Istoric

Din antichitate pina in sec. 19 Antonie Van Loewenhoek 1675 -observarea microscopica a "animalculelor" Louis Pasteur: 1857 demonstrarea rolului bacteriilor in fermentatia lactica Felix Archimde Pouchet 1861 sf. Mitului generatiei spontane - Robert Koch : 1877 izolarea Bacillus anthracis, 1882 izolarea Mycobacterium tuberculosis - Christian Gram 1884 : coloratia "Gram" - Ptri 1887 : inventarea cutiei "Ptri" - Fannie Eilshemius-Hesse : descoperirea gelozei nutritive

Secolul 20 Fleming, 1926 lizozimul

Griffith, 1928 Tranformarea bacteriana Fleming, 1929 penicilina G Domagk, 1935 Sulfamidele Avery, 1944 - ADN suportul ereditatii Waksman, 1944 Streptomicina Lederberg & Tatum 1946 Conjugarea bacteriana Lwoff, 1950 fagii si lizogenia Zinder & Lederberg, 1952 Transductia baceriana Watson & Crick structura helicodala a moleculei de ADN Jacob & Monod 1961 Operonul lactozei Acidul nalidixic: 1962 MacDade, 1977 Boala legionarilor (Legionella pneumophila) Anii 80- genetica bacteriana si biotehnologiile

Antrax

Bacillus anthracis

Koch

1876

Gonoree

Neisseria gonorrhoeae

Neisser

1879

Febra tifoida

Salmonella Typhi

Eberth

1880

Tuberculoza

Mycobacterium tuberculosis

Koch

1882

Holera

Vibriocholerae

Koch

1883

Tetanos

Clostridium tetani

Difteria

Corynebacterium diphteriae Nicolaier 1885

Klebs/Loeffler 1883

Diaree

Escherichia coli

Escherich 1885 Pneumonie Streptococcus pneumoniae

Fraenkel

1886

Meningita

Neisseria meningitidis

Weischselbaum 1887 Febra ondulanta Brucella sp.Bruce1887

Gangrena gazoasa Clostridium perfringens Welch et Nuttal 1892 Pesta (ciuma) Yersinia pestis Yersin/Kitasato1894

Coloratia Wayson-aspect in ac de siguranta

Botulism Clostridium botulinum Van Ermengem 1896 Dizenteria Shigella dysenteriae Shiga1898

SifilisTreponema pallidum Schaudin/Hoffmann1905

Tusea convulsiva Bordetella pertussis Bordet et Gengou 1906

Imunohistochimie

Meningita Rickettsia rickettsii Ricketts1909

Diagnosticul bacteriologic
Scopuri - Identificarea agentilor etiologici ai unui proces infectios -Alegerea unei antibioterapii tintite - Controlul eficientei antibioterapiei - Screening-ul purtatorilor sanatosi - Anticiparea unei infectii (colonizari) Abordari - Diagnostic direct +++ (direct in produsul patologic)
Ne-orientat- izolarea si cultivarea pe medii nutritive adecvate a microorganismelor suspectate Orientat de clinician- cercetarea unui agent infectios specific (tehnici imunologice/genetice)

Etapele diagnosticului direct

Examenul microscopic (dupa coloratia Gram) - prelevate normal sterile
morfologie bacteriana caracteristica = orientare rapida LCR si meningococ aprecierea starii de disbioza sau eubioza asociatia fuso-spirochetiana -angina Vincent

prelevate plurimicrobiene

Etapele diagnosticului direct cont.

Examinarea preparatelorlama/lamela
Evidentierea treponemelor la microscopul cu fond negru

Coloratia Ziehl-Neelsen
Evidentierea micobacteriilor (BK, lepra)

Etapele diagnosticului direct cont.

Imunodiagnostic
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) Imuno-fluorescenta directa / indirecta Immunodifuzie

Rapide, sensibile, rezervate bacteriilor cu cultivare dificila (Chlamydia, Clostridium difficile, Mycoplasma)

Etapele diagnosticului direct cont.

Diagnostic molecular - Hibridizare
- PCR (polymerase chain reaction)

Sensibile, foarte specifice, costisitoare, rezervate bacteriilor cu crestere dificila sau lenta (BK, Chlamydia, Bordetella).

Etapele diagnosticului direct cont.

Cultivarea produsului patologic
Izolarea microorganismelor in cultura pura
Medii lichide (utilizate pentru imbogatirea prelevatului) Medii solide (simple,imbogatite, diferentiale)

Etapele diagnosticului direct cont.

Evidentierea caracterelor biochimice
Teste biochimice conventionale Medii multitest Sisteme microtest (Api, ApiRapid miniAPI) Sisteme de identificare automatizate (Vitek, Phoenix,MasterID, Biolog etc)

Rectia catalazei

Rectia oxidazei

Insamintarea mediilor repartizate in placi = tehnica epuizarii ansei

Cultura bacteriana

H2O2

Cultura Microbiana

Banda de hirtie de filtru impregnata cu reativ

Efervescenta Catalaza+

Absenta efervescentei Catalaza-

Violet intens, in maximum 7 secunde (oxidazo+) Incolor sau violet tardiv ( oxidazo-)

Etapele coloratiei Gram Insamintarea mediilor repartizate in tuburi, drepte

(tehnica de intepare cu ansa cu fir drept)

Insamintarea mediilor repartizate in tuburi, inclinate

(tehnica de insamintare in striuri in zig-zag)

Etapele realizarii testelor API

Citire teste conventionale

Geloza singe: -Hemoliza totala (beta) -Hemoliza partiala (alpha) --absenta hemolizei
Medii lactozate: -Mediu MacConkey, EMB: -LF (colonii roz) -LN (colonii incolore) --Mediul ADCL: --LF (colonii galbene) --LN (colonii incolore) Mediu Chapman -crestere bacteriana, mediu roz (halotoleranta, manito-) -Crestere bacteriana, mediu galben (halotoleranta, manito+) -Absenta cresterii (halosesnsibilitate) -Mediu Baird Parker -- colonii negre, lucioase, cu halou opac (colonii coagulazopozitive) --colonii mici, gri sau negre, fara halou (colonii coagulazonegative) -Mediu Simmons: -Verde (Citrat negativ) --Albastru (citrat pozitiv)

Citire Sisteme multitest Citire teste API

Mediu TSI (triple sugar iron): Negru= producere de H2S Fragmentarea coloanei de mediu=prodcere de gaz din glucoza GlcLacZahMediul MILF (mobilitate, indol, LDC, FAD)

API 20E Mediu MIU (mobilitate -James (Kovacs) in Ind Indol, Ureaza) -TDA in TDA --VP1 si VP2 in VP --Nit1, Nit2 si Zn in Glc
API 20 NE -Nit1+Nit2 in NO3

Imob.

Mob.

Imob.

Mob.

(Zn in NO3) -James (Kovacs) in TRP

API 20 STAPH
Glc+ LacZah-NIT 1 +NIT2 in NIT -Zym A +ZYM B in PAL -VP1+VP2 in VP

+FeCl3

Ure+

Ure-

API 20 STREP
-VP1 +VP2 in VP -NIN (10 min) in HIP --ZYM A+ZYMB in: -PYRA -aGAL -bGUR -bGAL -PAL -LAP

+reactiv Kovachs/Ehrlich
Glc+ Laz/Zah+ Vezi mediul lactozat

Inel de precipitat : verde= FAD+, incolor=FAD-

Inel rosu= Ind.+ Inel incolor=Ind-

Glc+ Lac+ Zah+ Banda rosie=Ind+ Banda incolora=Ind-

REALIZAREA ANTIBIOGRAMEI DIFUZIMETRICE

Evidenierea prin teste biochimice a factorilor de virulen i patogenitate la bacterii Insamantare in striuri longitudinale pe:
-Geloza sange (evidentierea hemolizinelor si a factorilor CAMP-like prin trasarea unui striu de S. aureus producator de sfingomielinaza perpendicular pe striurile de cultura la 8 mm distanta).

-Mediu Wagatsuma cu singe de iepure si cristal violet (evidentierea enterotoxinelor Kanagawa) -Mediu cu ADN (evid.entierea DN-azelor) +HCl -Mediu cu TWEEN-80 (evidentierea lipazelor) -Mediu cu ou (evidentierea lipazelor si lecitinazelor) -Mediu cu gelatina (evidentierea gelatinazelor) -Mediu cu cazeina (evidentierea cazeinazelor) -Mediu cu mucina (evidentierea mucinazelor) +Lugol -Mediu cu amidon (evidentierea amilazelor) +Lugol -Mediu cu esculina (evidentierea producerii de esculetolsiderofor) Testul producerii de slime -se insaminteaza o ansa plina de cultura in bulion, se incubeaza 24 h, se golesc tuburile, se coloreaza cu safranina alcoolica 30 min, se evidentiaza tulpinile producatoare de slime prin aparitia unui inel rosu pe

Examinarea prelevatelor din cavitatea bucala

Context
Angina acuta

Principalele obiective
Izolare de Streptococcus pyogenes (grup A) si de streptococci -hemolitici din grupele C si G. Daca angina este insotita de o iritatie cutanata: Streptococcus pyogenes si Arcanobacterium haemolyticum (mai ales la adultul tanar). In cazul anginei recidivante se analizeaza suplimentar: H. influenzae, S. aureus, Moraxella (Branhamella) catarrhalis

Angina ulcero-necrotica

Se evidentiaza asociatia de fusospirochete caracteristica anginei Vincent

Angina cu membrane false Candidoza orofaringiana Bilantul initial al unei boli cu transmitere sexuala Pneumonie interstitiala Flegmon amigdalian

Izolare Corynebacterium diphtheriae Izolare Candida albicans Izolare de N. gonorrhoeae Izolare de Chlamydia pneumoniae Examen citobacteriologic al produsului obtinut prin punctie cu analize pentru S. pyrogenes, H. influenzae, S. aureus, anaerobi (Fusobacterium spp., B. fragilis, Peptostreptococcus spp.)

1 Prelevare si transport inaintea tratamentului local sau general cu antibiotic prelevarea cu tamponul de pe amigdale (sau amigdala in cazul amigdalitei unilaterale) si de pe valul palatin si partea posterioara a faringelui. 2 tampoane:
etalarea pe lama insamantare.

Daca insamantarea nu se realizeaza in maxim 2 ore se foloseste un mediu de transport tip Stuart sau Amies.

