PRACE PRZEGLDOWE

Biokonwersja kwasu trans-cynamonowego do L-fenyloalaniny przez drode z rodzaju Rhodotorula

Iwona Gientka, Stanisaw Baejak, Wanda Duszkiewicz-Reinhard
Zakad Biotechnologii i Mikrobiologii ywnoci, Wydzia Technologii ywnoci, Szkoa Gwna Gospodarstwa Wiejskiego, Warszawa

Bioconversion of trans-cinnamic acid to L-phenylalanine by Rhodotorula sp.

Summary: The synthesis of the aromatic amino acid L-phenylalanine has received considerable attention in recent years due to its increasing importance as precursor to the dipeptide sweetener aspartame. Phenylalanine ammonia lyase (PAL), which occurs in yeast, catalyzes the nonoxidative deamination of L-Phe to trans-cinnamic acid (tCA), has industrial application in the synthesis of L-Phe. Superior producers of PAL are Rhodotorula sp. PAL is induced in yeast cell by the presence of L-Phe, while glucose represses PAL synthesis. Different additives and conditions during inducing PAL: permeabilizing, reducing and stabilization agents, as well as pH and temperature during bioconversion targeting to higher productivity of L-Phe were discussed.
Adres do korespondencji

Iwona Gientka, Zakad Biotechnologii i Mikrobiologii ywnoci, Wydzia Technologii ywnoci, Szkoa Gwna Gospodarstwa Wiejskiego, ul. Nowoursynowska 159 c, 02-776 Warszawa.

Key words: phenylalanine ammonia lyase, trans-cinnamic acid, L-phenylalanine, yeast, Rhodotorula sp.

1. Wstp
Enzym amoniakoliaza fenyloalaninowa (EC 4.3.1.5) szeroko rozpowszechniony w komrkach rolinnych, katalizuje spontaniczn nieoksydatywn deaminacj L-fenyloalaniny do kwasu trans-cynamonowego i amoniaku (1). W dalszym cyklu przemian

2 (73) 117129 2006

Iwona Gientka, Stanisaw Baejak, Wanda Duszkiewicz-Reinhard

Rys. 1. Reakcja biokonwersji kwasu trans-cynamonowego do L-fenyloalaniny.

metabolicznych kwas trans-cynamonowy moe zosta przeksztacony do lignin, flawonoidw, polifenoli i hormonw (2). Enzym ten wystpuje rwnie powszechnie w komrkach grzybw (3). Po raz pierwszy obecno amoniakoliazy fenyloalaninowej (PAL, ang. phenylalanine ammonia lyase) w komrkach drody zostaa potwierdzona przez Ogat w 1966 r. (4). Od tego czasu wielokrotnie wykazywano aktywno PAL m.in. w komrkach Streptomyces verticillatus (5), Sporolobomyces pararoseus (6), Rhizoctonia solani (7), Endomyces lindneri (8), Cladosporium cladosporoides (9). Jednak najwikszym producentem tego enzymu s drode Rhodosporidium toruloides i ich forma anamorficzna z rodzaju Rhodotorula (3,10,11). Gwne zadanie amoniakoliazy fenyloalaninowej wystpujcej w komrkach drody polega na uczestnictwie w przyswajaniu fenyloalaniny jako rda wgla i azotu (12). W praktyce medycznej oczyszczony preparat enzymatyczny PAL znajduje zastosowanie w leczeniu fenyloketonurii (13), oraz neoplastycznych nowotworw u myszy (14). Jednak od wielu lat, zainteresowaniem naukowcw cieszy si przede wszystkim moliwo wykorzystania PAL do produkcji L-fenyloalaniny z kwasu trans-cynamonowego (1,15). Proces ten jest stosowany w przemysowej produkcji tego aminokwasu na drodze mikrobiologicznej (15,16).

2. Charakterystyka i zastosowanie L-fenyloalaniny

Fenyloalanina (Phe), kwas L-2-amino-3-fenylopropionowy, naley do tzw. aminokwasw aromatycznych, zawiera piercie fenylowy, poczony z grup metylow CH2i podobnie jak tryptofan, wykazuje charakter silnie hydrofobowy (17). Dla ssakw nieposiadajcych szlaku biosyntezy aminokwasw aromatycznych jest aminokwasem egzogennym, ktry naley dostarcza do organizmu wraz z poywieniem (18). Fenyloalanina znalaza zastosowanie w przemyle spoywczym, a take farmaceutycznym, np. do produkcji 3,4-dihydroksyfenyloalaniny (L-DOPA) leku stosowanego w chorobie Parkinsona (19). Wzrost komercyjnego znaczenia L-Phe w ostatnich latach zosta wywoany wynalezieniem aspartamu. Aspartam (nazwy handlowe:

118

PRACE PRZEGLDOWE

Biokonwersja kwasu trans-cynamonowego do L-fenyloalaniny przez drode z rodzaju Rhodotorula

