Bioseparaciones Mistura Grande

Challenges in bioseparations
engineering
Low product concentration concentrations
Large number of impurities,
Thermolabile bioproducts.
Narrow operating pH and ionic strength window
Shear sensitivity of bioproducts
Low solubility of bioproducts in organic solvents
Instability of bioproducts in organic solvents
Stringent quality requirements
Percentage purity
Absence of specific impurities
An ideal bioseparation process should

combine high throughput with high
selectivity, and should ensure stability
of product.
Biological products
Product
Nature
of
required
Alcoholic beverages:
Beer, wine, spirits
Clarification, distillation
Organic acids:
Acetic acid, citric acid
Precipitation, filtration,
adsorption, solvent
extraction
Vitamins:
Vitamin C,
riboflavin
vitamin
Amino acids:
Lysine,
phenylalanine
bioseparation
B12,
adsorption, solvent
extraction
glycine,
adsorption, solvent
extraction
Antibiotics:
Penicillins, neomycin,
bacitracin
adsorption, solvent
extraction
Carbohydrates:
Biological products (contd..)

Proteins:
Food and food additives
Nutraceuticals
Industrial enzymes
Hormones
Pharmaceutical enzymes
Plasma derived products
Monoclonal antibodies
Growth factors
Clotting factors
Thrombolytics
r-DNA derived proteins
Diagnostic proteins
Vaccines
Filtration, precipitation,
centrifugation, adsorption,
chromatography, membrane
based separations
DNA based products:

DNA probes, plasmids,
nucleotides,
oligonucleotides
Filtration, precipitation,
centrifugation, adsorption,
chromatography, membrane
based separations
Strategies for bioseparation

A large number of bioseparation methods are available
The strategy is based on how best these can be
utilized for a given separation
The following need to be taken into account:
The volume of process stream
The relative abundance of the product in this

process stream
The intended use of the product, i.e. purity

requirements
The cost of the product
Stability requirements
Conventional strategy:
The RIPP scheme
Recovery, isolation, purification and polishing
Based on a logical arrangement of bioseparation
methods
Low-resolution, high-throughput techniques (e.g.
precipitation, filtration, centrifugation,
crystallization) are first used for recovery and
isolation
High-resolution techniques (e.g. adsorption,
chromatography, electrophoresis) are then used
for purification and polishing

It is now possible to avoid this RIPP scheme
Bioseparation methods
Low resolution-high throughput
Cell disruption
Precipitation
Centrifugation
Liquid-liquid extraction
Leaching
Filtration
Supercritical fluid extraction
Microfiltration
Dialysis
High resolution-low throughput
Ultracentrifugation
Adsorption
Packed bed chromatography
Affinity separation
Electrophoresis
Bioseparation methods (contd..)

High resolution-high throughput
Ultrafiltration
Fluidized bed chromatography
Membrane chromatography
Monolith column chromatography
In this course we will discuss:

1. Ultrafiltration
2. Membrane chromatography (membrane
adsorption)
1.1 ETAPAS DE PROCESAMIENTO

Esto requiere en promedio de tres a seis etapas distintas de
procesamiento. Algunos de los mtodos de purificacin de uso
general se muestran en la Figura que indica la etapa promedio
para la cual se usan diferentes mtodos en el procesado
corrientes abajo
Los productos de peso molecular bajo, generalmente

metabolitos secundarios (alcoholes, cidos carboxlicos y
aminocidos, antibiticos y vitaminas), se pueden recuperar
usando muchas de las operaciones estndar como la
extraccin lquido-lquido, la adsorcin y el intercambio inico,
Las protenas requieren atencin especial; no obstante,
como son suficientemente ms complejas, su funcin
depende de la integridad de una delicada estructura terciaria
tridimensional que se puede romper si la protena no se
maneja correctamente
Por esta razn, este captulo se centra principalmente en las
separaciones de protenas. Tambin se tratan las
separaciones de clulas, como una parte necesaria de la
secuencia del proceso corrientes abajo.
Las tcnicas usadas en las bioseparaciones dependen de:

