att exonerna mellan dessa fljer med de borttagna intronerna (Fig.2). Nya splicing-siter kan uppkomma genom mutation och ven frndring av balans mellan tvsplicing varianter kan pverkas av mutationer.

Figur 2. Exempel p alternativ splicing, i detta fall exkludering av exon b som fljd av anvndning av en 5 splicesite i en uppstrms intron. Nya splice-siter kan uppst bde i intronen vilket kan orsaka inkludering av en del av intronen i mRNA. Splice-siter kan ven uppkomma i en exon och drigenom orsaka en delvis exkludering av denna exon. I gener finns element som kan frndra med vilken frekvens vissa exoner inkluderas eller exkluderas. Dessa element kallas exonic splicing enhancers och exonic splicing silencers. Exonic splicing enhancers r lokaliserade i en exon och aktiverar nrliggande splice-siter med fljden att de kar inkluderingsfrekvensen fr just denna exon (Blencowe B. J. 2000). I fallet med exonic splicing silencers r det motsatta sant, dessa sekvenser tystar nrliggande splice-siter och orsakar kad exkludering av exonet i vilken sekvensen ligger (Wang et al. 2004). SR-proteiner r nuklera fosfoproteiner vilka innehller en eller tv sekvensigenknnade regioner (Van der Houven et al. 2000). Dessa proteiner kan dirigera splicingmaskineriet till en specifik splicesite och r drigenom ett viktigt element i splicing, alternativ eller ej. I svl djur som vxter har alternativ splicing stor betydelse fr hur mnga aminosyresekvenser som kan lagras. I det mnskliga genomet har en mycket hg andel gener alternativ splicing. Minst 74 % av mnniskans multiexon gener genomgr alternativ splicing (Johnson J. M. et al. 2003). D denna process r en viktig del i proteintillverkningen hos mnniskor r den intressant att underska. Framfrallt de eventuella fel som kan uppst under frloppet och vilka konsekvenser de har r fokus fr mnga studier. Ett flertal sjukdomar har visats vara orsakade eller, i ngon mn, pverkade av alternativ splicing. I denna text kommer bde sjukdomarna och de gener som pverkar eller orsakar dem att diskuteras.
6

Sjukdomar med genetisk orsak diskuteras i de fall det handlar om alternativ splicing frndringar i splicing kan dock ske p grund av andra mutationer. Som fljd av detta kommer ven punktmutationer vilka orsakar frndrat uttryck av gener diskuteras. Varje sjukdom beskrivs med symptom, utveckling av sjukdomen och behandlingsmetoder tas upp i ett separat kapitel. Ansvariga genetiska processer identifieras och ansvariga gener undersks i detalj. Mutationer som frndrar hur en gens splicing sker kan upptrda p en serie olika punkter i ledet vilket kommer att visas. Splicingmaskineriet kan f skador eller frndringar som leder till frndringar i splicing av en gen. Punktmutationer kan upptrda i genen i frga vilket frndrar hur den splicas och delar av genen kan frstras och ge en produkt vilken saknar en eller flera exoner.

Metod: Under arbetet med att samla in och sammanstlla informationen i denna artikel har ett flertal olika skverktyg anvnts. Det frsta steget var att finna lmpliga sjukdomar att frdjupa arbetet om, detta skedde genom att g igenom andra review artiklar ssom Alternative splicing and disease (Kim et al. 2008), The splice of life: Alternative splicing and neurological disease (Dredge et al. 2001) och genom generella skningar p pubmed och Google scholar, skord som anvnts visas i Tabell 1. Information om de specifika proteinerna har funnits via referenser i artiklar om sjukdomarna och genom flitigt anvndande av UniProts databas p www.uniprot.org.

Tabell 1. Urval av viktiga skord som anvnts: Dessa var de frsta skord som anvndes fr att finna information ven frfattarnamn har anvnts som skord fr att finna forskning relaterad till de arbeten som funnits relevanta.
Skning gjord I startskedet av arbetet Skord Alternative splicing disease Alternative splicing Alternative splicing medicine Alternative splicing ALS ALS Alternative splicing SLE Cystic fibrosis CFTR CF transmembrane conductance regulator Systemisk lupus erythematosus Splicing SLE Splicing ALS Parkinsonism Parkinsons Alzheimers Glaucoma Muscular dystrophy Inherited frontotemporal dementia Frontotemporal lobar degeneration Aniridi myotonic dystrophy Pax-6 TARDBP TDP-43 SLC1A2 EAAT-2 IkappaB kinase complex-associated protein IKBKAP

Efter genomgng av review artiklar

Efter genomgng av sjukdomsspecifika artiklar

Resultat Cystisk Fibros Cystisk fibros (CF) orsakas av mutationer i CF transmembrane conductance regulator (CFTR) genen. Sjukdomen r den vanligaste autosomala recessiva sjukdomen hos vsteuropeer (Bayleran et al.1996). CF r en systemisk sjukdom vilken orsakar nedsatt eller felaktig funktion av lungor, lever, njurar, tarmkanal och bukspottkrtel (Quinton P. M. 2007). Problem med exokrina krtlar orsakar verfldig tillverkning av slem vilket ger en serie fljdproblem som andningssvrigheter och kad risk fr infektion. Medellivslngd fr patienter med CF r betydligt kortare n friska individer. Frndringarna i CFTR som kan orsaka cystisk fibros r flera och har olika verkningsstt. Den vanligaste mutationen i cystisk fibros r en aminosyra deletion vid position 508 d en phenylalanin frsvinner vilket orsakar frlust av CFTR funktion. Flera typer av alternativ splicing kan ocks orsaka varianter av sjukdomen.

CF transmembrane conductance regulator (CFTR) CFTR kallas ven Channel conductance-controlling ATPase eller ATP-binding cassette subfamily C member 7. Isoform 1 av detta protein vilket i databaser behandlas som normalversionen r 1480 aminosyror lng (Figur 3). Tv andra isoformer r knda och dessa r involverade i sjukdomstillstnd. Isoform 2 r 1419 aminosyror lng och ptrffas i bilateral avsaknad av vas deferens, vilket r ett genetiskt nrbeslktat tillstnd till cystisk fibros som innebr avsaknad av sdesledare (Mercier et al. 1995). Isoform 3 r 604 aminosyror lng och anses orsaka cystisk fibros (Aznares et al. 2003). CFTR r en fosforylerings-beroende kloridkanal vilken aktiveras av cAMP agonister. Till en brjan placerades CFTR i familjen ABC-transportrer och ansgs ej vara en Cl- kanal. Det har dock vistats att proteinet r en apikal membran Cl- kanal genom att uttrycka CFTR i HeLa och CHO celler, vilka ursprungligen saknar Cl- kanaler (Anderson et al 1991). Vissa patienter har mnga symptom typiska fr Cystisk fibros men saknar frndrade kloridvrden i svett. Dessa patienter r svrare att ge en korrekt diagnos och har inte den typiska frndringen av CFTR genen (Highsmith et al. 1994).