Nutra Sweet, Equal, Sanecta) to popularny sodzik, 200-krotnie sodszy od cukru, a obecnie szeroko stosowany w technologii ywnoci oraz produkcji lekw. Aspartam jest dipeptydem zbudowanym z L-Phe i kwasu L-asparaginowego. W przemyle funkcjonuje pod symbolem E 951 (20). Szacuje si, e roczna produkcja L-fenyloalaniny wynosi 7000 ton (21). Wraz ze wzrostem zapotrzebowania na produkty typu light przewiduje si dalszy wzrost produkcji L-fenyloalaniny jako substratu do otrzymywania aspartamu. W organizmach ssakw L-Phe jest przeksztacana do tyrozyny przez enzym hydroksylaz fenyloalaninow. Enzym ten katalizuje utlenianie L-Phe do tyrozyny przy wspudziale NADP. Dziedzicznie uwarunkowany niedobr aktywnoci hydroksylazy L-fenyloalaninowej w wtrobie jest przyczyn choroby zwanej fenyloketonuri (PKU, ang. phenylketonuria). Chorob t pod wzgldem klinicznym cechuje przede wszystkim upoledzenie rozwoju umysowego. Poza tym z mniejsz lub wiksz czstotliwoci pojawiaj si stany podniecenia, zaburzenia encelograficzne, zwikszone napicie mini oraz drgawki i napady epileptyczne (22). W przypadku fenyloketonurii poziom fenyloalaniny w osoczu krwi moe wzrosn nawet do 60 mg/100 ml, podczas gdy prawidowy poziom wynosi 1,65 mg/100 ml (23). Sugeruje si, e amoniakoliaza fenyloalaninowa, a dokadniej jej poczenia z PEG w szczeglnoci liniowy 20 kDa PEG-PAL mog by rodkiem terapeutycznym w fenyloketonurii (24,25). Fenyloalanin otrzymuje si ze rde naturalnych, metodami syntezy chemicznej oraz metodami mikrobiologicznymi. Fenyloalanina pozyskana ze rde naturalnych jest czynna optycznie, co pozwala pomin proces rozdziau izomerw. Najczciej izolowana jest z biaek typu owoalbuminy i laktoalbuminy (26). Jednak koszty, pracochonno, jak i dostpno surowca znacznie zmniejszaj atrakcyjno stosowania tej metody. Na drodze chemicznej L-fenyloalanin syntetyzuje si m.in. z wykorzystaniem estru kwasu malonowego. Metody chemiczne, znane ju od roku 1850, np. synteza Streckera, prowadz do otrzymania zwizkw bdcych mieszanin racemiczn. W celu uzyskania czystych izomerw optycznych konieczny jest dodatkowy etap rozdzielania, ktry prowadzi do podniesienia kosztw produkcji (27). W tym kontekcie na szczegln uwag zasuguj drode Rhodotorula gracilis. Mog one by rdem enzymu, oksydazy D-aminokwasowej (DAAO, EC 1.4.3.3), stosowanego do rozdzielania mieszanin racemicznych aminokwasw. Enzym ten katalizuje przeksztacenie tylko D-formy przez a-aminokwas do a-ketokwasu (28). Form L-fenyloalaniny mona bezporednio uzyska w procesie biokonwersji kwasu trans-cynamonowego (tCA, ang. trans-cinnamic acid) wykorzystujc amoniakoliaz fenyloalaninow pochodzc z drody Rhodotorula sp. (29).