la naturaleza del producto (esto es, de las propiedades
nicas y las caractersticas que proporcionan cmo
manipular la separacin) y
de su estado (esto es, si es soluble o insoluble, intra o
extracelular, etc.).
1.2 FASES DE SEPARACIN
Todo aislamiento inicial y las etapas de recuperacin

eliminan las clulas completas, los desechos celulares, los
slidos suspendidos y las partculas coloidales, concentran el
producto y, en muchos casos, logran algn grado de
purificacin, manteniendo todo el tiempo alto rendimiento.
1.2 FASES DE SEPARACIN
Para los compuestos intracelulares, la recoleccin inicial de

las clulas es importante para su concentracin previa a
abandonar el producto.
A continuacin de esta fase se emplea un conjunto de etapas

de purificacin para eliminar las impurezas restantes y
mejorar la pureza del producto; esta fase de purificacin, a su
vez, se sigue por etapas de refinado para extraer las ltimas
trazas de componentes contaminantes y las adiciones
relativas al proceso (por ejemplo, las sales Tampones,
detergentes, etc.), y la preparacin del producto para su
almacenaje y/o distribucin.
La prevencin y/o evitacin de la contaminacin es otra

meta importante de la elaboracin corrientes abajo.
1.3 RENDIMIENTO
Incluso para buenos rendimientos del 80-95 por 100 por
etapa, el rendimiento global puede ser pobre para
cualquier proceso que requiera un gran nmero de etapas.
Por ello, debe prestarse cuidadosa consideracin a la

optimizacin del proceso tanto en trminos de las operaciones
unitarias en s mismas como de su secuencia
1.4 METODOLOGA
Es usualmente deseable reducir el volumen del proceso al
inicio en la elaboracin corrientes abajo y eliminar cualesquiera
componentes que puedan extraerse con facilidad (partculas,
solutos pequeos, agregados grandes, cidos nucleicos, etc.) a
fin de evitar carga excesiva en los procesos de separacin ms
refinados comentes abajo.
En la seleccin de los procesos de separacin debe tenerse en

cuenta los posibles daos por temperatura y esfuerzos, as
como la desactivacin por proteasas endgenas.
1.5 PURIFICACIN DE PROTENAS

La proteina con propsitos teraputicos presenta ms
problemas que simplemente los tcnicos asociados con el
proceso de separacin. Debido a:
a la naturaleza compleja y su intrincada estructura
tridimensional,
la determinacin rutinaria de la estructura de la
protena , no est bien establecida.
Adems, la compleja naturaleza del sistema inmunitario
humano permite incluso que cantidades menores de
impurezas y contaminantes puedan ser biolgicamente
activas. Por eso, ha aparecido la regulacin de la
produccin de compuestos biolgicos en el concepto del
proceso que define el producto, ya que incluso cambios
pequeos e inadvertidos en el proceso pueden afectar la
seguridad y la eficacia del producto.
1.6 ELECCIN DE LOS PROCESOS UNITARIOS

La consistencia de la operacin unitaria, particularmente a la luz
de una alimentacin potencialmente variable del proceso de
cultivo/fermentacin, es la piedra angular de la definicin del
proceso. Las operaciones que carecen de fortaleza o que estn
sometidas a variacin significativa no deben considerarse.
Otro aspecto es la capacidad para cuantificar el rendimiento
de la operacin.
Finalmente, la facilidad con la que el equipo pueda limpiarse
de una manera verificable debe jugar un papel en la seleccin de
la operacin unitaria.
En el desarrollo de nuevos productos, a menudo ignora a las
consecuencias de las propiedades del medio en las etapas
posteriores de elaboracin corrientes abajo, como la filtracin y
la cromatografa.
I - Ruptura de clulas.
Los productos intracelulares de protenas estn presentes
tanto como:
protenas solubles,
enlazadas,
como de inclusin.
La liberacin de las protenas enlazadas debe considerarse

cuidadosamente. Las protenas activas estn sujetas a la
desactivacin y desnaturalizacin, y por eso requieren del uso
de condiciones favorables.
se debe prestar adecuada atencin al medio de suspensin; los