Figur 3. Freslagen struktur av CFTR i cellmembran (Sheppard och Welsh 1999). De olika mutationerna som kan orsaka Cystisk fibros pverkar olika delar av detta protein och kan frsmra dess funktion. Den vanligaste mutationen r en phenylalanin frlust nra mitten av proteinet. Andra fel som kan ske r en frlust av exon 9 nra mitten av proteinet och frlust av den C-terminala delen. CFTR har underskts i patienter som stmmer p denna beskrivning och i mnga av fallen har en C->T substitution i intron 19 funnits. Denna mutation skapar en delvis aktiv alternativ splice-site vilken orsakar inklusion av en 84 baspar lng sekvens som i vanliga fall hade rknats som introniskt material vilket innehller ett stop kodon. Detta stop kodon kommer i och med inklusionen att finnas med i mRNA sekvensen mellan intron 19 och 20. Fljden blir att translation avbryts vid denna inklusion och frlust av exon 20 sker. Enbart 8 % normalt mRNA uttrycks i patienter med denna genotyp. rftlig frontotemporal demens Frontotemporal lobar degenerering eller Frontotemporal dementia (FTD) r grupp demensformer skiljda frn sjukdomen Alhzeimers. Dessa kopplas till lokaliserad progressiv degenerering i temporal och frontallober. Sjukdomen har olika uttryck beroende p vilka delar av hjrnan som drabbas frst och kan innefatta stumhet och progressiv apati vid frontal-lobs involvering. Om skadorna brjar i frmre delen av temporal neocortex r de frsta symptomen istllet semantisk demens och frsmrad frmga att knna igen ansikten och freml (Pickering-Brown et al. 2002). Temporal neocortex r det yttersta lagret av hjrnan vid temporalloberna, detta omrde r viktigt fr socialt beteende hos primater (Franzen and Myers 1973). En stor fraktion av patienter med FTD har visats ha ett sjukdomsorsakande lokus p kromosom 17, denna typ av sjukdomen
10

kallas frontotemporal dementia with parkinsonism linked to chromosome 17 (FTDP-17). Genen har lokaliserats till 17q21-22. Den gen som r ansvarig r Microtubule-associated protein tau (MAPT). I 5 splice-siten kopplad till exon 10 (i intronen angrnsande denna) av denna gen har missense mutationer kunnat kopplas till uppkomst av sjukdomen (Hutton et al. 1998). Totalt har nio missense mutationer, en deletion och tv transition mutationer funnits i exon 9,10, 12 och 13 (Reed et al. 2001). Fem olika intronmutationer i 5 splice siten till exon 10 har funnits. En mutation som identifierats ligger +13 frn 5 splice siten en annan vid +16 (Pickering-Brown et al. 2002). Denna region reglerar splicing av exon 10 genom en stem-loop mekanism. Frndringen i splice-siten tros orsaka ett kat uttryck av TAU protein innehllande exon 10 vilket innehller fyra microtubuli bindande repeats.

Microtubule-associated protein tau MAPT frbttrar microtubul stabilitet och kan mjligtvis ven ha effekt p neuronal polaritet (Maccioni and Cambiazo 1995). C terminala delen av proteinet binder till microtobuli i axon och N-terminus binder till plasmamembrankomponenter vilket tyder p att MAPT fungerar som ett lnk protein mellan dem. MAPT r inte enbart involverad i FTDP-17, ven i Alzheimers finns en koppling till detta protein. Vid Alzheimers strs cytoskelettet i hjrnan och en del i detta skeende r parade helixfilament bestende av hyper-fosforylerad Tau (Wille et al 1994). Detta r en lng kedja av motsatta tau proteiner.

Systemisk lupus erythematosus SLE r en multisystem sjukdom vilken kan orsaka mnga symptom s som thrombocytopenia, discoid rash, neurologiska problem (psykos och krampanfall) och hemolytisk anemi (Tsao et al. 2002). T celler i SLE patienter kan inte reglera felaktiga autoimmunsvar som sker i patienter. T cell receptor kedjan CD3 uttrycks i lgre niver i dessa patienter n i friska individer vilket frsmrar intracellulr signal verfring (Moulton et al 2009). T cellerna har frndrad splicing av CD3 mRNA. Den alternativt splicade varianten av genen saknar 562 nukleotider i 3 UTR och detta leder till att RNAt inte kan producera normal niv av CD3 . Minskningen av CD3 sker troligen genom att serine/arginine-rik (SR) protein alternativ splicing faktor/ splicing faktor 2 (ASF/SF2) frlorat sin inbindningssekvens. ASF/SF2 knockdown har visats orsaka minskat proteinuttryck av CD3 . Den kortare varianten av av CD3 mRNA r ocks mindre stabil n normalvarianten vilket i sig kan leda till minskat proteinuttryck. CD72 B-cell differentierings antigen CD72 r inblandat i B-cells proliferation och differentiering (Kumanogoh et al. 2005). CD72 genen har tminstone 4 polymorfismer vilka kan delas in i tv huvudsakliga haplotyper beroende p om de innehller en eller tv upprepningar av 13 nukleotider i intron 8 (Hitomi et al. 2004). Den andra av dessa haplotyper har en kraftigt kad niv av alternativt splicad CD72. Den alternativt splicade varianten saknar exon8. FCGR2B11