BIOTECHNOLOGIA 2 (73) 117-129 2006

119

Iwona Gientka, Stanisaw Baejak, Wanda Duszkiewicz-Reinhard

3. Struktura i waciwoci amoniakoliazy fenyloalaninowej

Przeprowadzone przez Hodginsa (14) badania struktury i waciwoci amoniakoliazy fenyloalaninowej pochodzcej z komrek drody Rhodotorula glutinis (ATTC 15385) wykazay, e enzym ten jest tetramerem o masie czsteczkowej 275 kDa. W roku 1990 Adachi zbada enzym wyodrbniony z komrek Rhodosporidium toruloides (IFO 0559) i wykaza, e enzym jest dimerem, a jego masa czsteczkowa wynosi 165 kDa (30). Jako przyczyn rnic mas czsteczkowych uznano technik oczyszczania enzymu. W badaniach enzymw wyizolowanych z pszenicy i ziemniakw, wskazuje si jeszcze wiksze masy czsteczkowe, ktre wynosz odpowiednio 306 i 330 kDa. PAL zlokalizowany jest gwnie w cytoplazmie, a niewielkie jego iloci znaleziono take na szorstkim ER (31). Wedug najnowszych bada uznaje si, e w centrum aktywnym enzymu znajduje si pochodna grupy imidazolowej w skrcie MIO (methylidene imidazolone), ktra powstaje przez cyklizacj tripeptydu AlaSerGly i ma charakter silnie elektrofilowy. Jej obecno w centrum aktywnym enzymu sugeruje si na podstawie analizy rentgenostrukturalnej amoniakoliazy histydynowej (EC 4.3.1.3), ktra wykazuje wysok homologi w stosunku do PAL (19-29% identycznej sekwencji). Istnienie grupy MIO w amoniakoliazie fenyloalaninowej potwierdzono take w badaniach metod rnicowej UV-spektroskopii (32). Przewidywana obecno grupy MIO w centrum aktywnym PAL zostaa potwierdzona w 2004 r., kiedy to na podstawie bada krystalograficznych pierwszy raz oznaczono struktur przestrzenn enzymu wyizolowanego z Rhodosporidium toruloides (33). Obecnie znana jest sekwencja nukleotydowa genu kodujcego PAL w komrkach drody R. toruloides (34) i R. rubra (35). Indukcja aktywnoci PAL jest raczej rezultatem syntezy de novo ni wynikiem aktywacji prekursora (36). Amoniak i glukoza wpywaj na syntez PAL przez regulacj poziomu funkcjonalnego PAL mRNA (37). Przeprowadzano rwnie dowiadczenia polegajce na wprowadzaniu genu pal wraz z intronami pochodzcego z R. toruloides do komrek E. coli (38) i Saccharomyces cerevisiae (39), ktre jednak nie doprowadziy do biosyntezy enzymu. Dopiero wbudowanie cDNA w wektor plazmidowy doprowadzio do jego ekspresji w komrkach E. coli. Aktywno tak rekombinowanego enzymu wynosi zaledwie 3-5 mU (40), co w porwnaniu z aktywnoci tego enzymu u dzikich szczepw Rhodotorula glutinis na poziomie 150-200 mU jest wartoci nieporwnywalnie ma (38). Ukierunkowane poszukiwania dzikich szczepw o duej aktywnoci amoniakoliazy fenyloalaninowej rozpoczto w roku 1967 (41) od prb izolacji szczepw na podoach z fenyloalanin jako jedynym rdem wgla i azotu. Skuteczno tej metody bya jednak niewielka, gdy na takich podoach rosy drobnoustroje wykorzystujce fenyloalanin w innych mechanizmach ni tylko jako substrat dla amoniakoliazy fenyloalaninowej (42). Podejmowano take prby wykorzystania kwasu trans-cynamonowego jako jedynego rda wgla w podou selektywnym. Na takich podoach znajdowano kolonie drobnoustrojw, ktre w dalszych badaniach

120

PRACE PRZEGLDOWE

Biokonwersja kwasu trans-cynamonowego do L-fenyloalaniny przez drode z rodzaju Rhodotorula

nie wykazay aktywnoci PAL (43,44). Najwicej komrek zawierajcych PAL uzyskano na selektywnym podou z L-tyrozyn (10). Substrat ten, zosta wybrany zgodnie z zaoeniem, e metabolizm tyrozyny z udziaem PAL jest bardzo powolny. Dlatego te w wikszych koloniach na podou selektywnym z L-Tyr spodziewano si wysokiego poziomu aktywnoci PAL. Stosujc t procedur wyizolowano drode z gatunkw Rhodotorula rubra, Rhodotorula glutinis, Rhodotorula minuta, Rhodosporidium toruloides i Sporidiobolus pararoseus wykazujce wysok aktywno amoniakoliazy fenyloalaninowej.

4. Charakterystyka drody z rodzaju Rhodotorula

Drode Rhodotorula nale do Krlestwa Fungi, gromady Basidiomycota, klasy Uredinomycetes, rzdu Sporidiales, rodziny Sporidiobolaceae i rodzaju Rhodotorula (45,46). Najbardziej charakterystyczn cech fizjologiczn tych drody jest wytwarzanie barwnikw karotenoidowych. Kolonie przyjmuj barw od ososiowej przez row, koralow a do krwistoczerwonej. Barwniki karotenoidowe chroni komrki przed dziaaniem promieni wiata widzialnego i bliskiego ultrafioletu (47). Drode z rodzaju Rhodotorula znajdowano m.in. w produktach rolinnych, zwierzcych oraz w powietrzu. S take, obok Candida, Cryptococcus, Debaromyces, szeroko rozpowszechnione w wodzie sodkiej i w morskiej (46). Nale do mikroflory szkodliwej wystpujcej na male, serze, mietanie, misie czy drodach piekarskich (48). Mog tolerowa wysokie stenia soli, nawet do 1M NaCl (49). Drode z rodzaju Rhodotorula charakteryzuj si nisk patogennoci, cho mona znale doniesienia, w ktrych wskazuje si na takie waciwoci niektrych gatunkw. Drode rodzaju Rhodotorula mog by czynnikiem etiologicznym oportunistycznych mykoz u podatnych gospodarzy, zwaszcza pacjentw z AIDS lub ostr biaaczk (50-52).

5. Produkcja L-fenyloalaniny na drodze biokonwersji

Wedug danych literaturowych (10,11,14,16) organizmami najczciej opisywanymi i stosowanymi do otrzymania L-fenyloalaniny metod biokonwersji s bogate w enzym PAL drode Rhodotorula glutinis, a take Rhodotorula mucilaginosa i Rhodosporiduim toruloides. Schemat produkcji L-fenyloalaniny z wykorzystaniem tych organizmw obejmuje trzy zasadnicze etapy: indukcj amoniakoliazy fenyloalaninowej w komrkach drody, biokonwersj kwasu trans-cynamonowego do L-Phe, oddzielenie i oczyszczenie L-fenyloalaniny.