tampones o reguladores de usado se optimizan a menudo para
lograr la estabilidad de las protenas y protegerlas de la
proteolisis y la desactivacin.
Al contrario, los cuerpos de inclusin se protegen por medio de la

aglomeracin de protenas.
Condiciones ms crticas se emplean tpicamente para su

liberacin, que incluye operar a temperaturas ms altas si fuera
necesario.
Para protenas naturales se requieren mtodos ms suaves y

control de temperatura.
La liberacin del producto intracelular de las protenas se

logra a travs de la ruptura de las paredes de las clulas, y el paso
del producto de las protenas al medio circundante se obtiene tanto
mediante medios mecnicos como no mecnicos o por lisis
qumica, fsica o enzimtica.
Los mtodos mecnicos usan la presin, como en la prensa

francesa Manton/APV-Gaulin o el Microfluidizer, o la pulverizacin
mecnica, como en los molinos de bolas, emplendose el ltimo
tpicamente para flculos y usualmente slo para productos
naturales.
Los medios no mecnicos incluyen el uso de desecantes o

disolventes,
mientras que la lisis de las clulas se puede dar por medios:
fsicos
(choque
osmtico
y
ciclos
congelacin/descongelacin),
reactivos qumicos (detergentes, caotropos) o enzimticos
(lisozimas, fagos).
En los homogeneizadores basados en presin, las clulas

suspendidas en un medio acuoso se fuerzan a alta velocidad a
presiones por encima de 50 MPa. La liberacin del producto,
ocurre a travs del impacto del chorro de alta velocidad de las
clulas en suspensin sobre las superficies estacionarias, y
posiblemente tambin por los grandes esfuerzos cortantes
generados durante la aceleracin del lquido a travs del hueco.
A presiones excesivamente altas se puede asegurar una buena

separacin en un solo paso, el aumento de la temperatura
asociada adiabtica (~ 1,8 C/1.000 psig) puede causar prdidas
inaceptables de actividad de las protenas inestables al calor. Por
eso se prefieren mltiples etapas con enfriamiento rpido de la
suspensin de clulas procesadas entre las mismas.
Los cuerpos de inclusin, se recuperan normalmente mediante

centrifugacin, resulta a menudo ventajoso enviar el usado a
travs del homogenizador con etapas mltiples para disminuir el
tamao de partcula de los desechos de clulas. Como son
mucho ms densos que los desechos de clulas, se pueden
separar fcilmente mediante centrifugacin a bajas velocidades.
. Se pueden resuspender y centrifugar mltiples veces (a menudo

en presencia de bajas concentraciones de desnaturalizantes) para
limpiar
estos
agregados.
. Debido a que los cuerpos de inclusin ya estn
desnaturalizados, el control de la temperatura no es tan
importante como en el caso de protenas naturales.
En los molinos de bolas de alta velocidad de

agitacin, las clulas suspendidas se agitan por discos
que rotan a alta velocidad. Los molinos de bolas tienen
tiempos de residencia ms grandes que los

homogeneizadores a presin y
son susceptibles a la formacin de canales y
derramamiento del material de bolas.
La lisis qumica, o solubilizacin de la pared de la
clula, se lleva a cabo tpicamente usando detergentes tales
como el Tritn X-100 o la urea caotropos y el hidrocloruro de
guanidina.
Esta aproximacin tiene la desventaja de que puede conducir

a alguna desnaturalizacin o degradacin del producto.
Aunque se favorecen para la ruptura de las clulas a nivel de
laboratorio, sin embargo estos mtodos no se usan
comnmente a gran escala.
La destruccin enzimtica de las paredes de las clulas es

tambin posible, y como cada da se desarrollan ms vas
econmicas para la obtencin de enzimas apropiadas, este
enfoque puede encontrar aplicacin industrial. De nuevo, la
eliminacin de estos aditivos constituye un propsito.
Los mtodos fsicos como el choque osmtico, en el cual las