Aspecte particulare: ulceratie sau exudat -prelevarea se face de la nivelul lor suspiciune de difterie sunt prelevate si membranele false Pentru N. gonorrhoeae daca nu se poate realize imediat insamantarea este indispensabila folosirea unui mediu de transport tip Stuart sau Amies Pentru Candida recoltarea se efectueaza de la nivelul limbii, palatului si fetei interne a obrajilor.

2 Examen direct Examenul microscopic dupa coloratia Gram :

Semnalizarea prezentei sau absentei leucocitelor, indicatori ai inflamatiei Evidentierea asociatiei fuso-spirochete caracteristica anginei Vincent Eventualul sumar al florei (calitativ si cantitativ)

Cultura
Angina acuta sau context bine definit Geloza sange sau geloza sange cu inhibitori incubata in atmosfera cu 10% CO2 sau anaerobioza. Anaerobioza este recomandata pentru o mai buna evidentiere a -hemolizei. Angina cu iritatie cutanata Evidentierea de Arcanobacterium haemolyticum (bacil Gram pozitiv coryneform) se poate realiza pe geloza sange, inse trebuie prelungita incubarea cu 24-48 ore pentru a se putea evidentia zona de -hemoliza care se formeaza in jurul coloniilor cu un aspect asemanator streptococului.

A. haemolyticum Alte contexte H. influenzae geloza cu sange tratat termic sau geloza chocolat imbogatita cu polivitamine, incubata in atmosfera cu 10% CO2 cu sau fara bacitracina. S. aureus geloza sange sau geloza simpla. M. catarrhalis se dezvolta si pe medii uzuale, insa creste mai repede pe geloza chocolat N. gonorrhoeae geloza chocolat imbogatita cu polivitamine si un inhibitor (tip VCAT) si incubata atmosfera cu 10% CO2 C. diphtheriae mediu Loeffler sau Tinsdale modificat C. albicans mediu Sabouraund cu cloramfenicol sau gentamicina incubat la 300C.

M. catarrhalis M. catarrhalis

Interpretare antibiograma In cazul unei angine acute recidivante sau nu, singurul patogen recunoscut este Streptococcus pyogenes (grup A). La comunicarea analizei microoganismelor potential patogene se fac evaluari semicantitative. Nu se mentioneaza prezenta bacteriilor din flora comensala. Streptococcus pyogenes indiferent de cantitatea in care se regaseste, se analizeaza cel putin pentru penicilina G, eritromicina, lincomicina, tetraciclina. Streptococii din grupurile C si G, cand sunt izolati in cantitati semnificative A. haemoliticum N. gonorrhoeae In celelalte cazuri realizarea antibiogramei depinde de cantitatea de microorganisme izolata. In cazul anginei recidivante unde rolul H. influenzae si M. catarrhalis nu este clar stabilit, este necesara pentru aceste doua bacterii detectarea de betalactamze

EXAMENUL CITOBACTERIOLOGIC AL URINII (ECBU)

Prelevare si transport
caz general pacient sondat la domiciliu imunodeprimati analiza pentru mycobacterii sugar circumstante particulare Urina din primul jet (dupa un eventual masaj prostatic) suspiciune de infectie uretrala sau prostatica detectie de Mycoplasma sau Chlamydia trachomatis prin biologie moleculara. Prelevare prin punctie suprapubiana dupa dezinfectia tegumentului Prelevare prin cateter uretral permite obtinerea de urina separat din rinichiul drept sau stang ureterostomie

Etiologia ITU

Enterobacterii (mai ales E. coli, Proteus mirabilis)

Mai rar Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, S. saprophyticus (la tinere).

+ Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, Staphylococcus coagulazo-negativ, Corynebacterium urealyticum (vechiul grup D2), Candida spp (albicans si glabrata), mai rar: Oligella urethralis, Aerococcus urinae, Lactobacillus spp

Examen citologic
cantitativ
Camera de numarare stare fiziologica, urina contine sub 10 000 leucocite si 5 000 hematii per ml.

Infectiei urinara =proces inflamator:

>50 000 leucocite/ml >10 000 hematii/ml Celule uroepiteliale frecvente

calitativ
Examinarea frotiurilor realizate permite observarea eventualelor microorganisme prezente si orientarea catre alegerea mediilor de cultura in functie de morfologia si afinitatea lor tinctoriala.

Cultivare
Urocultura=examen bacteriologic cantitativ diluarea urinii tehnica ansei calibrate metoda lamei imersate

Insamintare
mediu lactozat (CLED), geloza singe, geloza chocolat

Bacteriurie <103 UFC/ml absenta infectiei Bacteriurie >105 UFC/ml posibila infectie 103 si 104 UFC/ml incertitudine (se repeta)
Interpretarea rezultatelor ECU Bacteurie Colonizare Infectie asimptomatica Infectie simptomatica Inflamatie fara infectie Simptome fara infectie *in unele circumstante + + + Piurie + + + Simptome + + Tratament +* +

Interpretare bacterio-clinica Categorii Criterii microbiologice

Infectie urinara acuta fara complicatii la femeie

Pielonefrita acuta simpla ITU cu risc sau complicate Bacterurie asimptomatica (controlata prin 2 ECU)

10 000 L/ml 103 UFC/ml uropatogeni recunoscuti

10 000 L/ml 104 UFC/ml uropatogeni recunoscuti 10 000 L/ml 105 UFC/ml uropatogeni recunoscuti 10 000 L/ml 105 UFC/ml

Examenul secretiilor si exudatelor ano-genitale

OBIECTIVE
Identificarea microorganismelor patogene Diagnosticul infectiilor tractului genital si al vaginozelor dezvoltate datorita comensalilor Diagnosticul infectiilor cu transmitere sexuala Orientarea antibioterapiei, alegerea antibioticelor, supravegherea tratamentului si a vindecarii. Prevenirea bolilor cu transmitere sexuala (BTS) Microorganisme ale cailor genitale feminine Microorganisme patogene intotdeauna Microorganisme eventual patogene Candida albicans Gardnerella vaginalis Mobiluncus spp Mycoplasma, Ureaplasma Staphylococcus aureus comensale Microorganisme patogenitate cunoscuta Lactobacillus Corynebacterium Neisseria gonorrhoeae alte decat fara

Neisseria gonorrhoeae Chlamydia trachomatis Trichomonas vaginalis Herpes virus

Staphylococcus non aureus

Gardnerella vaginalis Mobiluncus

Streptococcus spp

Bacterii strict anaerobe

Enterobacterii

Papillomavirus

PRELEVARE SI TRANSPORT

Pentru ambele sexe

uretrite:
Prelevat endo-uretral cu tamponul Chlamydia pentru detectarea ei este preferabila o raclare endo-uretrala. recoltarea serozitatilor se va efectua de la nivelul bazei sau marginii ulceratiei cu un vaccinostil, o chiureta sau un tampon biopsiile sau punctia ganglionului satelit se poate realiza de preferinta la cabinetul medicului sau spital colectarea continutului cu seringa sau tamponul

ulceratii ano-genitale: Pustule: Recoltarea primului jet de urina este de interes in cazul uretritelor, in particular pentru a determina Chlamydia prin tehnici de biologie moleculara. Prelevate anale (eventual orofaringiene) - util diagnosticului in cazurile de BTS.

Prelevate de tract genital feminin

vulvo-vaginite -recoltarea cu tamponul a secretiilor din orificiul vaginal si vestibul vaginal posterior bartolinitele - aspirarea cu seringa din canal sau prelevarea cu tamponul. cervicite - recoltare cu tamponul din endocol si se analizeaza intotdeuna la acest nivel gonococul si Chlamydia. endometrite - prelevat din endocol si eventual aspirarea transcervicala prin cateter . anexite -lichidul abcesului este prelevat cu seringa si celulele tubo-peritoneale prin periere in cadrul unei interventii chirurgicale. material intra-uterin

Prelevate de tract genital masculin

epididimite si prostatite - tamponarea uretrala, prelevarea spermei sau recoltarea primului jet de urina. prostatite - secretii prostatice dupa eventualul masaj al prostate si/sau primul jet de urina. orhite se punctioneaza abcesul cu seringa . Agentul responsabil poate fi regasit si in sperma. In toate cazurile, prelevatele trebuie sa permita examinarea directa si insamantarea (doua tampoane).

Transportul prelevatelor
Daca prelevarile nu sunt efectuate in laborator, probele trebuiesc transportate rapid prin medii de transport adecvate( gonococ, Chlamydia, Mycoplasma, virus).

Examenul citobacteriologic direct al prelevatelor in functie de contextul clinic

Ulceratii:
Examen extratemporaneu la microscop cu fond negru al serozitatii sancrului permite evidentierea de Treponema pallidum. Se poate folosi imunofluorescenta directa, impregnarea cu argint sau coloratia Vago. Coloratia May-Grundwald-Giemsa a frotiurilor realizate din serozitatile unui sancru evidentiaza bacilli care evoca Haemophilus ducreyi, stiind ca aceasta bacterie este putin colorabila prin metoda Gram Posibilitatea existentei unei ulceratii externe de tip herpetic in raport cu o infectie cu Chlamydia (boala Nicolas-Favre) sau Mycoplasma. In mod exceptional se pot evidential corpii lui Donovan ( Calymmatobacterium granulomatis sau donovani) intr-un granulom inghinal survenit la 2-3 luni dupa un raport contaminant.

Haemophilus ducreyi

Calymmatobacterium granulomatis sau donovani

Uretrite, cervicite si vaginite:

Cel mai frecvent vaginitele sunt determinate de Candida albicans, Trichomonas vaginalis si bacteriile care detemina vaginoza. Sistematic se investigheaza N. gonorrhoeae si Chlamidia trachomatis in uretrite si cervicite Candida albicans - asimptomatice. Prin preparat proaspat lama-lamela se poate observa daca exista Trichomonas vaginalis sau Candida albicans (ultima este mai bine evidentiata prin dilutia prealabila in potasiu 10% si vizualizare cu contrast de faza). Coloratiile May-Grundwald-Giemsa si eventual Papanicolaou permit studiul etiologic indispensabil: prezenta polinuclearelor, a celulelor vaginale, clue-cells din vaginoza, Trichomonas vaginalis, si mai rar evidentiaza celule care prezinta incluzii ale infectii cu Chlamydia trachomatis. Coloratia Gram permite diagnosticul gonoreei, a candidozei determinate de Candida albicans, si mai ales studiul florei bacteriene vaginale si echilibrul sau care poate fi incadrat intr-un scor de la I la IV (scor I flora echilibrata, scor IV flora complet substituita) In vaginoza bacteriana se observa dezechilibrul florei comensale in favoarea anaerobilor sau Gardnerella vaginalis, scor 3 sau 4 Chlamydia trachomatis poate fi observata prin tehnica imunofluorescentei.