Ile232Thr r en polymorfism i B-cells inhibitoriska receptorn FCGR2B (Kono et al. 2005). Denna polymorfism r associerad med SLE om den upptrder i samband med tv kopior av haplotyp1 CD72 men ej i nrvaro av haplotyp2. Detta kan tyda p att CD72 haplotyp 2 skyddar mot SLE genom att genomg alternativ splicing. Aniridi Aniridi innebr avsaknad av iris och r namnet p en semidominant genetisk sjukdom som orsakar strd utveckling av iris, lins, hornhinna och nthinna (Glasner et al. 1992). Fr att hitta genen ansvarig fr aniridi och fr att frst mekanismerna bakom sjukdomen har mss med mutationen Small Eye (Sey) anvnts d symptomen r snarlika. Sey orsakas av fel i genen Vertebrate Pax protein 6 (Paired box protein Pax-6: Pax6) vilket har lett till underskningar av denna gen i mnniskor. Den mnskliga motsvarigheten till musens Pax6 har isolerats och det visades att patienter med aniridi har frndringar p DNA och RNA niv vid denna gen (Jordan et al. 1992). Det har visats att sjukdomen orsakas av en mutation i genen Pax6, fljderna av denna mutation r frndrad alternativ splicing (Epstein et al. 1994, Glasner et al. 1992). I normalt fungerande Pax6, och i vriga pax proteiner, finns en konserverad 128 aminosyror lng DNA-bindande sekvens kallad paired region vilken interagerar med DNA i sin aminoterminala nde (Epstein et al. 1994). Muterad Pax 6 har en T->C substitution vid -3 positionen av dess alternativa splicing acceptor. Mutationen frndrar affiniteten fr denna splice site och kar den alternativa splicingen av Pax-6 pre-mRNA. Den alternativa splicing-produkten kodar fr ett protein med en 14 aminosyror lng insertion i paired region vilket leder i frndringar i proteinets DNA bindande frmga. Istllet fr att binda till DNA med den aminoterminala regionen kan den alternativa produkten binda in med den C-terminala paired domnen vilket leder till aniridi. PAX-6 PAX-6 r genen som kodar fr Paired box protein Pax-6 (Pax6). Det r ett homeobox protein och innehller frutom homebox regionen en paired domain/paired region (Epstein et al. 1994). Bda dessa sekvenser kodar fr DNA bindande regioner. Ett flertal gonsjukdomar r frknippade med fel i PAX6, de flesta av dessa orsakas av missense mutationer i paired domain s som i Aniridi (DElia et al. 2006). Enstaka fall av gonsjukdom som fljd av mutation i homeoboxen har identifierats och kan mjligtvis frknippas med minskad mjlighet till nedbrytning av Pax6 i vvnaden. Myotonisk dystrofi Myotonisk Dystrofi typ 1 och 2 (DM1 och DM2/proximal myopathy PROMM) r dominanta genetiska sjukdomar med multisystemisk pverkan (Day et al. 2003). Sjukdomen r relativt vanlig med en frekvens av 1/8000 (Aslanidis et al. 1992). DM2/PROMM orsakas av en CCTG expansion i intron 1 av zinkfingerprotein 9 (ZFN9). Symptom innefattar myotonia, muskulr dystrofi, cataract, diabetes, testikel skador, hypogammaglobulinemia och neurologiska hjrtfel. En viktig skillnad frn DM1 r avsaknaden av en foster eller spdbarnsvariant av sjukdomen. Hjrtproblem vid Myotonisk dystrofi r vanliga (Die-Smulders et al. 1998, Sovari AA, Dudley SC Jr.2008). Frsta gradens hjrtblock r den vanligaste defekten men ven frmaksflimmer och
12

andra typer av arytmi kan uppkomma. Ventrikulr arrytmia och hjrtblock r troliga kandidater fr att orsaka pltsliga ddsfall i denna patientgrupp (Harper och Monckton 2004). Studier har visat p att patienter med tidigt inopererad pacemaker har en bttre sjukdomsbild n vriga (Lazarus et al. 2002). Problem med glatt muskulatur ger fljder i magtarmsystemet (Rnnblom et al. 1996). Hos barn kan det orsaka tarmsmrta, spastic colon och abnormaliteter i sphinkterfunktion. Hos vuxna individer r problemen mer framtrdande i de vre delarna av magtarmsystemet. Svljreflex fungerar inte korrekt med frdrjd avslappning i muskeln runt hyoidbenet och peristalsis i matstrupen r ofta abnormal. Tarmrrelser r reducerade i jmfrelse med friska individer. I testiklar sker tubulr degradering medan leidigceller frblir relativt oskadda vilket innebr liten verkan p endokrin funktion (Harper et al. 1972, Vazquez et al 1990). Patienter har en frhjd niv gonadotrofiska hormoner, speciellt follicle stimulating hormone (Harper och Monckton 2004). Bde Leutinizing hormone och FSH har kade koncentrationer i DM patienter. Myotonisk dystropfi typ 1 (DM1) orsakas av en defekt i DM protein kinase (DMPK) genen. I 3 nden av genen som kodar fr detta protein har patienter med DM1 en CTG (CUG) trinucleotid expansion (Savkur et al. 2001)i ett instabilt omrde (Aslanidis et al. 1992). CTG repeat omrdet i DMPK r variabelt i den mnskliga populationen och varierar frn 4 till 40 repetitioner. I personer av vsteuropeisk ursprung finns tre toppar i repeatlngd. Den vanligaste repeatlngden r 5 repeats men ven 11-14 repetitioner r vanligt, 19 repeats eller fler r relativt ovanligt (Deka et al. 1996). En repeatlngd p mer n 20 har visats ha en tydlig korrelation med sjukdomen. Personer som har DM1 har en ovanlig form av insulinresistans (Savkur et al. 2001). Detta kommer av en felaktig reglering av alternativ splicing i insulinreceptor pre-mRNA vilket leder till vervgande uttryck av den lgsignalerande ickemuskel isoformen (IR-A). Denna isoform r den mest utryckta ven i skelettmuskulatur i DM1 kulturer. Det r troligt att regleringen av denna frndring sker via CUG-Binding Protein (CUG-BP) som kan orsaka byte till uttryck av IR-A genom ett introniskt kontrollelement uppstrms frn den alternativt splicade exon 11. Modelldjur har anvnts fr att identifiera vilka eller vilket fljdfel det r som orsakar sjukdomen. Nr en CTG expansion existerar i DMPK s kommer transkripten av detta att bibehllas i krnan och fljaktligen minskar niverna av DMPK proteinet i cellen (Davis et al. 1997). Expansionen orsakar ven en kromatinfrndring och tystande av en nrliggande gen SIX5 vilket r en transkriptionsfaktor (Thornton et al. 1997). Knockoutmss har anvnts fr att underska vad frndringar i dessa proteiners niver orsakar. Knockout av DMPK ger svagare skelettmuskler och abnormal hjrtkonduktans (Reddy et al 1996, Berul et al. 1999). SIX5 knockout mss har kad risk fr katarakter (Klesert et al 2000). Ingen av dessa mustyper har dock uppvisat myotonia, och enbart sent utvecklad progressiv myopati, vilket skiljer dessa frn individer med DM. D symptomen hos dessa tv typer av knockoutmss ej stmmer med symptomen i mnniskan kan det antingen innebra olika proteinfunktioner mellan raserna eller att expansionen har ytterligare funktioner. Fr att underska om sjukdomen r grundad i sjlva repeatfrlngningen i transkriptet har transgena mss med CUG expansioner i orelaterat mRNA tagits fram. Dessa mss har uppvisat bde myotonia och myopati (Mankodi et al. 2000). Detta innebr att frndringen troligtvis r en
13