clulas estn expuestas a concentraciones altas de sal para generar
una diferencia de presin osmtica a travs de la membrana, puede
conducir a la ruptura de la pared de las clulas.
Una ruptura similar se puede obtener mediante el
sometimiento
de
las
clulas
a
ciclos
de
congelacin/descongelacin o por la presurizacin de las clulas
con un gas inerte (por ejemplo, nitrgeno) seguida por una
despresurizacin rpida. Estos mtodos no se usan comnmente
en operaciones a gran escala.
En la homogeneizacin, el lisado puede incrementar

drsticamente en viscosidad debido a la liberacin del ADN.
Esto se puede mejorar en algn grado usando pasos
mltiples para reducir la viscosidad.
Alternativamente, los precipitantes o enzimas de digestin de

cido nucleico se pueden usar para extraer estos contaminantes
de aumento de la viscosidad.
Para el procesado posterior a la lisis, se debe llevar a

cabo una cuidadosa optimizacin con respecto al pH y a la
fortaleza inica. A menudo resulta necesario hacer un
intercambio de tampn.
El desecho de clulas puede actuar como un
intercambiador de iones y enlazar protenas inicamente, lo
cual no les permite pasar a travs de un instrumento de
filtracin o hacer que giren en una centrfuga.
Una vez encontradas las condiciones ptimas, stas
pueden incorporarse en el tampn de lisado, tanto por
adicin directa (si se comienza a partir de la pasta de clulas)
como por diafiltracin (si se comienza a partir de un
concentrado de clulas).
Cell Lysis
Cell disruption is a method or process for

releasing biological molecules from inside a cell.
Cell lysis breaking, or lysing, cells
Cell lysis is used mostly in western blotting to
analyze the composition of specific proteins,
lipids and nucleic acids individually or as
complexes. Depending upon the detergent that is
used either all membranes are lysed or certain
membranes are lysed, leaving other membranes
intact. For example if the cell membrane only is
lysed then can be used to collect certain
organelles - microscopy or western blotting.
Some Elements of Cell Structure

Prokaryotic Cells
Cells that do not contain a membrane-enclosed nucleus are
classified as either Eubacteria or Archaea which have its own
potential
The bacteria cell envelope consists of an inner plasma
membrane that separates all contents of the cell from the
outside world, a peptidoglycan cell wall, and outer membrane
Bacteria cells with a very thick cell wall stain with crystal violet
(Gram stain) and are called Gram positive, while those with
thin cell wall stain very weakly Gram negative
Figure 3 Diagrammatic representations of the structural features of

the surfaces of Gram-positive and (b) Gram-negative bacteria. The
membrane is also called the plasma membrane or the cytoplasmic
membrane.
Most biological membranes are phospholipids bilayers

The bacteria cell wall protects the plasma membrane and the
cytoplasm from osmotic stress
The isoosmotic external concentration for most cells is 0.3
osmolar (osM)
Osmolarity refers to the molar concentration of all species in
solution including ionized species
Higher concentrations outside the cell draw out water and
cause the cytoplasm to shrink plasmolysis
The cell wall is rigid, so the cytoplasm collapses within the
plasma membrane while the wall does not
Concentration of salts and neutral solutes lower than 0.3 osM
outside the cell force water into cell turgor
Too much turgor can break the cell wall (lysis), a situation that
can aid in cell disruption for retained bioproducts

Eukaryotic cells
Eukaryotic cells (cells with nuclei and internal organelles) are
considerably more complicated than prokaryotic cells, and
bioproducts may have to released from intracellular particles
that are themselves coated with membranes and/or consist of
large macromolecular aggregates
The eukraryotes includes fungi, and, of course, the higher
plants and animals
The cell membrane of animal cells is easily broken, whereas
the cell wall of plants is strong and relatively difficult to break
Figure 5 Eukaryotic cells. Simplified diagrammatic representation of

an animal cell and a plant cell. The lysates of such cells contain the
internal structures (organelles) shown,
Figure 4 (a) Phospholipid molecule and its outline. (b) Cell plasma
membrane formed by phospholipids with their polar head groups
in contact with aqueous phases. The molecules are about 2.5 nm
long. Vertical bar represents a cholesterol molecule, and the large,
irregular blob represents a protein molecule that is in contact with
both the cytoplasm and the extracellular milieu.
Osmotic and Chemical Cell Lysis
Osmotic drastic reduction in extracellular concentration of solutes