In alte localizari examenul direct determina: Neisseria gonorrhoeae, Candida albicans, Chlamydia trachomatis.

Cultivarea
nu se poate realiza pentru Treponema palidum pentru Haemophilus ducreyi este foarte dificila (pe geloza cu sange tratat termic sau proaspat). Prelevatele se insamanteaza cel putin pe: Geloza cu sange tratat termic cu si fara inhibitori pentru izolarea de Neisseria gonorrhoeae incubat in atmosfera de 10% CO2 Geloza sange pentru determinarea diferitelor bacterii Gram pozitive precum Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus. Izolarea de Gardnerella vaginalis pe geloza cu sange uman nu are semnificatie decat daca este insotita de o apreciere semicantitativa. Gardnerella - asociere cu Mobiluncus spp Geloza lactozata este utila pentru izolarea diferitelor bacteria Gram negative, in particular enterobacteriile care nu sunt luate in consideratie in cazul uretritelor si vaginitelor. In cazul unei recomandari explicite: Culturi celulare pentru a se izola Chlamydia trachomatis. medii artificiale imbogatite cu ser de vita si extract de levuri pentru Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum. Geloza sange cultivata in anaerobioza pentru endometritele postpartum sau dezvoltate pe dispozitive intrauterine pentru a determina Prevotella. Medii speciale pentru micobacterii in cazul endometritelor (rare), epididimitelor cu Mycobacterium tuberculosis. Biologie moleculara: Se realizeaza mai ales pentru Chlamydia. Antibiograma: Se realizeaza in mod sistematic in infectiile endocervicale ale aparatului genital superior pe germenii patogeni izolati, pe tulpinile de gonococ cu determinarea producatorilor de betalactamaze. Nu se realizeaza pe bacteriile care colonizeaza in mod normal aparatul genital in special la femeie exceptie facand streptococul de grup B in cursul celui de-al treilea semestru de sarcina pentru a se preveni posibilitatea unei infectii neonatale.

EXAMENUL BATERIOLOGIC AL SPERMEI

Obiective: Diagnosticul unei infectii genital la nivel superior (orhi-epididimita, prostatita) pentru diferentierea germenilor patogeni in cazul unei eventuale contaminari cu microbiota comensala Controlul calitatii spermei in cazul fecundarii in vitro Context: Majoritatea infectiilor genitale survin la adulti tineri care au activitate sexuala si de obicei sunt corelate cu o maladie cu transmitere sexuala. In cazul unui subiect sondat, care prezinta o anomalie sau o tumoare a tractului genitourinar, sau un context favorabil (varsta, diabet, imunodepresie), spermocultura poate diagnostica o prostatita sau o epididimita datorata unor germeni oportunisti. Trebuie avuta in vedere si posibilitatea unei infectii tuberculoase inaintea unei epididimite subacuta sau cronica, in special la un subiect cu antecedente de tuberculoza sau purtator la nivelul altor situsuri. Prelevare: In mod clasic prelevarea se realizeaza dupa o abstinenta de 3 zile, sau dupa o mictiune urmata de o dezinfectie atenta a glandului cu un antiseptic si clatire cu apa. Recoltarea se realizeaza intr-un flacon steril cu deschidere mare. Este preferabila recoltarea intr-un laborator si realizarea extemporanee a examenului bacteriologic datorita sensibilitatii N. gonorrhoeae la var de temperatura. Daca acest lucru nu este posibil transportul in laborator trebuie sa fie rapid, iar proba mentinuta la 370C.

Examenul bacteriologic al spermei

Examen direct
In functie de orientarea clinica si epidemiologica Examenul citologic pe produsul proaspat depistarea de levuri sau paraziti (Trichomonas vaginalis, mult mai rar oua de Schistosoma). Coloratia Gram - observarea de N. gonorrhoeae, levuri (Candida albicans), coci Gram pozitivi sau bacilli Gram negativi notarea absentei sau prezentei polinuclearelor. Geloza cu sange tratat termic fara inhibitori incubate in mediu imbogatit cu CO2 pentru Neisseria gonorrhoeae. Geloza sange pentru diferitele bacteria Gram pozitive Staphylococcus aureus, S. epidirmidis, Streptococcus ssp, Enterococcus ssp. Geloza lactozata pentru bacterii Gram negative, in special Enterobacterii. Gardnerella vaginalis este rareori izolata in cultura pura pe geloza cu sange uman in prostatitele subacute si cronice. Caracterul monomorf al culturilor este in favoarea unei infectii la fel ca si prezenta anumitor precum Corynebacterium seminale.

Insamantare pe:

La recomandare speciala: Culturi celulare Chlamydia trachomatis. Medii sintetice imbogatite cu ser si extract levuric pentru izolarea si numaratoare de Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum. Medii pentru micobaterii petru diagnosticul unei epididimite sau prostatite cu Mycobacterium tuberculosis. Biologie moleculara Tehnicile de amplificare genica sunt utilizate in special pentru determinarea de Chlamydia trachomatis mai ales in cadrul inseminarilor in vitro. Este necesara folosirea unui martor de amplificare datorita frecventei inhibitorilor prezenti in sperma (5-10%). Antibiograma Se realizeaza pentru speciile izolate Se investigheaza producerea de betalactamaze pentru tulpinile de gonococ.

Coprocultura
Principalele microorganisme care determina diaree Bacterii Salmonella, Shigella, Campylobacter, Yersinia, EPEC, ETEC, EHEC, EIEC, Vibrio, Aeromonas, Staphylococcus, Bacillus, Clostridium Rotavirus, Adenovirus, Astrovirus, Calicivirus, Coronavirus, virusul Norwalk Entamoeba, Giardia, Cryptosporidium, Balantidium Schistosoma, Strongyloides, Necator, Trichuris, Trichinella Isospora, Ancylostoma,

Virusuri Protozoare Helminti

Contexte minimale. Obiective

Adult sau copil peste doi ani si context bine definit: Realizarea unei coproculturi standard cu accent pe Salmonella spp., Shigella spp., Campylobacter spp. Copil mai mic de 2 ani: Realizarea unei coproculturi standard cu accent pe E. coli enteropatogen stiindu-se ca la aceasta categorie predomina etiologia virala. Context epidemic-clinic particular:
Notiunea de voiaj recent intr-o tara tropicala Bolnavi aflati sub tratament cu antibiotic Toxiinfectie alimentara colectiva
Toxiinfectii alimentare cu perioada de incubare scurta (1-4 ore) non-febrile datorita S. aureus si B. cereus. Toxiinfectii alimentare cu perioada de incubare lunga (12-72 ore) datorita Salmonella spp., Y. enterolitica, C. perfringens si C. botulinum

Pacienti cu HIV (SIDA) Sindrom hemolitic si uremic Intoxicatie alimentara Sindrom holeric Detectarea colonizarii de bacterii mutirezistente Determinarea starii de purtator la personalul cu risc

Obiective: determinarea microorganismelor patogene responsabile de diaree. Coprocultura se realizeaza pe produse lichide, moi, mucilaginoase sau hemoragice si doar la indicatii foarte precise pentru cele solide. Evidentierea toxinelor produse Clostridium difficile, Clostridium perfringeres) Cercetarea prezentei in scaun a unei bacterii nosocomiale (de ex. Pseudomonas aeruginosa la nou-nascuti) sau rezistente la antibiotice (enterococ rezistent la vancomicina sau enterobacterie producatoare de betalactamaza de spectru larg). Determina portajului cronic Determinarea etiologiei diareei la pacientii infectati cu HIV
bacterii responsabile de diaree acuta banala virusuri de tip CMV, HSV, HIV protozoare, precum Entamoeba histolityca, Isospora belli, Giardia intestinalis Cryptosporidii, Microsporidii

Examenul microscopic
Orientarea culturilor

germeni invazivi - prezenta leucocitelor (Salmonella spp., Shigella spp., Campylobacter spp.) germeni enterotoxigeni leucocite absente (V. cholerae, Aeromonas spp., C. difficile)

Examenul frotiurilor colorate Gram:

aprecierea procentajului celor doua tipuri tinctoriale. Microbiota echilibrata este formata in majoritate de bacilli Gram negativi insa sunt prezenti intotdeauna si bacilli Gram pozitivi. Orice perturbare notabila a acestui elichibru trebuie semnalata.

Cultivarea
Adult sau copil peste 2 ani si context bine definit Salmonella si Shigella.
mediu selectiv de izolare (geloza SS, XLD, DCL, Hektoen) mediu de imbogatire (3-6h) pentru Salmonella (bullion Mueller-Kauffmann, Selenit)

Campylobacter spp.
mediu specific (Karmali, Skirrow sau Buztler). Culturile sunt incubate minim 48 ore in mediu microaerofil.

Yersinia enterolitica nu se analizeaza decat la copiii ai caror scaune sunt diareice sau la adulti intr-un context de poliartrita reactionala.
mediu de imbogatire (mediu Rapapport), incubare 24-48 ore la +40C si repicare pe medii specific pentru Yersenia mediu Wauters (geloza SS imbogatita cu dezoxicolat) mediu Irgasan-cefsulodin si novobiocin incubate pana la 48 ore la 300C.

Copil sub 2 ani EPEC

medii tip EMB sau Drigalski.

Contexte epidemico-clinice particulare Notiunea de calatorie recenta in tarile tropicale si sindrom holeriform V. cholerae - imbogatire in apa peptonata alcalina si repicare la fiecare 3 ore pe mediu gelozat specific (de ex. TCBS) Aeromonas spp pe geloza sange cu adaos de ampicilina Bolnavi aflati sub tratament cu antibiotic Clostridium difficile - punerea in evidenta a toxinei B in filtratele de scaun prin determinarea efectului citopatogen pe culture celulare (fibroblaste, cellule Vero, MRC-5, Mac Coy). Citirea se face dupa 24-48 de ore.
metode rapide imunoenzimatice pentru detectia rapida de toxina A sau de toxina A si B cand rezultatele se citesc in maxim 3 ore.