BIOTECHNOLOGIA 2 (73) 117-129 2006

121

Iwona Gientka, Stanisaw Baejak, Wanda Duszkiewicz-Reinhard

Rys. 2. Schemat prodykcji L-fenyloalaniny z wykorzystaniem drody z rodzaju Rhodotorula sp.

122

PRACE PRZEGLDOWE

Biokonwersja kwasu trans-cynamonowego do L-fenyloalaniny przez drode z rodzaju Rhodotorula

5.1. Namnoenie komrek w podou pynnym oraz indukcja amoniakoliazy fenyloalaninowej

Do namnoenia komrek drody stosuje si standardowe procedury, ktre zapewniaj odpowiednie rda wgla, najczciej w postaci glukozy. W charakterze nieorganicznych rde azotu stosuje si fosforan lub siarczan amonu. Organicznymi rdami azotu mog by aminokwasy, pepton, hydrolizaty proteinowe, mka sojowa lub syrop kukurydziany. Za najlepszy uznaje si jednak ekstrakt drodowy. Witaminy, skadniki mineralne i inne czynniki wzrostowe dostarczane s wraz ze rdami wgla i azotu, albo dodawane oddzielnie. Typowe biopierwiastki jak cynk, magnez, elazo, kobalt i wap mog by dodawane do podoy w formie soli nieorganicznych (53). W warunkach hodowli z napowietrzeniem na zbilansowanych podoach stwarzane s dogodne warunki wzrostu. Namnoone komrki po odwirowaniu przenosi si do podoa, w ktrym nastpuje indukcja enzymu odpowiedzialnego za produkcj fenyloalaniny. Rol induktora spenia L-fenyloalanina lub D,L-fenyloalanina, L-tyrozyna, D,L-tyrozyna (53), a take L-izoleucyna (11). Przecitna dawka L-fenyloalaniny w podou, ktra indukuje produkcj PAL wynosi 0,4-0,5% (54,55,10). Stosowanie wyszych dawek nie wpywa istotnie na wzrost aktywnoci enzymu, za to znacznie podwysza koszty jego produkcji (53). Dobre wyniki uzyskiwano stosujc jako induktor mieszanin fenyloalaniny i izoleucyny odpowiednio w ilociach 0,5 i 0,05% w podou (3,11). Uzyskanie maksymalnej ekspresji PAL determinuje odpowiednie stenie rde wgla i azotu podczas hodowli komrek drody. Zaobserwowano rwnie zjawisko represji katabolicznej syntezy PAL przez glukoz (36). Przedmiotem bada by take wpyw innych rde wgla na indukcj amoniakoliazy fenyloalaninowej (10). Wykazano, e aden z badanych szczepw nie syntetyzowa PAL w obecnoci cukrw i alkoholi. Evans i wsp. badali wpyw stenia jonw amonowych, dodawanych w postaci (NH4)2SO4, na regulacj syntezy PAL. Wraz ze zmniejszaniem stenia tych jonw w rodowisku aktywno enzymu wzrastaa (10). Nadal trwaj poszukiwania innych, taszych od czystych aminokwasw rde induktorw. Obiecujcym rdem takich zwizkw moe by, jak si wydaje, kazeina lub hydrolizaty krwi (53). Ustalono, e optymalna temperatura dla syntezy PAL wynosi na og od 20 do 30C (3). Temperatura powyej 30C niekorzystnie wpywa na aktywno enzymu. W komrkach Rhodotorula rubra aktywno osigaa warto maksymaln w temperaturze hodowli 25C, natomiast w 35C bya nisza o 75%. W przypadku amoniakoliazy fenyloalaninowej pochodzcej z komrek Rhodotorula graminis aktywno tego enzymu w temp. hodowli 35C obniaa si o 30% w porwnaniu z jego aktywnoci w temp. hodowli 25C. Kolejnym czynnikiem istotnie wpywajcym na indukcj PAL jest pH, ktrego optymalna warto wedug danych literaturowych (56,11) powinna wynosi od 5,5 do 7,5.

BIOTECHNOLOGIA 2 (73) 117-129 2006

123

Iwona Gientka, Stanisaw Baejak, Wanda Duszkiewicz-Reinhard

Proces indukcji PAL powinien przebiega w takich warunkach, aby zbyt wysoki stopie natlenienia hodowli nie prowadzi do proteolitycznego rozkadu enzymu. El-Batal podaje, e podczas hodowli wgbnej na wytrzsarce rotacyjnej liczba obrotw nie powinna przekracza 105 na minut (11). Hodowl drody na podou indukcyjnym prowadzi si do momentu, gdy enzym PAL osignie aktywno przynajmniej 0,2-2 U/ml (53). Na podou z fenyloalanin najwiksz aktywno enzymu w przypadku szczepu R. glutinis obserwowano w 16-18 godzinie hodowli. Po osigniciu stacjonarnej fazy wzrostu aktywno enzymu gwatownie spada. Yamada i wsp. podaj, e dodatek L-izoleucyny do podoa indukcyjnego przeciwdziaa temu niekorzystnemu zjawisku i pozwala utrzyma wysok aktywnoci enzymu w komrkach drody Rhodotorula glutinis podczas ich dalszej hodowli (1). Komrki zawierajce amoniakoliaz fenyloalaninow mog by wraliwe na kataboliczn represj syntezy enzymu. Istnieje zatem potrzeba usuwania metabolitw oraz ich prekursorw z podoa. W tym celu oddziela si komrki z podoa przez odwirowanie lub filtracj, po czym przemywa si i zawiesza w wolnym od metabolitw rodowisku.