toxisk gain funktion mutation. Det har visats att Muscleblind like protein (MBNL) bildar foci i DM1 celler till skillnad frn i friska celler (Fardaei et al. 2001). Sambandet mellan MBLP1, 2 och 3 har underskts och MBNL1 och 2 har visats bilda foci med frlngda repetitioner (Holt et al. 2009). Anledningen till att avsaknad av enbart MBNL kan orsaka DM symptom kan vara detta proteins dominans i mogen skelett och hjrtmuskulatur. CUG expansionerna i DM1 har visats pverka reglering av alternativ splicing genom inbindning till CUG-BP vilket i sin tur ger effekter p alternativ splicing i humant cardiac troponin i skelett och hjrtmuskulatur (Philips et al. 1998). Som fljd av insikten att det r de frlngda repetitionerna som orsakar sjukdomen har nya mediciner kommit p frslag, dessa riktar sig till att hindra C/CUG frn inbindning till CUGBP och eventuella andra proteiner med potentiell inbindningsfrmga till denna sekvens (Mulders et al. 2010). Substanserna som idag undersks r antisense oligonukleotider, vilka kan binda C/CUG och blockera annan inbindning, eller sm organiska molekyler som frhindrar interaktion mellan protein och C/CUG hairpinstrukturer.

DM protein kinase DMPK r ett 639 aminosyror lngt multidomn protein kinas vilket krvs fr korrekt hjrt konduktivitet och sammandragningar av hjrtmuskeln (Bush et al. 2000, Kaliman et al. 2005). Proteinet fosforylerar phospholamban ett membranprotein i hjrtceller vilket r involverat i reglering av Ca2+ transport ver det sarkoplasmatiska retikulumet (Frank och Kranias 2000)(Bush et al. 2000). En serie isoformer r knda, tv av dessa r knda fr att uttryckas i muskelceller, DMPK1 r en lng isoform och den primra transkriptionsprodukten. DMPK2 r en kortare isoform vilken kan tillverkas genom proteolytisk klyvning av DMPK1 nra dess Cterminal. Den kortare formen av proteinet r trefaldigt mer aktivt n den primra transkriptionsprodukten. Amyotrophic Lateral Scleros Amyotrophic Lateral Scleros (ALS) ger frsmrat terupptag av synaptiskt glutamat som fljd av fel i Excitatory amino acid transporter 2 (EAAT2). EAAT2 uttrycks i stort sett uteslutande i hjrnvvnad till skillnad frn EAAT1 och EAAT3 vilka r nrbeslktade glutamattransportrar vilka ven utrycks i andra vvnader. ALS uppstr vid nedsatt funktion av proteinet Excitatory amino acid transporter 2 d detta orsakar hjd synaptisk extracellulr glutamatkoncentration (Couratier et al. 1993). I ALS r mngden Excitatory amino acid transporter 2 i astrogliaceller nedsatt med 30-95% (Lin et al. 1998).

14

Tabell 2. Typer av ALS och bakomliggande mutationer.

ALS typ: ALS(1) ALS(2) ALS(3) ALS(4) ALS(5) ALS(6) ALS(7) ALS(8) ALS(9) ALS(10) ALS(11) Orsakas av mutation i: SOD1(superoxide dismutase-1 coding) ALS2 gene(alsin coding) loci 18q21 SETX gene(senataxin coding) loci 15q15-q21.1 FUS gene loci 20p13 VAPB ANG(angiogenin coding) TARDBP(TDP-43 coding) FIG4(SAC domain-containing inositol phosfatase 3 coding) Locus: 21q22.1 2q33 18q21 9q34 15q15-q21.1 16p11.2 20p13 20q13.3 14q11.2 1p36.2 6q21

SLC1A2 SLC1A2 kodar fr proteinet Excitatory amino acid transporter 2. Kanalen r en natrium synport vilken transporterar glutamat frn den synapsiska klyftan tillbak in i axonet (Shigeri et al. 2004). Isoform 1 har 574 aminosyror medan isoform 2 har 565 aminosyror (saknar 9 av de aminosyror som finns i isoform 1). Alternativ splicing av detta protein har visats ge ytterligare 2 isoformer vilka kallas EAAT2-C1 och EAAT2-C2. EAAT2-C1 saknar proteinkodande exon 8, sektionen som splicas bort bestr av 45 aminosyror C-terminalt (Meyer et al. 1998). EAAT2-C2 tillverkas genom anvndande av tv interna splicesiter i exon 5 och 6 vilket orsakar frlust av 107 aminosyror i mitten av proteinet. Tabell 3. Tv alternativt splicade varianter av SLCA2/EAAT2 (Meyer et al.1998).
Traskript: EAAT2-C1 EAAT2-Cs Position: 1320-1454 791-1111 Splicade exoner: CDS8 CDS5(pt) CDS6(pt) Splicing typ Cassette exon Intern splice site Aminosyre positioner 431-474 253-356 Antal aminosyror 45 107

Alternativa splice-varianter har rapporterats vara en trolig orsak till ALS, detta har bestridits i senare artiklar. Alternativt splicad SLC1A har dock visats vara uppreglerad i ALS patienter jmfrt med friska individer. Vissa av de uppreglerade splice-varianterna har visats ha ett dominant/negativt frhllande till normalt splicad SLC1A vilket kan innebra att en liten frndring i frhllande ger en stor frndring i funktion. SOD1 Muterat superoxide dismutase-1 har visats orsaka ALS (1). Mekanismerna fr hur SOD1 kan orsaka ALS r inte helt knt men det finns ngra troliga modeller. Sambandet mellan SOD1 och nedreglering av EAAT2 i ALS (1) orsakas troligen av pverkan p Caspase-3. Caspase-3 kan klyva EAAT2 och drigenom orsaka frlust av dessa kanaler. Vid mutation i SOD1 associerat med ALS uppregleras Caspase-3 (Boston-Howes et al. 2006). Detta leder troligtvis till frlust av EAAT-2 och toxisk kning av glutamat i den synaptiska klyftan. Det har ven visats att muterad SOD1 kan bilda inkorrekta disulfidbryggor under mild oxidativ stress vilket leder till att tunga aggregat kan bildas (Niwa et al. 2007). Det orsakar ven ubiquitylering av SOD1 och drigenom
15

bidrar det till hastig degradering av proteinet. D pverkan av Caspase-3 p EAAT2 r en protein-protein interaktion s r denna form av sjukdomen av ringa intresse i denna text det r dock den vanligaste formen och beskrivs som kontrast till ALS 10 orsakad av TARDBP.