Sindrom hemolitic si uremic Izolarea de E. coli O157 se realizeaza pe geloza MacConkey cu sorbitol, coloniile sorbitol (-) sunt agglutinate pe latex. Intoxicatie alimentara (de exemplu suspiciune de botulism) Aceasta patologie nu necesita tehnici de coprocultura ci cercetare si tipizarea toxinei din serul bolnavului si din alimentele suspectate.

Determinarea colonizarii de catre bacteria multirezistente la antibiotic Enterococcul rezistent la vancomicina este izolat pe geloza tip bila esculina cu 6mg/l de vacncomicina.
Bacteriile producatoare de betalactamaze de spectru larg sunt selectionate pe mediu Drigalski cu 0,5-1 mg/l cefotaxim. Antibiograma In toate cazurile este necesara realizarea antibiogramei pentru toate bacteriile izolate din coprocultura. Antibiograma este imperativ necesara pentru Salmonella, Shigella, E. coli, V. cholerae.

Examenul citochimic si bacteriologic al lichidului cefalorahidian

LCR normal aspect macroscopic apa de izvor (limpede) <5 elemente/mm3 (NB: la nou nascuti 10-30 elemente/mm3 (50% PMNN) proteinorahie normala (< 0.4g/l) Meningite comunitare: glicorahie normala (>60% fata de glicemie) LCR purulent Adulti si copii >5 ani : - aspect microscopic orienteaza spre o meningita purulenta cand S. pneumoniae lichidul este tulbure (200 globule albe/mm3). N. menigitidis - mai mult de 10 elemente/mm3din care 50% polinucleare Listeria monocytogenes - proteinorahie >0.4 g/l Sugari si copii <5ani - hipoglicorahie < 40% fata de glicemie S. pneumoniae LCR limfocitar N. menigitidis > 10 elemente/mm3din care 50% limfocite H. influenzae proteinorahie >0.4 g/l Nou-nascuti hipoglicorahie < 40% fata de glicemie =>se suspecteaza etiologie Streptococcus agalactiae bacteriana : Listeria, BK insostita de hipoclorurorahie) E. coli daca normoglicorahia este >50% decat glicemia si mai putin de 100 L. monocytogenes elemente/mm3 => se suspecteaza etiologe virala Meningite nosocomiale LCR panache (neurochirurgicale, > 10 elemente/mm3 ; % polinucleare = % limfocite imunodeprimati) S.aureus sau S. epidermidis proteinorahie si glicorahie normala se poate suspecta: listerioza, meningita purulenta sau o menigita S. pneumoniae limfocitara la debut, abces cerebral Enterobacteriaceae LCR hemoragic Pseudomonas Contaminarea LCR cu globule rosii se poate datora unui traumatism aparut in timpul punctiei lombare sau unei hemoragii subarahnoidiene (asociata unei pleiocistoze si uneori cu hipoglicorahie).

Orientarea etiologica rapida

Examenul microscopic al frotiurilor Gram
Prezenta/absenta bacteriilor, unor amibe libere (Naegleria fowler i) Tipul morfologic, afinitate tinctoriala (coci, bacili, Gram +/-) Prezenta capsulei localizarea intra-/extraleucocitara.

Investigarea prezentei antigenelor solubile in LCR

metoda latex aglutinarii

Meningita comunitara la adult/copil

coci Gram +: S. pneumoniae bacili G - : H. influenzae coci G - : N. meningitidis

Meningita la nou-nascuti
coci Gram +: S. agalactiae bacili G - : E. coli K1

Meningita limfocitara la imunodeprimati (SIDA)

Cryptococcus neoformans

LCR limfocitar cu hiperproteinorahie, hipoglicorahie si hipoclorurahie = meningita tuberculoasa.

- investigarea BAAR prin examen microscopic - insamantarea pe mediu de cultura specific M. tuberculosis - confirmare cu o tehnica de amplificare molecura

LCR hipercelular cu frecvente polinucleare,crestere bacteriana absenta

Tratament cu antibiotice Etiologie cu bacterii greu cultivabile (Leptospira, Borelia)

Antibiograma direct din LCR

Cultivarea
Sistematica pentru toate tipurile de LCR Medii imbogatite
geloza sange suplimentata cu factori de crestere, incubare la 370C in atmosfera de 5-10% de CO2 geloza sange, incubare la 370C in atmosfera de 5-10% de CO2 mediu pentru anaerobi, incubare la 370C in anaerobioza bulion cu extract globular (facultativ) permite diluarea antibioticului prezent in LCR

Incubare 18 48h -5 zile la 370C Circumstante particulare:

meningita limfocitara la imunodeprimati (SIDA)
geloza Sabouraud

meningita limfocitara, hipoglicorahie si suspiciune de tuberculoza

mediu Lowenstein-Jensen (insamantare in 3 tuburi si imbogatire daca este posibil) sau alt mediu specific

Antibiograma H. influenzae
investigarea beta-lactamazelor N. meningitidis investigarea beta-lactamazelor (in cazuri exceptionale) investigarea sensibilitatii scazute la penicilina G prin masurarea diametrului zonei de inhibitie obtinut in jurul discului de oxacilina si prin determinarea CMI gruparea antigenica trimiterea catre un centru de referinta S. pneumoniae detectarea rezistentei la beta-lactamine cu ajutorul discului de oxacilina si determinarea CMI la penicilina G, amoxicilina, cefotaxim si cetriaxona

Examenul bacteriologic al lichidelor de punctie (lichide serice, infectate)

Supuratie hepatica
Enterobacteriaceae Anaerobi Streptococcus milleri S. aureus Enterococcus sp.

Peritonita primara (primitiva)

Peritonita secundara (infectie biliara sau abces)

Streptococcus pneumoniae Escherichia coli

Enterobacteriaceae Streptococi Anaerobi Enterococcus spp. Yersinia pseudotuberculosis Yersinia enterocolitica Salmonella spp Streptococcus milleri Enterobacteriaceae Enterococcus spp Anaerobi Streptococcus pnemoniae S. aureus Haemophilus influenzae Anaerobi S. aureus S. aureus Enterobacteriaceae P. aeruginosa S. aureus Neisseria gonorrhoeae Enterobacteriaceae Streptococcus spp. Haemophilus influenzae Borrelia burgdorferi P. aeruginosa S. aureus Stafilococi coagulazo-negativi Peptostreptococcus

Supuratie intestinala

Peritonita post-chirurgicala

Pleurezie

Osteomielita la copil Osteomielita si spondilodiscita

Artrita profunda

Infectii ale protezelor articulare

Metode bacteriologice
Examenul direct
in situatia unei cantitati de lichid este mica (sau in cazul punctiilor chistilor) : se realizeaza coloratie Gram; in situatia unei cantitati suficiente de lichid
se realizeaza o numaratoare si formula elementelor figurative; coloratie citologica (pentru determinarea celulelor neidentificabile) coloratie Gram

Cultivarea
centrifugarea lichidelor interne la 1500g 30 min (expunere la oxigen !!!!(efect nefast asupra anaerobilor) si risc mare de contaminare) insamantare in bulion imbogatit (tip cord - creier)
incubare in anaerobioza la 370C (in medie 4 zile, iar pentru lichidele articulare 10 zile) si observare zilnica.

insamantare in bulion pentru anaerobi pentru izolarea aerobilor: geloza sange; - mediu selectiv pentru bacterii gram negative; - geloza chocolat incubare in atmosfera de CO2 la 350C ( in functie de context se foloseste geloza BCYE pentru Legionella; mediu cu Tween pentru corynebacterii) In functie de contextul clinic (imunodeprimati, antecedente de tuberculoza), se utilizeaza:
mediu Sabouraud pentru levuri, Aspergillus (incubare la 22 -300C) mediu de cultura pentru Mycobacterium (incubare 8 saptamani) mediu de cultura pentru Nocardia (10 zile)

Interpretarea culturilor
comparatie intre rezulatele obtinute in cultivare aeobe si cele ale cultivarii anaerobe. Mediile solide sunt examinate la 24h si la 48h. Mediile lichide sunt incubate, rezultatul nefiind considerat negativ nici dupa a 10 zi de incubare mai ales in cazul lichidelor de punctie articulara. Pentru aceste lichide un pozitivarea culturii exprima o infectie, dar lipsa dezvoltarii in cultura nu exclude existenta bacteriei in cantitati reduse/necultivabile in acest situs. Prezenta unei culturi mixte (>3 specii microbiene, nici unul nefiind predominant) impune identificarea tuturor speciilor izolate, realizandu-se o comparatie si cu simptomatologia pacientului.

Antibiosensibilitatea
Se realizeaza determinarea CMI sau CMIs pentru moleculele folosite in mod frecvent in tratament

Examenul bacteriologic al prelevatelor oculare

1. Obiective izolarea si identificarea agentului bacterian/fungic implicat in etiologia infectiei oculare stabilirea terapiei infectiei prevenirea infectiilor post-operatorii izolarea agentului etiologic;

localizarea infectiei la nivelul segmentului anterior conjunctivite - keratite - uveite anterioare/iridociclite - la nivelul segmentului posterior corioretinite si retinite - endoftalmite si panoftalmite - infectii perioculare contextul epidemiologic etiologia infectiilor oculare pot varia cu:
varsta statusul imuniatar (imunodeficienta) zona geografica

Potentiali patogeni Bacterii Gram + Comensali Potentiali patogeni Bacterii Gram Comensali Localizare Conjunctivita Context habitual S.aureus, S. pyogenes, S.pneumoniae, N.gonorrhoeae, Moraxella spp, enterobacterii

S. aureus, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecalis

Infectii postoperatorii

S. epidermidis, Corynebacterium sp., Propionibacterium acnes, Streptococcus spp. Enterobacterii (Serratia, Klebsiella, Proteus, Enterobacter), P. aeruginosa, Haemophilus, Moraxella, Acinetobacter Moraxella catarrhalis, Neisseria spp Context special H.influenzae, Adult imunodeprimat: Pseudomonas, enterobacterii, levuri Batrani si copii: N.gonorrhoeae, S.aureus, S.pyogenes, C.trachomatis, P.aeruginosa Africa si tarile in curs de dezvoltare: M.tuberculosis, C.diphtheriae, N.gonorrhoeae, Haemophilus aegyptius, C. trachomatis Copii <5ani : H.influenzae Imunodeprimati sau diabetici: bacterii anaerobe si levuri