If the transmembrane osmotic pressure is due to solute concentration
inside the cell and out, then the vant Hoff law can be used to estimate this
pressure, which apples to ideal, dilute solutions:
(3)
where = osmotic transmembrane pressure, R = gas constant, T = absolute
temperature (K), ci-co = difference between total solute molarity inside and outside
the cell, respectively
The weakening or partial destruction of these walls can be achieved with

chemical agents: detergents, chelators, enzymes, solvents and so on
Enzymes and antibiotics digestion of cell wall to allow osmotic rupture or
production of protoplasts
Detergents break plasma membrane and are commonly used to lyse
cultured animal cells
Nonionic detergents are used because they are far less denaturing
proteins and other biological compounds than ionic detergents
Solvents dissolve cell membrane and excess fat, may aid in precipitation
Mechanical Methods for Cell Lysis
Sonication
Ball milling
Pestle homogenization
Shearing devices (blender)
High pressure homogenizers
Bead mill
Cascading
beads
Rolling
beads
Cells being
disrupted
Disruption takes place due to the grinding action of the

rolling beads and the impact resulting from the cascading ones
Bead milling can generate substantial heat
Cryogenic bead milling : Liquid nitrogen or glycol cooled unit
Application: Yeast, animal and plant tissue
Small scale: Few kilograms of yeast cells per hour
Large scale: Hundreds of kilograms per hour.
Colloid mill
Rotor
Disrupted
cells
Cell
suspension
Stator
Typical rotation speeds: 10,000 to 50,000 rpm

Mechanism of cell disruption: High shear and turbulence
Application: Tissue based material
Single or multi-pass operation
French press
Plunger
Cell
suspension
Cylinder
Jet
Orifice
Impact
plate
Application: Small-scale recovery of intracellular proteins

and DNA from bacterial and plant cells
Primary mechanism: High shear rates within the orifice
Secondary mechanism: Impingement
Operating pressure: 10,000 to 50,000 psig
Ultrasonic vibrations
Ultrasound
generator
Ultrasound tip
Cell suspension
Application: Bacterial and fungal cells

Mechanism: Cavitation followed by shock waves
Frequency: 20 kHz
Time: Bacterial cells 30 to 60 seconds, yeast cells 2 to 10 mins.
Used in conjunction with chemical methods
CeII Disintegration Techniques
Flocculation & Coagulation

Flocculation
The formation of cell agglomerates usually by means of
bridging chemical molecules
Flocculation agent - a chemical or material, which
when added to a particular suspension causes
agglomeration to form
Coagulation
The destabilisation of cells by neutralisation of their charge
Mechanisms
Surface charge neutralisation - ionic saltIonic bridging
- Ca++ linkages
Polyelectrolyte bridging - synthetic charged polymers
Polymer entrapment - long chain polymers
Physical interaction - pellets
Chemico-physical method - surface chemistry
interactions,agglomeration after lysis.
Factors Affecting Agglomeration

Genetic characteristics
Surface charge
Complex surface chemistry
Broth components(e.g. glucose, metal ions)
Complex surface physical characteristics
Time dependent physiological states of cells
Environmental dependent physiological states
Disadvantages Of Flocculations
Poorly understood mechanisms, 'Poor control'
Unpredictable batch fermentations
Lack of operational data
Low dewatering
Costs
No recycling
Less applicable to cell debris
Physical instabilities / Shear degradation
2. RECOLECCION INICIAL
2.1 RECOLECCIN Y CONCENTRACIN INICIALES DEL
PRODUCTO
Las etapas iniciales del procesamiento se determinan en gran
medida mediante la localizacin de las especies de producto y
consisten generalmente en la separacin de clula-caldo y/o la
extraccin de desechos de las clulas.
Para los productos retenidos dentro de la biomasa durante la
produccin, es necesario primero concentrar la suspensin de las
clulas antes de la homogenizacin o tratamiento qumico para liberar
el producto.
En esta etapa la clarificacin para extraer los slidos suspendidos es
la meta del proceso.
Aunque se haga caso omiso de la localizacin de la protena y su