TARDBP (TDP-43) TDP-43 eller TAR DNA-binding protein r ett 414 aminosyror lngt protein vilket reglerar transkription och splicing. Proteinet binder till pyrimidinrika motiv i TAR DNA och enkelstrngar med TG repetitioner. Det binder ven till RNA med UG repetitioner lngre n 12 baser. Proteinet r nrvarande i all vvnad men r extra hgt uttryckt i bukspottkrteln, moderkakan, lungorna, knsorgan och njurarna. TBP-43 pverkar bland annat reglering av CFTR splicing (Buratti et al. 2001). TBP-43 kan orsaka exon 9 exlusion i CFTR genom inbindning till ett UG repeat motiv i den polymorfiska regionen nra 3-splice siten av den exonen. Fljden av den avvikande splicingen hos CFTR r associerad med symptom typiska fr cystisk fibros. Fel i TARDBP orsakar ALS typ 10. I individer med ALS som ej har fel i SOD1 har en lng serie underskningar utfrts. Nr TARBP genen screenades hos en serie individer med ALS upptcktes en mutation i exon 6 (Sreedharan et al. 2008). Mutationen orsakar en substitution av valin till metionin vid position 337. Andra studier har funnit samma mutation (Tamaoka et al 2010). Ett flertal andra mutationer i TARDBP har ocks ptrffats i ALS patienter.

Familial dysautonomia Familial dysautonomia (FD, ven knt som Riley-Day syndrome) r en sjukdom som pverkar det autonoma nervsystemet och sensoriska nerver. FD orsakas av mutationer i IkappaB kinase complex-associated protein (IKBKAP) genen. Tv olika mutationer i denna gen r knda fr att kunna orsaka sjukdomen. Sjukdomen frekommer i stort sett uteslutande hos Ashkenazi judar. I denna population r frekvensen fr sjukdomsanlaget 1/30(Lehavi et al. 2004) och frekvensen fr sjukdomen r 1 / 3600 levande fdslar (Slaugenhaupt et al. 2001). Sjukdomen har alltid ddlig utgng och enbart hlften av alla patienter lever till 30 rs lder. Patienter lider av symptom som minskad knsel och uppfattning av kyla/vrme, krkningar, instabilt blodtryck, mm. Symptomen uppkommer som fljd av en progressiv frlust av omyeliniserade sensoriska och autonoma neuron(Pearson et al 1978). Ddsfall i FD r ofta en fljd av cardiorespiratoriska problem. Hypoxia och hypercapnia i FD patienter leder ej till korrekt svar i cerebral cirkulation. Detta i sin tur ger hypotension bradycardia hypoventilation (nedsatt puls och andning som fljd av felaktig neurologisk reaktion) och kan potentiellt leda till andningsuppehll (Bernardi et al. 2003). Fr att identifiera omrdet i vilket genen som orsakar FD har forskare vid New York University Medical Center gjort en serie experiment och publicerat ett flertal rapporter.De har publicerat sitt arbete regelbundet i och med att de nrmat sig svaret. Frsta rapporten som publicerades uteslt en stor del av genomet som potentiell plats fr FD genen genom parvisa multipoint analyser av misstnkta regioner (Blumenfeld et al. 1993a). Efter detta identifierades region 9q31-q33 som platsen fr genen genom en linkage analys (Blumenfeld et al. 1993b). Denna region r 11cM,
16

den exakta platsen fr mutationen identifierades genom anvndning av nya markrer fr det intervallet och en sektion p mindre n 0,5cM kunde identifieras som platsen fr mutationen (Blumenfeld et al. 1999). Haplotypanalys anvndes fr att bekrfta att denna region var avvikande i FD. En huvudsaklig haplotyp fanns i 435 av 443 FD kromosomer. Tre andra haplotyper fanns i de vriga 6 kromosomerna. Tv av mutationerna som har funnits i IKBKAP har olika stt att pverka genens uttryck. Den huvudsakliga haplotypen har en mutation i donator splice-siten i intron 20 (Slaugenhaupt et al. 2001). Denna mutation orsakar exklusion av exon 20, ett visst uttryck av vildtyp protein kommer dock fortfarande ske. Den andra haplotypen har en missense mutation i exon 19 vilken tros frstra en fosforylerings-site. Den goda kunskapen om var mutationerna som leder till FD ligger i genomet gr att det nu finns en god basis till ett genetiskt test fr FD istllet som det var fram till 2000-talet en diagnos stlld enbart p symptom. Det gr ven att patienter som har atypiska symptom ltt kan f en korrekt diagnos och att man kan utesluta denna diagnos i patienter med andra liknande neuropatier. Frhoppningsvis kan kunskapen om vilka fel som sker p genom och mRNA niv ven bidra till framstllning av bttre mediciner. Arbetet som gjorts om denna sjukdom ger en serie goda fljder fr drabbade individer. IkappaB kinase complex-associated protein IKBKAP kodar fr det 1332 aminosyror lnga Elongator complex protein 1. Knda interaktioner r med Elongator complex protein 3 (Creppe et al. 2009), Huntingtin (Goehler et al. 2004), PreB-cell leukemia transcription factor 2 (Lehner et al. 2004) och Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 7. (Ninomiya-Tsuji et al. 1999). IKBKAP r en av sex subenheter i human elongation komplex (Hawkes et al. 2002). Detta komplex kan i sin sex subenhet form verka som histon acetyltransferas riktat mot H3 och H4. Elongator complex r involverat i tidig elongering i modellceller (HeLa-celler) och kan interagera direkt med RNA polymerase II i lsning. IKBKAPs involvering i transkription och elongering kan tyda p att FD r en fljd av fel i denna process.

Medicinska framsteg och alternativ splicing. Den kade kunskapen om mekanismerna bakom de sjukdomar som nmns i denna rapport ger nya mjligheter till utformning och testning av medicin fr dessa kommor. Inducerade pluripotenta stamceller med mutationen fr familial dysautonomia har anvnts bde fr att underska mekanismerna bakom sjukdomen men har ven freslagits som en bra modell fr utformning av mediciner (Lee et al. 2009). D det r felaktig splicing som orsakar sjukdomen kan cellnivmodeller anvndas som ett frsta steg i test av potentiella mediciner vilka riktas fr att normalisera processen. Nya typer av mediciner som kommer att riktas direkt mot de sekvenser som orsakar vissa av dessa sjukdomar r idag p frsksstadiet. Ett exempel r de antisense oligonukleotider som diskuteras i sektionen om myotonisk dystrofi.