Celulite profunda

S.aureus, S. pyogenes, S.pneumoniae, P.aeruginosa

Infectii oculare Celulite cronice

Dacrioadenite dacriocistite Canaliculite si

S.aureus, S. pyogenes, S.pneumoniae, P.aeruginosa, Mycobacterium Nocardia, Actinomyces, Aspergillus Profunde: S.aureus, S. pyogenes, S.pneumoniae, H.influenzae Propionibacterium propionicus Cronice: M. tuberculosis, M. leprae Nocardia, T.pallidum, levuri

Blefarite Keratite

S.aureus, S. epidermidis, uneori Moraxella spp. S.aureus, S.pneumoniae, P.aeruginosa, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Citrobacter, Proteus, uneori micobacterii atipice, levuri, Aspergillus Aceeasi germeni ca in cazul keratitelor, adaugandu-se: N. meningititdis, Bacillus cereus, enterococi, SCN si levuri

Demodex Purtatori de lentile de contact: amibe libere, Acanthamoeba, Naegleria

Endoftalmite

Prelevare - de catre medicul oftalmolog

- inainte de o toaleta facila riguroasa - la nivelul unghiului intern al ochiului - cu un tampon steril Mai rar, in cazul:
blefaritelor (se preleva cruste palpebrale, 1-2 gene cu pensa sterila) orgeletului (se preleva cu un ac de seringa steril pruoiul) dacriocistitei (se preleva pruoiul de la nivel punctelor lacrimale palpebrale, prin presarea sacilor lacrimali) ulcerului corneean (se preleva cu ajutorul unui tampon dupa efectuarea unei anestezii locale)

Transportul
mediu pentru Chlamidia mediu Stuart pentru alte specii bacteriene

Examenul direct
Nu se realizeaza in cazul prelevatelor recoltate inainte de interventia chirurgicala oculara. Pentru alte prelevate se pot realiza :
frotiu colorat Gram permite descrierea florei dominante frotiu colorat Giemsa permite descrierea asptectului citologic (prezenta polinucleare) pentru evidentierea bacteriei Chlamidia trachomatis prin imunofluorescenta preparat proaspat pentru evidenterea amibelor libere la pacientii purtatori de lentile de contact

Prelevate pre-operatorii
In acest caz se evidentiaza bacterii patogene in proportie de 25-30% cazuri:
bacterii Gram pozitive cele mai frecvente (75-80%): S. aureus, S. pneumoniae, Enterococcus faecalis; bacterii Gram negative: enterobacterii (Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus), P.aeruginosa, Haemophilus, Moraxella spp., Acinetobacter La purtatorii de lentile de contact predomina bacteriile Gram negative. Bacteriile florei comensale prezinta o importanta deosebita in cazul pacientilor imunodeprimati, devenind oportuniste : S. epidermidis, Propionibacterium acnes, Streptococcus spp., Moraxella catarrhilis, Neisseria spp.

Antibiograma se realizeaza numei pentru bacteriile cu potential patogen

Alte prelevate
geloza sange/ sange tratat termic, incubare in atmosfera de CO2, la 350C. In functie de contextul clinic si epidemiologic se utilizeaza alte medii;
culturi de celule pentru izolarea Chlamidia trachomatis bulion /geloza sange in anaerobioza mediu Sabouraud pentru levuri si Aspergillus, incubare 22-300C medii de cultura specifice pentru Mycobacterium si Nocardia (incubare 8 saptamani in atmosfera de CO2 la 350C) medii de cultura pentru amibe libere

Rezultate estimate: Conjunctivite: S.aureus, S. pyogenes, S. pneumoniae, H. influenzae, N. gonorrhoeae, enterobacterii, Moraxella spp;
Adulti imunodeprimati: Pseudomonas, enterobacterii, levuri Copii si batrani: N.gonorrhoeae, S.aureus, S.pyogenes, C.trachomatis, P.aeruginosa Context epidemiologic particular (Africa si tarile in curs de dezvoltare)
M.tuberculosis, C.diphtheriae, N.gonorrhoeae, Haemophilus aegyptius C. trachomatis este responsabila de trahoma (serotip A,B si C) si de conjunctivita cu incluzii (serotip D si K). Diagnosticul se realizeaza prin examen direct sau cultivare.

Alte infectii oculare

Celulite profunde : S.aureus, S. pyogenes, S.pneumoniae, P.aeruginosa; la copii<5 ani: H.influenzae; imunodeprimati sau diabetici: bacterii anaerobe si levuri Celulite cronice: S.aureus, S. pyogenes, S.pneumoniae, P.aeruginosa, H.influenzae, Mycobacterium, Nocardia, Actinomyces, Aspergillus Dacrioadenite si dacriocistite: glandele lacrimale prezinta rareori infectii profunde, sacul lacrimal se poate infecta prin blocarea cailor de curgere a lacrimilor. Se izoleaza: S.aureus, S. pyogenes, S.pneumoniae, H.influenzae, iar din infectiile cronice: M. tuberculosis, M. Leprae, Nocardia, T.pallidum, levuri

Canaliculite Reprezinta infectii cronice ale orificiului lacrimal si ale canaliculelor, datorita in majoritatea cazurilor : Propinibacterium propionicus Blefarite Se datoreaza S.aureus, S.epidermidis, Moraxella spp Keratite Se datoreaza amivelor libere in cazul purtatorilor de lentile de contact, frecvent: S.aureus, S.pneumoniae, P.aeruginosa, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Citrobacter, Proteus, uneori micobacterii atipice, levuri, Aspergillus Endoftalmite Sunt de natura endogena sau exogena (post-chirugicale sau dupa ranire), cauzate de catre aceeasi germeni prezenti la keratite, adaugandu-se N. meningititdis, Bacillus cereus, levuri

Antibiograma
Se realizeaza asupra germenilor cu potential patogen

. EXAMENUL BACTERIOLOGIC AL UNUI DISPOZITIV INTRAVASCULAR (CATETER, CAMERA IMPLANTABILA)

I. Context raportatea existentei unei stai septice la colonizarea dispozitivelor intravasculare cu unul sau mai multe microorganisme. II.Obiective -Utilizarea unei metode sensibile si specifice care sa permita punerea in evidenta a colonizarii unui dispozitiv.
Microorganismele cel mai frecvent intalnite sunt: Staphylococcus epidermidis, (si alti stafilococi coagulazo-negativi), Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter ssp., Enterocaterii, Enterococcus ssp., bacterii corineforme, Candida sp. Studiul bacteriilor anaerobe nu este necesar in acest context.

-Diferentierea unei colonizari de contaminarea ce are loc in general la scoaterea dispozitivului. metode cantitative sau semicantitative, calitative (simple puneri de culturi in medii lichide). Excluderea posibilitatii existentei unui alt focar infectios Luarea unuei decizii: - instaurarea sau nu a antibioterapiei pe cale generala sau locala - alegerea antibioticului - indepartarea dispozitivului

Meteode bacteriologice
1. Analiza bacteriologica a dispozitivului in organism Hemoculturi diferentiate care se aplica in cazul camerelor implantabile si a cateterelor profunde. a. Hemocultura prin metoda centrifugare-liza (Isolator 10) - prelevati 2 hemoculturi (10 ml de sange fiecare), una de la periferie, de la distanta de material si alta de-a lungul dispozitivului (dupa aruncarea primilor 20 ml de sange) - insamantati sedimentul de centrifugare din fiecare tub pe 2-3 placi cu geloza sange - incubati 72 ore in atmosfera 5% CO2 - exprimati rezultatele in UFC/ml - rezultatul este semnificativ daca UFC/ml al materialului > 5x UFC/ml din sangele periferic Metoda liza Isolator 1,5 - aceleasi etape fara centrifugare utilizand tuburi de 1,5 ml - se utilizeaza in pediatrie - este mai usor de realizat decat prima metoda pentru camerele implantabile b. Hemocultura pentru detectarea cresterii in sistem automat - realizati hemoculturi in flacoane pentru automat din sange periferic si din material - plasati probele rapid in automat - se tine cont de o pozitivare mai rapida a hemoculturii prelevate de pe material (semnificativa daca timpul de pozitivare este inferior hemoculturii periferice) - aceasta metoda este valabila pentru automatul VITAL (bioMerieux), pentru un timp > 2 ore.

2. Analiza bacteriologica dupa scoaterea cateterului

- se lucreaza pe 5 cm de la extremitatea distala pentru cateterele lungi, sau pe toata suprafata cateterului pentru cateterele scurte. a. Metoda semicantitativa Maki - rulati cateterul pe suprfata unei placi de geloza-sange cu ajutorul unei pense sterile sau a unei pipete Pasteur - incubati 48 ore la 370C - cateterul este colonizat daca UFC/ml > 15 (5 dupa unii autori) Aceasta metoda ia in calcul doar suprafata externa a cateterului, prezinta sensibilitate buna dar specificitate mediocra b. Metoda cantitativa Cleri - prindeti cateterul cu o pensa sterila si se desfaceti orificiul in care se pune 1 ml de bulion steril -colectati bulionul si cateterul intr-un tub steril, vortexare 30 secunde - insamantati 10 l bulion pe geloza sange, incubare 48 ore la 370C - cateterul este colonizat daca UFC > 1000/ml. Aceasta metoda ia in calcul fata externa a cateterului si orificiul dispozitivului, se caracterizeaza prin specificitate si sensibilitate buna c. Metoba cantitativa Cleri modificata de Brun Buisson - este o metoda simplificata: cateterul e colectat intr-un ml ser fiziologic fara desfacerea orificiului , vortexare 1 minut se obtine acelasi prag de pozitivitate 3. Analiza bacteriologica dupa scoaterea unei camere implantationale - nu exista o metoda standardizata pentru analiza camerelor implantabile, se fac prelevari la indepartarea acestor dispozitive: -indepartati camera - recoltati serozitati - analizati cateterul printr-o metoda cantitativa (Cleri sau Brun-Buisson) - spalati partea inchisa a camerei si analizati produsul de spalare

EXAMENUL BACTERIOLOGIC AL LICHIDULUI DE DREN

I. Context Analiza bacteriologica a unui lichid de dren se poate practica in scopul supravegerii unui situs, in mod natural steril, necesitand un dispozitiv de drenaj. Practica este curenta dar nevalidata pe plan clinic. II.Obiective - prelevatele trebuie sa provina din sisteme de drenaj inchise diferentierea colonizarii dispozitivului de contaminarea ce are loc la situsul de insertie sau pe traseul drenului: se confrunta abundenta si natura florei cu cea de la nivelul situsului. daca sunt puse in evidenta bacterii trebuiesc cautate argumente in favoarea unei infectii locale sau a unei stari septice: se realizeaza sistematic hemoculturi pentru evidentierea bacteriemiei, se exclude posibilitatea altui focar infectios.