estado, la separacin de las clulas necesita ser barata, simple y
fiable, en la medida en que hay que manejar grandes cantidades de
caldo diluido de la fermentacin en el producto deseado.
Los objetivos son obtener un sobrenadante bien clarificado y

slidos de mxima sequedad, evitando la contaminacin mediante el
uso de una operacin contenida.
Los mtodos mecnicos, casi exclusivamente la centrifugacin y la

filtracin de flujo transversal, se prefieren en las separaciones de
clulas
Los productos intracelulares se pueden presentar tanto enlazados,

como protenas solubles, o como masas densas de protena no
enlazada (cuerpos con partculas extraas). Para estos productos es
necesario:
primero concentrar la suspensin de clulas antes de efectuar
la liberacin del producto. La filtracin resulta en una
suspensin de clulas de concentracin deseada hasta 15-17
por 100, y que puede ser diafiltrada en el sistema tampn
deseado.
En contraste, la suspensin celular que resulta de la
centrifugacin ser tanto de una masa seca (que requiere
resuspensin pero sustancialmente libre de caldo residual, por
ejemplo, a partir de una centrfuga tubular hueca) como de una
suspensin hmeda (que contiene caldo residual medible y que
requiere resuspensin adicional).
Durante la separacin, las condiciones que resultan en la

destruccin de clulas (tales como temperaturas extremas) deben
evitarse.
Adems, mientras la protena soluble est generalmente protegida

de rotura por esfuerzo cortante y proteolisis externa, estas
protenas an estn sujetas a desnaturalizacin trmica.
Para productos extracelulares, que son invariablemente solubles

en agua, la meta es la extraccin de clulas completas
(clarificacin) y, en el caso de productos tpicos de protena, la
extraccin de compuestos disueltos de bajo peso molecular.
Esto debe hacerse:
bajo condiciones relativamente suaves para evitar la
desnaturalizacin indeseada del producto.
De nuevo, tanto la filtracin como la centrifugacin se
pueden aplicar. La filtracin resulta en un sobrenadante libre
de clulas con disolucin asociada con la diafiltracin de la
suspensin final de clulas. La centrifugacin, prescindiendo del
modo, resultar en una pequea cantidad de clulas en el
extrado, pero no hay dilucin del sobrenadante
Durante el desarrollo del proceso deben realizarse

estudios cuidadosos para examinar los efectos del pH y
de la fortaleza inica sobre el rendimiento, como clulas, ya
que las clulas y los desechos de clulas pueden retener el
producto a travs de las interacciones de cargas.
Si el caldo o la morfologa de las clulas no permiten su

separacin por filtracin o si se requiere masa de clulas secas,
la centrifugacin tubular se utiliza normalmente.
Debe sealarse que las clulas de plantas y animales no pueden

soportar el mismo grado de esfuerzo cortante aplicado que las
clulas microbianas, y por eso la filtracin por flujo transversal o
por centrifugacin clsica no son aplicables. En estas
situaciones se emplean alternativas que usan equipos de bajo
esfuerzo cortante en condiciones adecuadas.
Para caldos completos, el rango de las densidades y

viscosidades encontradas afectan al factor de concentracin
que puede alcanzarse en el proceso y puede tambin conducir a
que la filtracin por flujo transversal no resulte econmica a
causa de los costos altos de bombeo, etc.
A menudo las caractersticas de la separacin del caldo pueden

mejorarse mediante su acondicionamiento usando tcnicas
fisioqumicas o biolgicas, normalmente de naturaleza patentada.
Las caractersticas importantes del caldo son

su reologa y
el acondicionamiento.
2.1.1 Centrifugacin.
La centrifugacin se basa en la sedimentacin incrementada de

partculas de densidad diferente a la del medio circundante cuando
se someten a un campo de fuerza centrfuga
Las ventajas de las separaciones por centrifugacin son

