Professional Documents
Culture Documents
Konu5-DNA Izolasyonu
Konu5-DNA Izolasyonu
Konu5-DNA Izolasyonu
DNA
Genetik bilgiyi tayan ift sarmal molekldr. 5Clu eker, fosfat ve bazlar ieren nkleotidlerden oluur. Doadaki canllarn tmne yakn ksmnda genetik materyal DNAdr.
DNAnn zellikleri,
Negatif ykldr, Suda znebilir, Alkolde znmez.
1- Hcrenin paralanmas ile yksek molekl arlkl DNAnn aa kmas, 2-Denatrasyon veya proteoliz ile DNAprotein kompleksinin ayrlmas ve DNAnn znr duruma getirilmesi, 3-DNAnn basit enzimatik ve/veya kimyasal yntemlerle proteinler, RNA ve dier makromolekllerden ayrlmas, ***DNAnn analizi
Denatrasyon: ift zincirli DNA molekl yksek pH veya yksek scaklk etkisinde brakldnda sarmal yapsnda znmeler meydana gelir. Renatrasyon: Koullar tekrar normal duruma getirildiinde iki iplik sarmal yapy oluturmak zere birleir.Yani denatrasyon geri dnmldr.
*Enzimler(RNase) RNAy yok etmek iin, *Enzimler (Proteases) DNA moleklne bal olarak bulunan proteinleri yok etmek iin, *zopropanol ve etanol: Nkleik asitlerin ktrlmesinde, *Amonyum slfat ve sodyum slfat:Proteinlerin ktrlmesinde, *Etil asetat, Toluen, SDS membran yapsn bozmada, ***zole edilen DNA +4Cda uzun sre saklanabilir.
6)Eit hacimde kloroform/izoamil alkol (CIA) eklenerek 10.000 rpmde 5 dakika santrifjlenir. 7)Spernatant alnarak zerine fenol/kloroform/izoamil alkol eklenerek 10.000 rpmde 5 dakika santrifjlenir. 8)Spernatant ayr bir tpe alnarak izopropanol eklenir ve DNA knceye alt-st edilerek kartrlr. (Bu aamada DNAnn iplikikler eklinde keldii gzlenir) 9)DNA, 15.000 rpmde 10 dakika santrifjlenir. 10)Pelletin zerine etanol eklenerek DNA ykanr ve alkol geri boaltlr. 11)Tpn az ak durumda oda scaklnda (10-15 dak.) ya da 60 Cde birka dakika bekletilerek alkol tamamen uurulur. 12)kelti Tris-EDTA (pH:8) iinde yavaa vurularak zndrlr.
Materyal: Taze yaprak dokusu Yntem: 1)Materyalim miktarna gre 2- Mercaptaethanol / CTAB ve NaCI/CTAB ektrasyon tamponlar su banyosunda 65Cye kadar stlr. 2)Daha nce paralanarak toz haline getirilmi dokuya uygun miktarda 2Me/CTAB eklenerek 65 Cde 10-60 dak. tutulur. 3)Eit hacimde kloroform /izoamil alkol (24:1) eklenerek 10.000 rpmde 5 , 4 Cde santrifjlenir. 4)65 Cde stlm CTAB/NaCI zeltisi eklenir ve kartrlr. 5)3. aama tekrarlanr. 6)Tekrar CTAB ktrme tamponu eklenir ve eer kelti gzkr ise bir sonraki aamaya geilir eer gzkmyor ise 65 Cde 30 beklenir. 7)2700 rpmde 5 , 4 Cde santrifjleme yaplr. 8)Spernatant atldktan sonra, kelti yksek tuz ierikli TE tamponunda zndrlr. 9)Daha sonra izopropanol eklenerek 10.000 rpmde 15 da 4 Cde santrifjleme yaplr. 10)zelti etanol ile ykanr, TE iinde zndrlr ve +4de saklanr.
1)E. coli tad plazmitte bulunan antibiyotie diren geninin eidine gre, o antibiyotii ieren besiyerinde 15 devir/dakika hzda 37Cde 1 gece boyunca retilir. 2)Bir gecelik kltrler, 7.000 devir/dakika da 10 santrifjlenir ve lizis tamponunda sspansiyon haline getirilir. 3)5 oda scaklnda bekletildikten sonra alkali SDS ile muamele edilir ve yeniden 5 oda scaklnda tutularak hcrelerin paralanmas ve genomik DNAnn denaturasyonu salanr 4)4 Cde soutulmu potasyum asetatla muamele edilerek 5 buz iinde bekletilir 5)13.000 rpmde santrifj edildikten spernatant ksmna kalan plazmid fraksiyonuna absol etanol eklenir. 6)13.000 rpmde 20 Cde tekrar sabtrifj edilerek plazmid DNAs ktrlr. 7)TE tamponunda zdrldkten sonra RNase A eklenerek 37 Cde 1 saat bekletilir. 8)Daha sonra fenol/kloroform/izoamil alkol eklenir ve 13.000 rpmde 5 oda scaklnda santrifjleme yaplr. 9)Spernatant ayr bir tpe alnarak potasyum asetat eklenir ve -20 Cde 1 saat bekletilir. 10)20.000 rpmde 20 4 Cde santrifjleme sonucu elde edilen kelti uygun miktardaki TE iinde zlr.
Mitokondri DNAs izolasyonu, 1)Mitokondri keltisi lizis tampunu ierisinde zndrldkten sonra Proteinaz K eklenerek 37Cde 1 saat bekletilir. 2)Amonyum asetat ve TE ile doyurulmu fenol/kloroform eklenerek 12.000rpmde 5 santrifj edilir. 3)Spernatant ksm ayr bir tpe alnarak absol etanol alnarak eklenerek -20 Cde bir gece bekletilir. 4)18.000gde 20 santrifjlemeden sonra kelti distile su iinde zndrlr.
DNAnn Analizi
Nkleik asitlerin nanogram veya mikrogram dzeyindeki miktarlarnn belirlenmesinde absorbsiyon temeline dayanan spektrofotometrik yntemler kullanlr Ayrca nkleik asitlerin dorudan grntlenmesinde zgn dizilerde kesim yapan restriksiyon endonkleaz enzimlerinin etkisi sonucu oluan farkl boyutlardaki DNA paralarnn saptanmasnda elektroforetik yntemler kullanlr.
Kk DNA fragmentleri iin yksek, byk DNA fragmentleri iin dk agaroz konsantrasyonu kullanlarak DNAnn jelde en uygun ekilde yrmesi salanr. zole edilen DNA genomik DNA ise keskin bir bant eklinde (aa ve yukar ksmna dalan az bir ekilde dalan)grntlenirken,plazmid DNA snn genelde farkl biimi gzlenir(sebep,izolasyon srasnda krlmalardr).
Star aktivitesi: R.Enin uygun olmayan koullarda zel kesim dizilerine benzer dizilerde kesim yapmalar sonucunda istenmeyen fragmentlerinin olumasdr. Star aktivitesini arttran ve inhibe eden koullar bulunmaktadr.