5.2. Biokonwersja kwasu trans-cynamonowego do L-fenyloalaniny

W procesie biokonwersji tCA do L-Phe z udziaem PAL wykorzystuje si reakcj odwrotn zachodzc w wysokim pH. Optymalne pH procesu mieci si w zakresie 9-11 (53) i zaley od przynalenoci gatunkowej stosowanych drody. Przykadowe wartoci optymalnej kwasowoci czynnej rodowiska wynosz: pH 9,5 dla komrek drody Rhodosporidum toruloides (57), pH 10,5 dla Rhodotorula rubra (15), pH 10,0 dla R. glutinis IFO 0559 (1), pH 11,0 dla mutantw Rhodotorula glutinis (58). Poniej wartoci pH rwnej 9 nastpuje deaminacja L-Phe do kwasu trans-cynamonowego. Biokonwersja zachodzi przy duym nadmiarze amoniaku w stosunku do kwasu trans-cynamonowego. W zwizku z tym najczciej stosowane stenie amoniaku wynosi od 2 do 9 M NH4OH (15). W celu uzyskania duego stenia L-Phe zawarto kwasu cynamonowego w mieszaninie reakcyjnej zasadniczo powinna by wysoka. Jednoczenie stwierdzono (56), e nadmierna koncentracja tCA w rodowisku reakcji jest inhibitorem aktywnoci amoniakoliazy fenyloalaninowej. Tym samym konieczne staje si okrelenie moliwie maksymalnej zawartoci tego zwizku w mieszaninie. Wedug danych objtych patentem (59) optymalne stenie tCA w podou powinno wynosi 5-30 g/l (najczciej 10-20 g/l). Wedug innych autorw (56) graniczne stenie kwasu nie powinno przekracza 7,4 g/l (50 mM). Mechanizm inhibicji kwasem cynamonowym prawdopodobnie polega na aktywacji proteaz, ktre rozkadaj PAL. Z ca pewnoci wysokie stenie kwasu trans-cynamonowgo obnia aktywno PAL, podobnie

124

PRACE PRZEGLDOWE

Biokonwersja kwasu trans-cynamonowego do L-fenyloalaniny przez drode z rodzaju Rhodotorula

jak wewntrzkomrkowe enzymy proteolityczne nieodwracalnie niszcz ten enzym. Ocenia si, e system inaktywacji enzymu moe by zaleny od aktywnoci tlenu w rodowisku i moe wymaga odpowiedniego stenia jonw chlorkowych. Evans i wsp. podaj, e zahamowanie syntezy PAL moe rwnie nastpowa w obecnoci izoleucyny, fenyloalaniny, a take w warunkach obnionej zawartoci tlenu (60). Optymalna temperatura, w jakiej zachodzi biokonwersja, wynosi 15-20C, przy czym proces moe przebiega w zakresie temperatur 5-40C. Nisza temperatura reakcji korzystnie wpywa na przeduenie stabilnoci enzymu i stwarza moliwo wykorzystania komrek drody w procesie cigym (53). Inni autorzy (15) obserwowali sta wydajno biokonwersji w zakresie temp. 25-40C. Takac i wsp. uznali temperatur 30C za optymaln, wwczas gdy L-Phe bya wytwarzana przez komrki Rhodotorula glutinis (56). Wzrost temperatury do 40C powodowa spadek stenia aminokwasu o okoo 50% w porwnaniu do przebiegu procesu w temperaturze optymalnej. Na wydajno biokonwersji znaczcy wpyw ma obecno jonw Cl- (56). Stosowanie wyszych ste Cl- (0,5 M i 1 M) obniao wydajno procesu. Zauwaono take, e przy wyszym steniu tCA (powyej 50 mM) ju najnisza badana ilo KCl, wynoszca 0,1 M, powodowaa inhibicj PAL. Dlatego te do regulacji pH na pocztku procesu zaleca si uywanie kwasu siarkowego zamiast solnego (11). Badania wielu autorw (56,60) dotyczyy wpywu metabolitw na proces biokonwersji. Jedynym metabolitem wpywajcym na popraw wydajnoci procesu by kwas L-glutaminowy. Jego dodatek w iloci 4 g/l do mieszaniny reakcyjnej dla R. rubra powodowa wzrost wydajnoci produkcji L-fenyloalaniny o okoo 50%. W przypadku szczepu drody R. glutinis zastosowanie dodatku glutaminianu sodu w iloci 50 g/l powodowao wzrost wydajnoci o blisko 500%. Poniewa PAL jest enzymem wewntrzkomrkowym, zatem czynniki rozluniajce struktur ciany komrkowej powinny zdecydowanie podnosi ilo wyprodukowanej L-fenyloalaniny. Dodatek 0,1% Tritonu X-100 podnosi wydajno procesu o blisko 60%. Inne substancje o podobnym dziaaniu jak chlorek cetydylopimirydyny czy DMSO zwiksza wydajno odpowiednio o 50 i 35% (11). Podobnie korzystny wpyw na wydajno procesu biokonwersji mia dodatek penicyliny do rodowiska reakcji (56). Take potraktowanie komrek drody niektrymi rozpuszczalnikami organicznymi zwaszcza acetonem, eterem lub mieszanin toluenu i etanolu podnosio wydajno biokonwersji (11). Niektrzy autorzy (61) uwaaj, e permeabilizacja agresywnymi zwizkami typu rozpuszczalniki i alkohole powoduje, e komrki ulegaj osabieniu, co znalazo potwierdzenie w bardzo niskiej wydajno produkcji aminokwasu przez komrki uyte w drugim cyklu. Poleca si, zatem dodatek Tritonu X-100 w niskich steniach, ktry nie prowadzi do gbokich zmian w integralnoci struktur komrkowych. Znaczn trudno podczas biokonwersji tCA sprawia utrzymanie stabilnoci i aktywnoci enzymu na takim poziomie, aby mg on by wykorzystywany w nastpnym cyklu, czy wreszcie w procesie cigym. Na stabilno enzymu i w konsekwencji