17

Diskussion I de mnga sjukdomar som vi idag vet involverar alternativ splicing har inga direkta medicinska behandlingar uppkommit som tacklar denna sida av sjukdomarna. Dessa mediciner r dock p vg och kanske kommer vi inom ngra r ha vl fungerande medicin vilken riktas direkt mot orsaken till myotonisk dystrofi. Det som kunskapen praktiskt kan anvndas fr idag r bttre diagnostiska verktyg. Om sjukdomar diagnostiseras p DNA niv istllet fr genom symptom blir feldiagnostisering och felbehandling mindre troligt. Korrekt reglering av splicing r oerhrt viktigt fr ett fungerande system och mycket sm frndringar, ofta punktmutationer som i frontotemporal demens kan ha frdande konsekvenser fr individen. Som har visats med de sjukdomar nmnda i detta arbete s kan splicing stras p mnga olika niver. Vissa frndringar innebr att RNAt som innehar frndringen kommer att splicas p ett annat vis n normalt eller f frndrad balans mellan tv splicingformer s som i FTDP-17. Andra frndringar pverkar funktionen hos proteiner involverade i splicingmaskineriet och kan genom detta orsaka frndringar i de proteiner som translaterats frn felsplicade mRNA-molekyler. Ett exempel p detta r TBP-43s involvering i CFTR splicing i cystisk fibros. ven frndringar av niverna av proteiner i splicingmaskineriet kan frndra hur splicing sker och drigenom ge avvikande splicing. Fortsatt forskning p fltet kommer troligen finna mnga nya samband mellan avvikande splicing-mnster, mutationer och sjukdomar d de flesta upptckter av sdana samband har skett relativt nyligen. Fltet r fortfarande ungt och kunskapen om alternativ splicings relevans utvecklas varje r med stora kliv.

18

Referenser Anderson MP, Rich DP, Gregory RJ, Smith AE, Welsh MJ (1991) Generation of cAMPactivated chloride currents by expression of CFTR. Science. 251(4994). 679-82 Aslanidis C, Jansen G, Amemiya C, Shutler G, Mahadevan M., Tsilfidis C, Chen C, Alleman J, Wormskamp N G M, Vooijs M, Buxton J, Johnson K, Smeets H J M, Lennon G G, Carrano A V, Korneluk R G, Wieringa B and de Jong P J (1992) Cloning of the essential myotonic dystrophy region and mapping of the putative defect. Nature 355. 548 551 Aznarez I, Chan E M , Zielenski J, Blencowe B J, Tsui L-C (2003) Characterization of disease-associated mutations affecting an exonic splicing enhancer and two cryptic splice sites in exon 13 of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene. Hum. Mol. Genet. 12 (16). 2031-2040 Bayleran J K, Yan H, Hopper C A and Simpson E M (1996) Frequencies of cystic fibrosis mutations in the Maine population: high proportion of unknown alleles in individuals of FrenchCanadian ancestry. Hum. Genet. 98. 207-209 Bernardi L, Hilz M, Stemper B, Passino C, Welsch G and Axelrod F B (2003) Respiratory and Cerebrovascular Responses to Hypoxia and Hypercapnia in Familial Dysautonomia Am J Respir Crit Care Med. 167. 141-149, Black D. L. (2003) Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing Annu. Rev. Biochem. 72. 291336 Blencowe B. J. (2000) Exonic splicing enhancers: mechanism of action, diversity and role in human genetic diseases Trends Biochem. Sci. 25 (3) 106-110 Blumenfeld A, Axelrod FB, Trofatter JA, Maayan C, Lucente DE, Slaugenhaupt SA, Liebert CB, Ozelius LJ, Haines JL, Breakefield XO, et al. (1993a) Exclusion of familial dysautonomia from more than 60% of the genome. J Med Genet 30. 4752 Blumenfeld A., Slaugenhaupt S A, Axelrod F B, Lucente D E, Maayan C, Liebert C B, Ozelius L J, Trofatter J A, Haines J L, Breakefield X O & Gusella J F (1993b) Localization of the gene for familial dysautonomia on chromosome 9 and definition of DNA markers for genetic diagnosis. Nat. Genet. 4. 160164 Blumenfeld A., Slaugenhaupt S A, Liebert C B, Temper V, Maayan C, Gill S, Lucente D E, Idelson M, MacCormack K, Monahan M A, Mull J, Leyne M, Mendillo M, Schiripo T, Mishori E, Breakefield X, Axelrod F B, and Gusella J F (1999)Precise Genetic Mapping and Haplotype Analysis of the Familial Dysautonomia Gene on Human Chromosome 9q31 Am. J. Hum. Genet. 64. 11101118,
19

Boston-Howes W, Gibb S L, Williams E O, Pasinelli P, Brown R H Jr., Trotti D (2006) Caspase-3 Cleaves and Inactivates the Glutamate Transporter EAAT2 J. Bio. Chem. 281. 1407614084. Buratti E, Drk T, Zuccato E, Pagani F, Romano M, and Baralle F E (2001) Nuclear factor TDP-43 and SR proteins promote in vitro and in vivo CFTR exon 9 skipping. EMBO J. 20 (7). 17741784 Bush E W, Helmke S M, Birnbaum R A, and Perryman M B (2000) Myotonic Dystrophy Protein Kinase Domains Mediate Localization, Oligomerization, Novel Catalytic Activity, and Autoinhibition Biochemistry, 39 (29). 84808490 Couratier P, Hugon J, Sindou P, Vallat JM, Dumas M (1993) Cell culture evidence for neuronal degeneration in amyotrophic lateral sclerosis being linked to glutamate AMPA/kainate receptors. Lancet. 30. 341 (8840). 265-8. Creppe C, Malinouskaya L, Volvert M L, Gillard M, Close P, Malaise O, Laguesse S, Cornez I, Rahmouni S, Ormenese S, Belachew S, Malgrange B, Chapelle J P, Siebenlist U, Moonen G, Chariot A, Nguyen L (2009) Elongator controls the migration and differentiation of cortical neurons through acetylation of alpha-tubulin. Cell 136 (3). 551-564 Davis B. M., Mila E. McCurrach, , Krishan L. Taneja, Singer R. H, Housman D. E (1997) Expansion of a CUG trinucleotide repeat in the 3 untranslated region of myotonic dystrophy protein kinase transcripts results in nuclear retention of transcripts PNAS 94 (14) 7388-7393 Day J W, Ricker K, Jacobsen J F, Rasmussen L J, Dick KA, Kress W, Schneider C, Koch M C, Beilman G J, Harrison A R, Dalton J C, Ranum L P (2003) Myotonic dystrophy type 2: molecular, diagnostic and clinical spectrum. Neurology. 60. 657-664. Deka R, Majumder P P, Shriver M D, Stivers D N, Zhong Y, Yu LM, Barrantes R, Yin SJ, Miki T, Hundrieser J, Bunker C H, McGarvey S T, Sakallah S, Ferrell R E, Chakraborty R. (1996).Distribution and evolution of CTG repeats at the myotonin protein kinase gene in human populations. Genome Res. 6(2). 142-54 Die-Smulders C E M de, Howeler C J, Thijs C, Mirandolle J F, Anten H B, Smeets H J M., Chandler K E and Geraedts J P M (1998)Age and causes of death in adult-onset myotonic dystrophy. Brain 121. 15571563 Fardaei M., Larkin K, Brook J. D, and Hamshere M. G (2001) In vivo co-localisation of MBNL protein with DMPK expanded-repeat transcripts. Nucleic Acids Res; 29 (13). 27662771 Frank K och Kranias E. G (2000) Phospholamban and cardiac contractility Ann Med. 32 (8). 572-578.
20