III. Metode bacteriologice 1. Examen direct - coloratie Gram poate fi realizata pe un frotiu direct, sau pe sediment de centrifugare 2.Cultura - insamantare pe geloza-sange - incubare 48 ore in aerobioza 3. Antibiograma - nu este obligatorie

EXAMENUL BACTERIOLOGIC AL PRELEVATELOR PERINATALE

I.Context: Evaluarea riscului infectiilor perinatale Contaminarea perinatala se poate produce in utero, la nastere sau dupa nastere. 1. In uter Fatul este contaminat pe cale transplacentara in cursul unei bacteriemii materne. Patologii fetale sau/si neonatale intotdeauna severe (avort, prematuritate, malformatii, sindrom infectios congenital) Bacteriile in cauza sunt cele capabile sa infecteza mama si capabile sa colonizeze fatul pe cale transplacentara: Listeria monocytogenes 2. Infectii neonatale Fatul este contaminat prin lichidul amniotic care a fost el insusi infectat la strabaterea caii genitale sau la nastere, la trecerea prin caile genitale ale mamei. Germenii infectanti sunt deseori ingerati de nou-nascut. Patologii infectioase neonatale care sunt greu de combatut si sunt dominate de semne respiratorii. Bacteriile care colonizeaza caile genitale ale mamei cel mai adesea fara consecinte patologice pentru mama. Speciile cu risc infectios crescut pentru nou-nascut: Streptococcus agalactiae (grup B, tip III si I), E. coli (tip capsular K1), H. influenzae (biotip 4), H. haemolyticus. Alti comensali din vagin pot fi implicati in infectii neonatale: Staphylococcus aureus, Streptococcus spp, Enterococcus spp, enterobacterii, Gardnerella vaginalis, Anaerobies strictes, Mycoplasma, Ureoplasma . De asemenea, microorganisme responsabile de patologia veneriana la femei ( Chlamydia, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum) pot infecta nounascutii. Infectiile virale ale nou-nascutului (Herpes viridae VIH, hepatite) care sunt detectate la nastere nu sunt tratate aici. 3. Infectii post-natale In 8 ore de la nastere, copilul poate fi contaminat de microorganisme din mediu sau de la mama.Tabloul clinic al acestor infectii tardive sunt adesea dominate de semne de meningita. 4.Criterii decizionale pentru instituirea unui tratament antiinfectios la nou-nascut Prognosticul infectiei nou-nascutului este direct dependent de rapiditatea administrarii tratamentului. Decizia tratamentului se face la nastere, uneori chiar inainte, pe baza unor argumente anamnetice, clinice, biologice si bacteriologice. Fiecare echipa de obstetricieni utilizeaza propriile reguli in absenta unui consens in tratamentul infectiilor. Criteriile microbiologice si rezultatele examelelor directe a prelevatelor practicate la nastere influenteaza decizia in privinta tratamentului.

II. Obiectivele examenelor bacteriologice: - stabilirea criteriilor bacteriologice pentru luarea unei decizii in stabilirea tratamentului la nou-nascut - izolarea, identificarea, si determinarea sensibilitatii la antibiotice a bacteriilor responsabile de infectie in cursul primelor zile de viata III. Prelevate 1.Prelevate de urgenta- efectuate si transportate la temperatura ambianta intr-o ora (daca e posibil) de la nastere si examinate imediat
a. aspiratul gastric: cativa ml de lichid gastric sunt aspirati cu ajutorul unei sonde gastrice nr 8 montata pe o seringa de 10 ml. b. aspirat din orificii si cutanat (1-3 situsuri cutanate si orificii (pliu, narina si conduct auditiv) 2. Prelevate complementare -sunt efecuate in urmatoarele 24 de ore de la nastere a. prelevare de meconiu: In mod normal meconiu este eliminat in 48 de ore, o eliminare precoce poate fi un semn de infectie. - sunt prelevati cativa ml cu ajutorul unei spatule sterile. b.prelevare de placenta: un esantion de placenta poate fi prelevat cu ajutorul unui scalpel steril de preferinta dintr-o zona cu aspect macroscopic anormal. Daca aspectul este diferit trebuie conservat esantionul la 40C. 3. Prelevate specifice

hemoculturile, punctiile LCR si prelevatele periferice (ECBU) B. Prelevate pentru evidentierea portajului matern de microorganisme de risc 1.Examenul bacteriologic al endocolului Infectia corioamniotica ascendenta incepe printr-o colonizare a endocolului. Examenul prelevatelorde endocol realizate corect (fara contaminare vaginala) poate permite identificarea bacteriei responsabile de colonizarea si producerea infectiei. Acest examen poate fi practicat in timpul ultimului consult inainte de data prevazuta pentru nastere. Tehnica de prelevare este determinanta pentru a evita contaminarea vaginala. Mai inainte trebuie curatat corect exocolul cu AFS, apoi prelevat endocol cu un tampon ce va fi intors de mai multe ori in endocol si scos evitand orice contact cu peretii vaginului. Trebuie cautati in cultura toti germenii care pot fi responsabili de chorioamniotite bacteriene, cu prioritate bacterii cu risc inalt de infectie pentru nou-nascut. 2. prelevate vaginale, anale Evidentierea S. agalactiae la nivel vaginal si anal in timpul ultimului consult inaintea datei prevazute pentru . Existenta unei BTS anterioare la femei face sa creasca riscul infectiilor grave la nou-nascut. 3. Examenul bacteriologic al lichidului amniotic Acest examen este practic in perioada prenatala in caz de ruptura precoce a apei. Acest tip de prelevat este tratat ca un prelevat steril. Enterobacteriile, streptococii, Lysteria, Haemophylus, Gardnerella dar si alti germeni aerobi si anaerobi comensali ai cailor genitale. Tehnica de prelevare este determinanta pentru evitarea contaminarii lichidului in timpul trecerii prin vagin. Trebuie mai intai curatat corect exocolul apoi prelevat, de la nivelul colului, o cantitate suficienta de lichid amniotic (0,5ml).

1. Microorganisme

incriminate

Examene microbiologice

Bacteriile patogene investigate sistematic in toate prelevatele la mama sau la fat S. agalactiae, E. coli (K1),H. influenzae, L. monocytogenes. Toate celelalte specii izolate din lichidul gastric sau din alt prelevat recoltat la nastere la copil trebuie considerat ca potential patogen. Antibiograma obligatorie.

2.Examenul direct
a. Lichdul gastric Realizati frotiuri Gram. Se examineaza la microscop: polimorfonucleare, bacterii, levuri. In general, in cazul unei infectii, flora monomorfa. Prezenta unei flore abundente si variate poate fi rezultatul contaminarii datorita prelevarii tarzii sau conditiilor proaste de transport. b. Meconium Meconiu este normal steril. Examinarea se practica ca si in cazul lichidului gastric. c. Prelevarile cu tampon Aceste prelevate sunt frecvent contaminate de flora vaginala a mamei si/sau de flora cutanata sau din mediu. Se examineaza la microscop dupa coloratia Gram: polimorfonucleare, bacterii, levuri. Examenul directal acestor prelevate este mai putin informativ decat cel al lichidului gastric. d. Alte metode de diagnostic rapid Evidentierea antigenelor bacteriene. Metodele de amplificare genica sau sonde nucleare nu sunt inca validate. . Cultura - un mediu imbogatit (geloza cu sange tratat termic) - un mediu selectiv pentru streptococi si Listeria (geloza sange si acid nalidixic-colistine sau ANC) - un mediu selectiv pentru bacili G- un mediu solid pentru strict anaerobi din lichidul gastric. Mediile unt incubate 48 ore la 370C, si, in cazul mediului cu sange, cu 5-10% CO2. Trebiue evidentiate speciile de risc. Prezenta speciilor comensale trebuie interpretata cu precautie. Prezenta unei specii ca flora dominanta in 2 prelevate din situsuri diferite este considerata semn de infectie. Tulpinile de Listeria sunt trimise la centrul de referinta. Determinarea grupului capsular K1 de E. coli se face prin aglutinare pe lama. Haemophilus trebuie identificat. Identificarea altor bacterii considerate ca patogene se face pana la stadiul de specie.

4. Antibiograma
Se realizeaza pentru tulpinile patogene. E. coli K1: fenotip de rezistenta dobindita S. agalactiae: rezistenta la macrolide, si cicline H. influenzae: prezenta de beta-lactamaze Listeria : rezistenta naturala la cefalosporine, rezistenta dobandita la macrolide floroquinolone, cotrimazol