BIOTECHNOLOGIA 2 (73) 117-129 2006

125

Iwona Gientka, Stanisaw Baejak, Wanda Duszkiewicz-Reinhard

wysz wydajno biokonwersji wpywa dodatek L-izoleucyny, ktry jednak znacznie podnosi koszty produkcji. Inne zwizki zwikszajce stabilno to m.in. glikol polietylenowy, glikol etylenowy, sorbitol, glicerol i glutaraldehyd (11). Evans i wsp. (1987), Takac i wsp. (1995), DCuhna i wsp. (1994) oraz El-Batal (2002) podaj, e najskuteczniejsz ochron amoniakoliazy fenyloalaniowej wykazuje glicerol zastosowany w steniu 20% (11,56,60,62). Dokonujc oceny wpywu innych czynnikw na wydajno procesu biokonwersji (60) stwierdzono, e ograniczenie dostpu tlenu w rodowisku reakcji moe zmniejszy aktywno metaboliczn komrek, a w rezultacie doprowadzi do obnienia stopnia proteolitycznego rozkadu enzymu. Skonio to El-Batala do okrelenia wpywu czynnikw redukujcych na wydajno biokonwersji kwasu tCA do L-Phe. Nie stwierdzi on zwikszenia wydajnoci przy dodatku jonw metali takich jak: wap, cynk, elazo, mied, mangan, magnez. Dodatek innych czynnikw redukujcych, a wrd nich 2-merkaptoetanolu i kwas tioglikolowego w steniu 400 mg/l znaczco poprawi wydajno procesu, odpowiednio o 49 i 55% przy uyciu komrek w jednym cyklu. W przypadku wykorzystania komrek w kilku cyklach 2-merkaptoetanol podnosi wydajno a o 400%, a kwas tioglikolowy o blisko 500% (11). Inni autorzy (63,64) w swoich pracach koncentruj si gwnie na wykorzystaniu poznanych wczeniej zjawisk i zalenoci zachodzcych w procesie biokonwersji w celu podniesienia jej wydajnoci. Badano m.in. wykorzystanie w procesie cigym komrek immobilizowanych w alginianie, stosowano dodatek mieszaniny PEG, glutaraldehydu, sorbitolu oraz deareacj przez wysycanie rodowiska reakcji azotem. Standardowo proces biokonwersji trwa 24 h i koczy si odwirowaniem biomasy komrkowej drody (65).

5.3. Proces oczyszczania L-fenyloalaniny

Kocowym etapem produkcji L-fenyloalaniny metod biokonwersji jest jej oczyszczenie. Znane s 4 metody oczyszczania tego aminokwasu opatentowane w Japonii, USA i EU: 1. Patent japoski (No. 194046/1986) metoda rozdziau chromatograficznego (ang. the ion exchange resin adsorption method). Jest to technika kosztowna, mao wydajna i z tego wzgldu nie znajdujca zastosowania w przemyle. 2. Patent japoski (No. 133893/1985) metoda zatenia i krystalizacji fenyloalaniny (ang. concentration/crystalization method). Z uwagi na konieczno filtracji przed zateniem uwaana jest rwnie za technik trudn i nisko efektywn. Dodatkowo w tym procesie roztwr wymaga neutralizacji, co prowadzi do powstawania niepotrzebnych soli. 3. Patent amerykaski (No. 4731469) metoda z uyciem pierwszorzdowych alkoholi (ang. a lower alcohol using method). Kwas cynamonowy rozpuszcza si w alkoholu i dalej jest stamtd usuwany.