Franzen E.A. och Myers R.E. (1973)Neural control of social behavior: Prefrontal and anterior temporal cortex. Neuropsychologia 11 (2). 141-157 Goehler H, Lalowski M, Stelzl U, Waelter S, Stroedicke M, Worm U, Droege A, Lindenberg K S, Knoblich M, Haenig C, Herbst M, Suopanki J, Scherzinger E, Abraham C, Bauer B, Hasenbank R, Fritzsche A, Ludewig A H, Bussow K, Buessow K, Coleman S H, Gutekunst C A, Landwehrmeyer B G, Lehrach H, Wanker E E (2004) A protein interaction network links GIT1, an enhancer of huntingtin aggregation, to Huntington's disease. Mol. Cell 15 (6). 853-865 Harper P, Penney R, Foley Jr T, Migeon C. J, och Blizzard R. M (1972) Gonadal function in males with myotonic dystrophy. J Clin Endocrinol Metab 35. 852, Harper PS, Monckton DG (2004) Myotonic dystrophy; in Engel AG, Franzini-Armstrong C (eds): Myology, ed 3. New York, McGraw-Hill 2. 10391076. Hawkes N.A., Otero G., Winkler G.S., Marshall N., Dahmus M.E., Krappmann D., Scheidereit C., Thomas C.L., Schiavo G., Erdjument-Bromage H., Tempst P., Svejstrup J.Q. (2002) Purification and characterization of the human elongator complex J Biol Chem. 277. 3047-3052.

Hitomi Y, Tsuchiya N, Kawasaki A, Ohashi J, Suzuki T, Kyogoku C, Fukazawa T, Bejrachandra S, Siriboonrit U, Chandanayingyong D, Suthipinittharm P, Tsao B. P, Hashimoto H, Honda Z-I and Tokunaga K (2004) CD72 polymorphisms associated with alternative splicing modify susceptibility to human systemic lupus erythematosus through epistatic interaction with FCGR2B Hum. Mol. Genet. 13(23). 2907-2917 Holt I, Jacquemin V, Fardaei M, Sewry CA, Butler-Browne GS, Furling D, Brook JD, Morris GE. (2009) Similarities and Differences in Normal and Myotonic Dystrophy Muscle Am. J. of Pathol. 174. 216-227 Hutton M., Lendon C. L., Rizzu P, Baker M, Froelich S, Houlden H, Pickering-Brown S, Chakraverty S, Isaacs A, Grover A, Hackett J, Adamson J, Lincoln S, Dickson D, Davies P, Petersen R C, Stevens M, de Graaff E, Wauters E, van Baren J, Hillebrand M, Joosse M, Kwon J M, Nowotny P, Che L K, Norton J, Morris J C, Reed L A, Trojanowski J, Basun H, Lannfelt L, Neystat M, Fahn S, Dark F, Tannenberg T, Dodd P R, Hayward N, Kwok J B J, Schofield P R, Andreadis A, Snowden J, Craufurd D, Neary D, Owen F, Oostra B A, Hardy J, Goate A, van Swieten J, Mann D, Lynch T & Heutink P(1998) Association of missense and 5'-splice-site mutations in tau with the inherited dementia FTDP-17 Nature 393. 702-705 Kaliman P, Catalucci D, Lam J T, Kondo R, Gutirrez J C P, Reddy S, Palacn M, Zorzano A, Chien K R och Ruiz-Lozano P (2005) Myotonic Dystrophy Protein Kinase Phosphorylates
21

Phospholamban and Regulates Calcium Uptake in Cardiomyocyte Sarcoplasmic Reticulum The J. Biol. Chem. 280. 8016-8021. Kim E, Goren A and Ast G (2008) Alternative splicing and disease RNA Biology 5. 1 -3 Kim JH, Lane WS, Reinberg D. (2002) Elongator facilitates RNA polymerase II transcription through chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (3). 1241-1246. Klesert TR, Cho DH, Clark JI, Maylie J, Adelman J, Snider L, Yuen EC, Soriano P, Tapscott S J (2000) Mice deficient in Six5 develop cataracts: implications for myotonic dystrophy. Nat Genet. 25 (1). 105-9. Kono H, Kyogoku C, Suzuki T, Tsuchiya N, Honda H, Yamamoto K, Tokunaga K and Honda Z-I (2005) FcgRIIB Ile232Thr transmembrane polymorphism associated with human systemic lupus erythematosus decreases affinity to lipid rafts and attenuates inhibitory effects on B cellreceptor signaling Hum. Mol. Genet. 14 (19). 28812892 Kumanogoh A, Shikina T, Watanabe C, Takegahara N, Suzuki K, Yamamoto M, Takamatsu H, Prasad D V R, Mizui M, Toyofuku T, Tamura M, Watanabe D, Parnes J R and Hitoshi Kikutani1 (2005) Requirement for CD100CD72 interactions in fine-tuning of Bcell antigen receptor signaling and homeostatic maintenance of the B-cell compartment. Int. Immunol. 17(10). 1277-1282; Lazarus A, Varin J, Babuty D, Anselme F , Coste J, and Duboc D, (2002) Long-term follow-up of arrhythmias in patients with myotonic dystrophy treated by pacing J Am Coll Cardiol, ; 40. 1645-1652 Lehavi O, Aizenstein O, Bercovich D, Pavzner D, Shomrat R, Orr-Urtreger A, Yaron Y (2004) Screening for Familial Dysautonomia in Israel: Evidence for Higher Carrier Rate among Polish Ashkenazi Jews Genet. Test.7 (2). 139-142. Lee G, Papapetrou E P, Kim H, Chambers S M, Tomishima M J, Fasano C A, Ganat J M, Menon J, Shimizu F, Viale A, Tabar V, Sadelain M & Studer L (2009) Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs Nature 461. 402-406 Lehner B, Semple J I, Brown S E, Counsell D., Campbell R D., Sanderson C M. (2004) Analysis of a high-throughput yeast two-hybrid system and its use to predict the function of intracellular proteins encoded within the human MHC class III region. Genomics 83 (1). 153-167 Lin C-L G, Bristol L A, Jin L, Dykes-Hoberg M, Crawford T, Clawson L, and Rothstein . D (1998) Aberrant RNA Processing in a Neurodegenerative Disease: the Cause for Absent EAAT2, a Glutamate Transporter, in Amyotrophic Lateral Sclerosis Neuron, 20. 589602
22