HEMOCULTURA
Factor de predictie
Temperatura maxima>38,30C

puncte
3

Maladie rapid fatala

Maladie terminala

Prezenta frisonului

Toxicomanie pe cale venoasa

Abdomen chirurgical

Factor de comorbiditate majoraa coma sau moarte cerebrala, perforare digestiva, multitraumatisme, stop cardiorespirator, insuficienta hepatica acuta sau cronica

scor 6 risc puternic de bacteriemie scor 2 -risc scazut

Realizarea unui prelevat de calitate

a.Evitati contaminarea Asepsia pielii se face succesiv cu alcool 70% ,apoi un produs iodat, tinctura de iod sau polividona iodata. 1-2 minute de contact sunt necesare pentru obtinerea efectului aseptic in cazul polividonei. Dezinfectia capului flaconului de hemocultura e realizata cu alcool 70% sau cu produs iodat unde a fost lasat inainte de utilizare. b. Prelevarea unei cantitati suficiente de sange 20 ml -adult. 1-2 ml la copil. c. Efectuati numarul de prelevari necesare Cu exceptia infectiilor sistemului vascular, in particular endocarditele bacteriene, in cursul carora bacteriemia este permanenta, in cursul altor situatii clinice,bacteriemia poate fi tranzitorie, intermitenta. 2-3 seturi de hemoculturi / 24 ore cu pauza de 30-60 minute intre 2 prelevari. 2. Alegerea conditiilor de cultivare adecvata a. Aerobioza-anaerobioza b. Diluarea sangelui Sangele bolnavului contine numeroase substante cu activitate antibacteriana:complement, lizozim, celule fagocitare si antibiotice . Diluarea 1/10 sangelui in bulion atenueaza efectul acestor substante. c. Polietanol sulfonat de sodiu (SPS) Este anticoagulantul general utilizat in bulion pentru hemoculturi la o concentratie de 0,025-0,05%. Favorizeaza cresterea majoritatii bacteriilor, pentru ca inhiba activitatea bactericida a serului, inhiba fagocitoza, inactiveaza complementul, neutralizeaza lizozimul si antibioticele familiei aminosidelor. Totusi, SPS poate avea efect inhibitor asupra unor specii de Neisseria, Peptostreptococcus anaerobius, sau de Streptobacillus moniliformis. E de preferat utilizat in concentratia 0,025%. Aditia de gelatina la o concentratie de 1,2% poate neutraliza efectul inhibitor al SPS. d.Neutralizarea antibioticelor Rasini absorbante de cationi sau carbon activ au efect neutralizant fata de antibiotice.O masura de precautie consta in realizarea prelevarilor la distanta fata de administrarea antibioticelor. 3. Detectarea precoce a cresterii bacteriene a. Durata de incubare a flacoanelor de hemocultura Incubare de 7 zile la 350C este suficienta. La automate, incubarea e validata pentru 5 zile. Peste aceasta perioada, bacteriile detectate sunt in general contaminanti care au fost in prelevat in cantitate scazuta. Un timp de incubare mai lung poate fi necesar pentru microorganisme particulare:ciuperci, bacterii de grup HACEK, Brucella sau Legionella si in plus pentru pacientii suspectati de endocardite si la care prelevatele au fost realizate atunci cand bolnavul era sub tratament cu antibiotice.

4. Examenul macroscopic al probei= valoare orientativa Semne observate

Turbiditate Hemoliza Producere de gaz coagulare

Bacteria in cauza
Bacili G- aerobi, stafilococi, Bacteroides, Streptococi, stafilococi, Listeria, Clostridium, Bacillus Bacili G-aerobi anaerobi S.aureus

Ameliorarea precocitatii si sensibilitatii detectiei cresterii bacteriene

- agitarea flacoanelor aerobe in timpul primelor 24 ore de incubare accelereaza cresterea bacteriana, dar e dificil de pus in practica, in absenta unui dispozitiv automat - aerarea flacoanelor aerobe cu un dispozitiv adaptat favorizeaza cresterea Pseudomonas - detectarea precocitatii cresterii realizand o examinare directa la microscop in bulionul de cultura cu acridin orange este o tehnica putin utilizata - repicarea sistematica precoce (intre 6 si 24 ore) a flaconului de anaerobioza pe gelaza chocolat incubata in aerobioza la 350C e uneori recomandata dar putin utilizata -sistemele difazice permit cresterea precoce a coloniilor pe mediul gelozat.Important pentru speciile bacteriene cu crestere delicata. -sistemul Signal utilizeaza un flacon la care este adaptat un dispozitiv ce permite semnalizarea cresterii bacteriene b3. Centrifugare-liza: sistemul Isolator Acest sistem permite recoltarea a 8-10 ml de sange si concentrarea microorganismelor inainte de insamantarea pe mediul gelozat adaptat cresterii microorganismelor respective. Solutia prezenta in tub contine saponina pentru lezarea leucocitelor si eritrocitelor, polipropilenglicol pentru a evita formarea de spuma datorita saponinei si SPS ca anticoagulant. Dupa centrifugare tuburilor in rotor la unghi fix de 350 -30 minute la 3000g, supernatantul este eliminat si concentratul este omogenizat la vortex. Se insamanteaza pe diferite medii gelozate. Isolator 1,5 este acelasi sistem, fara etapa de centrifugare. Se practica in tuburi de 1,5 ml, in pediatrie. Sistemul Isolator este foarte performant pentru izolarea microorganismelor urmatoare:micobacterii, levuri cu crestere dificila, ciuperci filamentoase, bacterii exigente. Permite cuantificarea bacteriemiei, ceea ce este util pentru punerea in evidenta a unei infectii pe cateter. Prezinta si cateva inconveniente:riscul manipularii obliga manipulatorul la lucru in hota, necesita timp mult din partea manipulatorului. b4. Metode de detectie automatizata - detectie automata a hemoculturilor pozitive - detectia flacoanelor pozitive pre-incubate - prelucrare statistica si protectia manipulatorului Principiul de detectie estec masurarea directa sau indirecta a cantitatii de CO2 produsa in flacon. Bio Argos -se masoara spectofotometric producerea de CO2 BacT/Alert Principiul consta in incorporarea in fiecare flacon a unui detectot colorimetric sensor de CO2 de culoare verde. Sensorul este separat de bulion printr-o membrana semipermeabila care nu lasa sa treaca CO2. Producerea de CO2 antreneaza o descrestere a pH-ului si sensorul devine galben. Virajul culorii este interpretat prin reflectometrie, fiecare citire compara variatia de culoare cu precedenta, fiecare flacon are propria sa celula de citire. Bactec 9240 Acelasi principiu, coloratia fluorescenta, masurata de o fotodioda. Vital In flacoane sunt molecule fluorescente in stare nativa care emit fluorescenta in prezenta fenomenelor biologice determinate de cresterea bacteriana. Aceasta molecula nu este sensibila doar la CO2, cresterea este detectata datorita variatiei de pH si modificarii potentialului oxido-reducator. Fiecare flacon are propria celula de citire, echipat cu o dioda de excitare ce emite o lumina verde. Lumina rosie emisa de filtre e transmisa de o fibra optica spre un numarator de fotoni.

Cazuri particulare
a. Micobacterii Mycobacterium avium-intracelulare (complexul Mac) pacienti SIDA. mai rar: M. kansasii, sau M. tuberculosis b. Alte microorganisme: b.1. Bacterii cu crestere lenta si dificila
Brucella- unele tulpini sunt exigente pentru CO2. Sangele este inoculat in flacon difazic tip Castaneda, incubat 6 saptamani la 370C.Se fac subculturi pe geloza tripticar soya cu 5% ser de bou sau pe agar Brucella incubat in atmosfera de 5%CO2. Campylobacter- cultura la 370C in microaerofilie in atmosfera de 5%CO2 pe mediu Skirrow, Butzler sau Karmali incubate 72 ore. Legionella Cultura pe mediul BCYE incubate la 370C cu 5%CO2, observate timp de 10 zile. Mycoplasme Ureaplasma- cultura in bulion PPLO sau geloza A3 incubata in microaerofilie la 370C si observate 3 zile. Leptospira- recoltat sange pe tub de heparina si insamantat pe mediu Tween-Albumine sau EMJH incubat la 300C la intuneric. Observarea culturii la microscop cu fond intunecat, in timp de 2 luni saptamanal . Grup HACEK- Haemophilus aphrophilus, Actinobacillus actinomicetemcomitans, Cardiobacterium hominis, Eikenella corrodens, si Kingella kingae sunt specii responsabile de endocardite bacteriene care se dezvolta lent. Ele pot necesita o incubare in flacoane mai putin de 14 zile, mai mult decat durata normala de incubare a flacoanelor in automate. Streptococi deficienti (Abiotrophia) unele tulpini de streptococi de grup viridans necesita piridoxal pentru crestere. Aceste tulpini pot fi responsabile de bacteriemii sau endocardite. Cresc in bulion , nu cresc pe mediu gelozat. Nevoia de piridoxal este pusa in evidenta prin crestere pe geloza cu sange completata cu 0,001% piridoxal, sau printr-un test de satelitism in jurul unui striu de S. aureus. Bartonella (Rochalimaea)- Aceste bacterii retrase din ordinul Rickettsiales sunt responsabile de bacteriemii, angiomatose, pelioze bacilare la pacientii cu HIV. Cultivarea lor pe mediu acelular este lenta si delicata. Sedimentul dintr-u tub Isolator este insamantat pe geloza cu sange de iepure sau oaie incubat in atmosfera de 5% CO2 6 saptamani. Se poate face PCR. b.2. Endocardite cu hemoculturi negative Daca hemoculturile sunt negative la 3 zile de la incubare este recomandat examen serologic
Pentru diagnosticul a infectiei cu Chlamydia psittaci, C. pneumoniae, C trachomatis, Brucella, Legionella Bartonella Mycoplasma pneumoniae Candida Aspergillus sau Coxiella burnetti. Prelungirea timpilor de incubare, sau repicarea flacoanelor

Brucella

Abiotrophia

S. aureus, E.coli, Enterobacteriile, P. Aeruginosa si Candida albicans - in 90% cazuri Bacillus, Corynebacterium si Propionibacterium - 5% din cazuri. S Streptococilor de grup viridans, Enterococcus si SCN

Analiza bacteriologica a valvelor cardiace

a. Prelevatele In pre-operator nu trebiue efectuata nici o tamponare antiseptica ale valvelor cardiace. Valva va fi recoltata intr-un vas steril care nu contine nici un lichid si va fi transmisa laboratorului de bacteriologie. b. Analiza la Laboratorul de Bacteriologie - Ajunsa in laborator valva este depusa intr-un mojar steril, pe un camp steril sau intr-un vas Petri steril. Operatorul poarta masca si lucreaza in hota. Trebuie observate diferitele tipuri de leziuni ca perforatii, calcifieri sau vegetatii. Se face descrierea, desenul,eventual fotografierea valvei. - Un fragment al valvei ajunge la anatomopatolog si alta la bacteriolog. Pe fragementul destinat anatomopatologului este recomandat realizarea a 3 amprente pe lama. Lamele sunt uscate si fixate cu etanol. Se poate efectua coloratie Gram, Zeihl-Neelsen, Giemsa sau acridin-orange. Aceste coloratii permit punerea in evidenta a majoritatii bacteriilor si a microbacteriilor. O lama colorata cu acridin-orange poate fi secundar colorata cu o alta coloratie (Gram, Giemsa). Tesutul destinat anatomopatologului poate fi plasat intr-un fixator (formol diluat 1/10). Fragmentul destinat bacteriologului este dilacerat intr-un mojar cu ajutorul unui pistil sau a unui Potter in prezenta de 1ml bulion creier-cord. Se recomanda o coloratie Gram, insamantarea mediilor de cultura definite si congelarea la 80 de grade a restului.