126

PRACE PRZEGLDOWE

Biokonwersja kwasu trans-cynamonowego do L-fenyloalaniny przez drode z rodzaju Rhodotorula

4. Patent europejski (EP 0 556 721 A1) metoda ekstrakcji z toluenem i rozdzieleniem faz. Proces przebiega z du wydajnoci, a otrzymany aminokwas wykazuje du czysto, co daje podstawy do przemysowego zastosowania.

6. Perspektywy badawcze
Na podstawie dotychczasowych bada mona przypuszcza, e w dalszych pracach zwizanych z opracowaniem wydajnego procesu produkcji L-fenyloalaniny przez drode z rodzaju Rhodotorula badacze zmierzaj do: 1) uzyskania szczepu o duej ekspresji i aktywnoci PAL na drodze mutagenizacji chemicznej (3), fizycznej (58), fuzji protoplastw i transformacji (66), 2) zwikszenia wydajnoci produkcji L-Phe przez stosowanie zwizkw rozluniajcych cian komrkow drody w celu uatwienia migracji substratw do komrki i produktu na zewntrz komrki, 3) stabilizacji enzymu podczas procesu biokonwersji metodami immobilizacji caych komrek (63) dodawania czynnikw redukcyjnych, a w konsekwencji wykorzystania drody w cigym procesie produkcji L-Phe, 4) wykorzystania analogw fenyloalaniny do produkcji innych substancji, np. esteru metylowego L-fenyloalaniny jako bezporedniego prekursora w syntezie aspartamu (62,67), 5) wyodrbnienia preparatu enzymatycznego z biomasy komrkowej drody o wysokiej aktywnoci PAL.

Literatura
1. Yamada S., Nabe K., Izuo N., Nakamichi K., Chibata I., (1981), Appl. Environ. Microbiol., 42, 773-778. 2. Hao Z., Charles D. J., Yu L., Simon J. E., (1996), Phytochemistry, 43, 735-739. 3. Orndorff S. A., Costantino N., Stewart D., Durham D. R., (1988), Appl. Environ. Microbiol., 54, 996-1002. 4. Ogata K., Uchiyama K., Yamada H., (1966), Agric. Biol. Chem., 30, 311-312. 5. Bezanson G. S., Desaty D., Emes A. V., Vining L. C., (1970), Can. J. Microbiol., 16, 147-151. 6. Parkhurst J. R., Hodgins D. S., (1971), Phytochemistry, 10, 2997-3000. 7. Kalghati K. K., Subba Rao P. V., (1975), Biochem. J., 149, 65-72. 8. Onishi N., Yokozeki K., Hirose Y., Kubota K., (1987), Agric. Biol. Chem., 51, 291-292. 9. Kupletskaya M. B., Dolnikova G. A., (1992), Prikadnaja mikrobiologija i biochimija, 28, 50-54. 10. Evans Ch. T., Hanna K., Conrad D., Peterson W., Misawa M., (1987), Appl. Microbiol. Biotechnol., 25, 406-414. 11. El-Batal A. I., (2002), Acta Microbiol. Pol., 51, 139-152. 12. Hoskins J. A., Jack G., Peiris R. J. D., Starr D. J. T., Wade H. E., Wright E. C., Stern J., (1980), Lancet, i, 392-394. 13. Fritz R. R., Hodgins D. S., Abell C. W., (1976), J. Biol. Chem., 251, 4646-4650. 14. Hodgins D. S., (1971), J. Biol. Chem., 246, 2977-2985. 15. Evans Ch. T., Hanna K., Payne Ch., Conrad D., Misawa M., (1987), Enzyme Microb. Technol., 9, 417-421.