Maccioni R. B. and Cambiazo V. (1995) Role of microtubule-associated proteins in the control of microtubule assembly Physiol. Rev. 75. 835-864 Mankodi A , Logigian E, Callahan L, McClain C, White R, Henderson D, Krym M, Thornton C A (2000) Myotonic Dystrophy in Transgenic Mice Expressing an Expanded CUG Repeat. Science 289. 1769 1772 Mercier B, Verlingue C, Lissens W, Silber SJ, Novelli G, Bonduelle M, Audrzet MP, Frec C (1995) Is congenital bilateral absence of vas deferens a primary form of cystic fibrosis? Analyses of the CFTR gene in 67 patients. Am. J. Hum. Genet. 56(1). 272-7. Meyer T, Fromm A, Mnch C, Schwalenstcker B, Fray A E, Ince P G, Stamm S, Grn G, Ludolph A C and Shaw P J(1999)The RNA of the glutamate transporter EAAT2 is variably spliced in amyotrophic lateral sclerosis and normal individuals J. Neurol. Sci.170 (1). 45-50 Meyer T, Mnch C, Knappenberger B, Liebau S, Vlkel H and Ludolph A C (1998) Alternative splicing of the glutamate transporter EAAT2 (GLT-1) Neurosci. Lett. 241 (1). 68-70 Moulton V R , Perl M A and Tsokos G C (2009) Alternative Splicing Factor/Splicing Factor 2 (ASF/SF2) regulates the expression of human T cell receptor CD3 chain J. Immunol. 182. 48.8 Ninomiya-Tsuji J., Kishimoto K., Hiyama A., Inoue J., Cao Z., Matsumoto K. (1999) The kinase TAK1 can activate the NIK-I kappaB as well as the MAP kinase cascade in the IL-1 signalling pathway Nature. 18;398(6724):252-6. Niwa J, Yamada S, Ishigaki S, Sone J, Takahashi M, Katsuno M, Tanaka F, Doyu M and Sobue G (2007) Disulfide Bond Mediates Aggregation, Toxicity, and Ubiquitylation of Familial Amyotrophic Lateral Sclerosis-linked Mutant SOD1 J. Biol. Chem. 282. 28087-28095. Pearson J, Pytel BA, Grover-Johnson N, Axelrod F, Dancis J. (1978) Quantitative studies of dorsal root ganglia and neuropathologic observations on spinal cords in familial dysautonomia. J Neurol Sci. 35(1):77-92. Philips A V, Timchenko L T, Cooper T A (1998) Disruption of Splicing Regulated by a CUGBinding Protein in Myotonic Dystrophy. Science 280. 737 - 741 Pickering-Brown S M, Richardson A M T, Snowden J S, McDonagh A M, Burns A, Braude W., Baker M., Liu W-K, Yen S-H, Hardy J, Hutton M, Davies Y, Allsop D, Craufurd D, Neary D and Mann DM A (2002) Inherited frontotemporal dementia in nine British families associated with intronic mutations in the tau gene Brain 125 (4). 732-751, Quinton P M (2007) Cystic Fibrosis: Lessons from the Sweat Gland Physiology, 22 (3). 212225
23

Reddy S, Smith DB, Rich MM, Leferovich JM, Reilly P, Davis BM, Tran K, Rayburn H, Bronson R, Cros D, Balice-Gordon R J, Housman D. (1996) Mice lacking the myotonic dystrophy protein kinase develop a late onset progressive myopathy. Nat Genet. 13(3). 325-35 Reed L ., Wszolekb Z K och Huttonb M (2001) Phenotypic correlations in FTDP-17 Neurobiol. Aging. Volume 22 (1). 89-107 Rnnblom A, Forsberg H, och Danielsson A (1996)Gastrointestinal Symptoms in Myotonic Dystrophy Scand. J. Gastroenterol. 31 (7). 654-657 Savkur R S, Philips A V & Cooper T A (2001) Aberrant regulation of insulin receptor alternative splicing is associated with insulin resistance in myotonic dystrophy Nat. Genet. 29. 40 - 47 Sheppard D N and Welsh M J (1999) Structure and Function of the CFTR Chloride Channel Physiol. Rev. 79. 23-45 Shigeri Y, Seal R P and Shimamoto K (2004) Molecular pharmacology of glutamate transporters, EAATs and VGLUTs Brain Res. Rev. 45 (3) 250-265 Slaugenhaupt S A, Blumenfeld A Gill S P, Leyne M, Mull J, Cuajungco M P, Liebert C B, Chadwick B P,Idelson M, Reznik L, Robbins C M, Makalowska I Brownstein M J, Krappmann D, Scheidereit C, Maayan C, Axelrod F B, Gusella J F (2001) Tissue-specific expression of a splicing mutation in the IKBKAP gene causes familial dysautonomia. Am. J. Hum. Genet. 68. 598-605 Sovari A A, Dudley S C Jr. (2008) Sudden death in myotonic dystrophy. N Engl J Med. 359(15). 1626-1629 Wille H, Drewes G, Biernat J, Mandelkow E M, and Mandelkow E (1992) Alzheimer-like Paired Helical Filaments and Antiparallel Dimers Formed from Microtubule-associated Protein Tau In Vitro. J. Cell Biol. 118. 573-584 Tamaoka A, Arai M, Itokawa M, Arai T, Hasegawa M, Tsuchiya K, Takuma H, Tsuji H, Ishii A, Watanabe M, Takahashi Y, Goto J, Tsuji S and Akiyama H (2010) TDP-43 M337V Mutation in Familial Amyotrophic Lateral Sclerosis in Japan . Intern. Med. 49. 331-334 Thornton CA, Wymer JP, Simmons Z, McClain C, Moxley RT 3rd. (1997) Expansion of the myotonic dystrophy CTG repeat reduces expression of the flanking DMAHP gene. Nat. Genet. 16 (4). 407-409 Tsao B P, Grossman J M, Riemekasten G, Strong N, Kalsi J, Wallace D J, Chen C-J, Lau C S, Ginzler E M, Goldstein R, Kalunian K C, Harley J B, Arnett F C, Hahn B H, Cantor R
24

M (2002) Familiality and co-occurrence of clinical features of systemic lupus erythematosus Arthritis Rheum. 46 (10). 26782685 van der Houven van Oordt W, Newton K, Screaton G R and Cceres J . (2000) Role of SR protein modular domains in alternative splicing specificity in vivo Nucleic Acids Research 28 (24). 4822-4831 Vazquez JA, Pinies JA, Martual P et al (1990) Hypothalmicpituitary testicular function in 70 patients with myotonic dystrophy. J Endocrinol Invest 13. 375379. Wang Z, Rolish M E, Yeo G, Tung V, Mawson M and Burge C B(2004)Systematic Identification and Analysis of Exonic Splicing Silencers Cell 119 (6). 831-845

25