- Insamantarea si durata de incubare a urmatoarelor medii: - mediul Geloza-chocolat suplimentat Isovitalex. Se incubeaza sub 5 % CO2 10 zile. Pentru a rezista mai mult la desicare e utilizat ca mediu in panta intr-un tub. Imbogatirea in CO2 poate fi realizata cu ajutorul unui sistem Gaspak. Incubarea poate fi realizata la 370C dar o a 2 a placa identica cu mediu cu geloza sange trebuie sa fie insamantata sub5% CO2, timp de 45 de zile intre 28-320C pentru a favoriza cresterea Bartonella. - 2 medii gelozate cu 5 % sange incubate una sub O2 alta sub CO2 timp de 10 zile permite o mai buna crestere a streptococilor fata de mediile gelozate chocolat. Aportul de CO2 favorizeaza cresterea Streptococcus mutans, S. anginosus si S. constellatus. - mediu geloza Columbia ce contine 5 % sange cultivat sub H2 timp de 10 zile pentru cresterea unor streptococi si bacterii anaerobe. - mediul geloza BCYE suplimentat cu 10 % ser fetal bovin incubat intr-un recipient sub CO2 la 35-370 C timp de 10 zile (serul fetal bovin favorizeaza cresterea Legionella micdadei si L. bosemanii) - mediul Lowenstein si Middlebrook conservat 6 saptamani la 35-370 C pentru cultivarea microbacteriilor. - un mediu lichid usor reducator imbogatit si usor gelozat favorizeaza multiplicarea in vitro a bacteriilor care la iesirea din organism au nevoie de o atmosfera redusa in oxigen si de un suport pentru multiplicare. Este propus unul din urmatoarele medii:- mediul cord-creier, gelozat 1% si imbogatit 1-3% Isovitalex. - bulion glucozat tamponat aditionat cu ficat si imbogatit 1-3% Isovitalex.. - mediu Schaedler semigelozat imbogatit cu 1-3% Isovitalex. Aceste medii lichide sunt incubate o luna la 35-370C.

Daca este prezenta o endocardita la nivelul protezei vegetatie prezenta= analiza bacteriologica descrisa anterior; - vegetatie absenta= analiza tesutului patologic prelevat de la nivelul de desprindere al protezei. prelucrat ca si o vegetatie. Se utilizeaza bulion glucozat si se realizeaza o coloratie Gram. La 48 de la incubare se face o coloratie Gram si se insamanteaza pe diferite medii ca si pentru o valva nativa. Restul fragmentelor se congeleaza la -81oC. c.Studiul anatomopatologic al valvelor cardiace Dupa ce analiza bacteriologica a fost efectuata tesuturile valvulare sunt fixate in formol si trimise Laboratorului de Anatomie Patologica. Pe foaia de insotire bacteriologul trebuie sa noteze aspectul leziunii, cine a prelevat proba. c.1.Analiza macroscopica a prelevatelor valva nativa: se noteaza dimensiunea si compozitia prelevatului (tesut valvulat, aderente), se descrie prezenta eventualelor vegetatii, ulceratii, perforatii, trombusuri bioproteza de valva: se noteaza aspectul perforatiilor, eventuala existenta a aderentei tesutului fibros la nivelul protezei; acestea sunt prelevate pentru histologie. proteze mecanice: se noteaza mai ales prezenta trombilor, eventuala existenta a aderentei tesutului fibros la nivelul protezei; acestea sunt prelevate pentru histologie. Pentru toate aceste tipuri de prelevate ar fi utila o fotografie macroscopica. c.2.Analiza histologica Se face pe prelevat la nivelul leziunii constatate (vegetatie, perforatie, tromb) sau incluzand in totalitate prelevatul daca este de dimensiune mica. Se fixeaza in formol diluat 10x. Coloratia utilizata Hematoxilina-Eosina-Safranina (HES). In cazul infiltratiei inflamatorii se fac coloratii suplimentare, coloratia Gram, coloratia Grocott si /sau PAS, coloratia Giemsa pentru Bartonella , coloratia Machiavello pentru Chlanydia si Rickettsii. Pe blocurile incluse in parafina se poate face in laboratoarele specializate si studii de IF sau hibridizareain-situ. c.3.Rezultatele studiului histopatologic Endocardita este definita de infiltratia inflamatorie la nivelul valvei. Trebuie precizate intensitatea infiltratului si compozitia sa in polimorfonucleare, macrofage, limfocite. Din formula inflamatorie se poate deduce notiunea evolutiva inflamatorie a leziunii: prezenta polimorfonuclearelor corespunde leziunilor active; absenta polimorfonuclearelor cu prezenta macrofagelor si a fibrozei corespunde leziunilor cicatrizate. Totusi nu exista o stricta corelatie anatomo-bacteriologica: prezenta catorva polimorfonucleare nu este intotdeauna sinonima cu persistenta bacteriilor si absenta polimorfonuclearelor nu elimina persistenta bacteriilor intracelulare in macrofage. Anumite lezuni pot contribui la diagnostic: focare de necroza valvulara, tromboza inflamatorie. Caracterizarea histopatologica a bacteriilor prin utilizarea coloratiilor speciale: deseori bacteriile piogene abundente sunt vizibile sub forma de colonii mici, la coloratia HES. In alte situatii agentii patogeni nu se pun pun in evidenta decat prin coloratii speciale. Anumite bacterii nu sunt detectate (bacteriile intracelulare), acest fapt trebuie notat caci el orienteaza catre anumite tipuri de bacterii.

IZOLAREA SI IDENTIFICAREA BACTERIILOR ANAEROBE

Prelevate cu risc hemocultura
lichid de punctie (pleurala, pericardica, articulara) abces pulmonar: in masura in care prelevatul a fost realizat corect, fara contaminare buco-dentara osteite peritonite abcese craniene abcese abdominale si ginecologice

Semne evocatoare
miros urat al probei prezenta de gaz in leziune supuratie (abces submaxilar sau cervical, pleurezii purulente, peritonite, abcese ale sferei genitale) microbiota abundenta si polimorfa, asocieri de bacili si coci G- si G+

1. Infectii cu Clostridium secretoare de toxine. a. toxi-infectii: C tetani, C perfringens, C difficile). b. intoxicatii (Clostridum botulinum) 2.Infectii mixte: se dezvolta in vecinatatea mucoaselor. Strict anaerobii sunt asociati cu alte bacterii, putand da complicatii, infectii la distanta.

Microbiota
Microbiota vaginala
Lactobacillus +++ Prevotella bivia Prevotella pigmentees Prevotella disiens Peptostrptococcus ssp. bucala Prevotella pigmentes Porphyromonas ssp Prevotella grup oral Fusobacterium nucleatum Peptostrptococcus ssp. Eubacterium spp Actinomyces spp. Anaerobi din microbiota normala

Piele Propionibacterium acnes +++ Peptostrptococcus ssp.

Microbiota intestinala Bacterioides grup fragilis +++ Bilophila wadworthia Peptostrptococcus ssp. Clostridium spp Bifidobacterium spp Eubacterium spp

Supuratii abdominale

Puroi ginecologic

Pneumonie ab ingestis

Abcese pulmonare Pleurezii purulrnte

+
+ 0

Cap si gat
(+)
(+) 0

Tesuturi moi

Bacterioides fragilis
Bacterioides grup fragilis Prevotella bivia

+++
++ /

(+)
(+) +++ (+) /

+
+

Prevotella oralis Porphyromonas spp Fusobacterium nucleatum Fusobacterium necrophorum Peptostreptococcus spp Actinomyces spp Clostridium perfringens

/ / / / + / ++

+ + + / ++ ++ /

+++ (+) ++ / ++ + +

+++ (+) +++ / ++ ++ /

++ + ++ ++ ++ ++ 0

+ ++ / / ++ (+) +

Diagnosticul de laborator
Medii de cultura
pentru bacili G- : mediu Schaedler cu sange si cu vancomicina (7,5 mg/l) si neomicina (75mg/l) ( Bacterioides grup fragilis, Prevotella, Fusobacterium. pentru bacteriile G+ si Porphyromonas.- geloza Columbia cu sange si feniletilalcool (4,2g/100ml) pentru Clostridium: TSN, geloza cu galbenus de ou si neomicina , Columbia cu sange, cicloserina, si cefoxitina pentru C difficile. bulion anaerob repicat dupa 48-72 de ore pe geloza selectiva.

Incubare in conditii de anaerobioza

Identificarea prezumtiva-determinarea genului bacterian al majoritatii anaerobilor (suficient!!!!).

- studiul mobilitatii intre lama si lamela in contrast de faza - coloratia Gram - testul oxidazei si catalazei - cresterea in prezenta de antibiotice (kanamicina, colistin, vancomicina) si inhibitori (bila, verde briliant) - studiul fermentatiei zaharurilor: producere de indol, gelatinaza, cu ajutorul minigaleriilor -studiul caracteristicilor enzimatice cu ajutorul galeriilor de identificare rapida Bacteriile cel mai frecvent izolate prin aceste metode simple sunt: Bacterioides fragilis, Bacterioides ureolyticus, Prevotella melanimogenica, Prevotella bivia, Fusobacterium nucleatum, F. Necrophorum, Porphyromonas gingivalis, Bilophila wadsworthia, Clostridium perfringens, C difficile, Propionibacterium acnes, Actinomyces meyeei. Identificare definitiva cromatografie in faza gazoasa, biologie moleculara Sensibilitatea la antibiotice Bacterioides grup fragilis multirezistente, secretoare de -lactamaze, altele sunt rezistente la metronidazol.

Bacterioides grup fragililis Alti bacili Gram- (Prevotella, Fusobacterium) Coci Gram+ si bacili Gram+ (Propionibacterium, Actinomyces) Clostridium nesporulati

Amoxiclina, amoxicilina+acid clavulanic, cefoxitin, cefotaxim, imipenem, clindamicina, metronidazol Amoxiclina, metronidazol amoxicilina+acid clavulanic,

Penicilina, metronidazol, vancomicina, ofloxacin (pentru Propionibacterium) Ampicilina, amoxicilina+acid clavulanic, metronidazol, vancomicina, clindamicina