BIOTECHNOLOGIA 2 (73) 117-129 2006

127

Iwona Gientka, Stanisaw Baejak, Wanda Duszkiewicz-Reinhard

16. Hamilton B. K., Hsiao H. Y., Swann W. E., Anderson D. M., Delente J. J., (1985), Trends Biotechnol., 3, 64-68. 17. Stryer L., (1997), Biochemia, PWN, Warszawa. 18. Sikorski Z.E., (2000), Chemia ywnoci, WNT, Warszawa. 19. Wang H. P., Fan Y. B., Lu H.-H., Hsu W.-L., (2002), J. Food Drug Anal., 10, 81-87. 20. Gerting H., (1996), ywno a zdrowie, PZWL, Warszawa. 21. Libudzisz Z., Kowal K., (2000), Mikrobiologia techniczna, II, Wyd. P, d. 22. Gumuka W. S. (1996), Encyklopedia zdrowia, PWN, Warszawa. 23. Gob B., Traczyk W. Z., (1997), Anatomia i fizjologia czowieka, Orodek Doradztwa i Szkolenia, d. 24. Ikeda K., Schiltz E., Fujii T., Takahashi M., Mitsui K., Kodera Y., Matsushima A., Inada Y., Schulz G. E., Nishimura H., (2005), Amino Acids. Published online: (28 June). 25. Gamez A., Sarkissian C. N., Wang L., Kim W., Straub M., Patch M. G., Chen L., Striepke S., Fitzpatrick P., Lemontt J. F., ONeill C., Scriver C. R., Stevens R. C., (2005), Mol. Ther., 11(6), 986-989. 26. UK Patent Application GB 2 127 821 A. 27. Jakubke H. D., Jeschkeit H., (1982), Aminokwasy, peptydy, biaka, PWN, Warszawa. 28. Alonso J., Barredo J. L., Diez B., Mellado E., Salto F., Garcia J. L., Cotres E., (1998), Microbiol., 144, 1095-1101. 29. Chmiel A., (1998), Biotechnologia. Podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne, PWN, Warszawa. 30. Adachi O., Matsushita K., Shinagawa E., Ameyama M., (1990), Agric. Biol. Chem., 54(11), 2839-2843. 31. Sato T., Takabe K., Fujita M., (2004), C. R. Biol., 327, 827-836. 32. Retey J., (2003), Biochimica et Biophysica Acta, 1647, 179-184. 33. Calabrese J. C., Jordan D. B., Boodhoo A., Sariaslani S., Vannelli T., (2004), Biochemistry, 36, 11403-11416. 34. Anson J. G., Gilbert H. J., Oram J. D., Minton N. P., (1987), Gene, 58, 189-199. 35. Filpula D., Vaslet C. A., Levy A., Sykes A., Strausberg R. L., (1988), Nucleic Acids Res., 16, 11381. 36. Gilbert H. J., Tully M., (1982), J. Bacteriol., 150, 498-505. 37. Gilbert H. J., Stephenson J. R., Tully M., (1983), J. Bacteriol., 153, 1147-1154. 38. Gilbert H. J. Clarke I. N., Gibson J. R., Stepenson J. R., Tully M., (1985), J. Bacteriol, 161, 314-320. 39. Tully M., Gilbert H. J., (1985), Gene, 36, 235-240. 40. Orum H., Rasmussen O. F., (1992), Appl. Microbiol. Biotechnol., 36, 745-748. 41. Ogata K., Uchiyama K., Yamada H., (1967), Agric. Biol. Chem., 31, 200-206. 42. Wat C.-K., Towers G. H. N., (1977), Recent Adv. Phytochem. Biochem. Plant Phenolics, 12, 371-432. 43. Camm E. L., Towers G. H. N., (1969), Phytochemistry, 8, 1407-1413. 44. Camm E. L., Towers G. H. N., (1977), Prog. Phytochemistry, 4, 169-188. 45. Kurtzman C. P., Fell J. W., (1998), The yeasts a taxonomic study, Elsevier. 46. Barnett J. A., Payne R. W., Yarrow D., (2000), Yeast: Characterisation and identification. Third edition, Cambrige University Pres, UK. 47. Schlegel H. G.,(2001), Mikrobiologia oglna, PWN, Warszawa. 48. Burbianka M., Pliszka A., (1984), Mikrobiologia ywnoci mikrobiologiczne metody badania produktw ywnociowych, PZWL, Warszawa. 49. Aguiar C., Lucas C., (2000), Food Technol. Biotechnol., 38(1), 39-46. 50. Gyaurgieva O. H., Bogomdova T. S., Gorshkova E., (1996), J. Med. Vet. Mycol., 34, 357-359. 51. Alliot C., Desablens B., Garidi R., Tabutean S., (2000), Clin. Oncol. Uk., 12, 115-117. 52. Hsueh P.-R., Teng L-J., Ho S.-W., Luh K-T., (2003), J. Clin. Microbiol., 41, 857-859. 53. US Patent 5,474,117 (1986). 54. Kane J. F., Fiske M. J. (1985), J. Bacteriol., 161, 963-966. 55. Marusich W. C., Jensen R. A., Zamir L. O., (1981), J. Bacteriol., 146, 1013-1019. 56. Takac T., Akay B., Ozdamar T. H., (1995), Enzyme Microb. Technol., 17, 445-452. 57. Chang J., Goo Y. M., Lee Ch. H., Lee Y. Y., Kim K. J., (1994), Bull. Kor. Chem. Soc., 15(5), 387-390. 58. El-Batal A. I., Abo-State M., Shibab A., (2000), Acta Microbiol. Pol., 49, 51-61. 59. US Patent 4,574,117 (1986). 60. Evans Ch. T., Conrad D., Hanna K., Peterson W., Choma Ch., Misawa M., (1987), Appl. Microbiol. Biotechnol., 25, 399-405.

128

PRACE PRZEGLDOWE

Biokonwersja kwasu trans-cynamonowego do L-fenyloalaniny przez drode z rodzaju Rhodotorula

61. 62. 63. 64. 65. 66. 67.

Galabova D., Tuleva B., Spasova D., (1996), Enzyme. Microb. Technol., 18, 18-22. DCunha G. B., Satyanarayan V., Nair P. M., (1996), Enzyme Microb. Technol., 19, 421-427. Evans Ch. T., Choma Ch. Conrad D., Misawa M., (1987), Biotechnol. Bioeng., 30, 1067-1072. El-Batal A. I., (2002), Acta Micobiol. Pol., 51, 153-169. US Patent 1,489,468 (1977). US Patent 6,472,496 (2002). DCunha G. B., Satyanarayan V., Nair P. M., (1996), Enzyme Microb. Technol., 19, 421-427.

BIOTECHNOLOGIA 2 (73) 117-129 2006

129