que pueden llevarse a cabo continuamente y
tienen pequeos tiempos de retencin, desde una fraccin de
segundo hasta segundos, que limitan el tiempo de exposicin de
componentes biolgicos sensibles a las tensiones por esfuerzo
cortante.
Los rendimientos son altos, siempre que la temperatura y otras

condiciones del proceso se controlen adecuadamente.
Presentan pequeos requerimientos de espacio y una eficiencia

de separacin ajustable que las convierte en una operacin unitaria
verstil.
Pueden estar completamente cerradas para evitar la

contaminacin, y, en contraste con la filtracin, no requieren
aditivos externos que pudieran contaminar el producto final.
La capacidad actual para contener los aerosoles generados

tpicamente por las centrfugas se suma a su operabilidad y
seguridad.
Las
velocidades
de
sedimentacin
deben
ser
suficientemente altas para lograr la separacin y pueden
mejorarse mediante la modificacin de las condiciones de la
solucin para promover la agregacin de protenas o impurezas.
Un incremento de la precipitacin de las especies que

contaminan puede lograrse a menudo por una reduccin en pH
o un incremento de temperatura.
Los agentes de floculacin, que incluyen polielectrolitos,

cationes polivalentes y sales inorgnicas, pueden causar un
aumento de las velocidades de sedimentacin de 2.000
veces. Algunos ejemplos son el polietileno amina, el EDTA y las
sales de calcio.
Las ayudas del bioprocesamiento catinico (celulsico o

polimrico) reducen el pirgeno, el cido nucleico y las cargas de
protenas acdicas que pueden ensuciar las columnas de
cromatografa.
La eliminacin de estos aditivos tanto durante la centrifugacin

como en las siguientes etapas del proceso se debe demostrar
claramente.
2.1.1 A. TIPOS DE CENTRFUGAS

Clasificadas de acuerdo a la forma en la cual se maneja el
transporte del sedimento. La seleccin de un tipo particular de
centrfuga se determina por su capacidad para la manipulacin
del sedimento
Las centrfugas de retencin de solitius se operan en modo
semicontinuo, debido a que deben pararse peridicamente
para extraerles los slidos acumulados; se usan
principalmente cuando
las concentraciones de slidos son bajas, y han
encontrado aplicacin durante la clarificacin y
la separacin simultnea de dos lquidos.
Las centrfugas de evacuacin de slidos, stos se extraen

intermitentemente tanto a travs de los huecos radiales como
axialmente, mientras la mquina est operando a mxima
velocidad. Estas mquinas verstiles pueden usarse para.
tratar una variedad de alimentaciones, incluyendo levadura,
bacterias, micelias, antibiticos, enzimas, etc.
Las centrfugas de descarga de slidos de tobera tienen una
capacidad grande y pueden acumular hasta un 30 por 100 de
cargas de slidos.
Las centrfugas decantadoras consisten en un tambor,
parcialmente cilindrico y parcialmente cnico, y un transportador de
tornillo sinfn interno para el transporte de los slidos, que se
descargan por el extremo cnico. Los lquidos se descargan por el
extremo cilndrico. Los niveles dentro del tambor se ajustan por
medio de toberas externas.
Las unidades de flujo continuo, decantador en espiral son

ms fciles de usar desde una perspectiva operacional;
no se espera la parada de la centrfuga durante el procesado
de una carga.
Mientras que la centrfuga de apilado de discos es un
instrumento del proceso dentro de las industrias farmacuticas y
de biotecnologa, la regulacin precisa del tiempo de expulsin de
los slidos y la naturaleza continua de alta velocidad del
instrumento conducen a un equipo complejo y a un
mantenimiento frecuente, se usa para:
recolectar clulas, ya que los slidos generados estn
sustancialmente hmedos y provocan prdidas moderadas de
rendimiento en los sistemas extracelulares del producto.
Para el procesado intracelular del producto, el sedimento
hmedo de la clula es fcilmente resuspendido para su uso
en la elaboracin posterior.
El recipiente tubular, en contraste, es una unidad de proceso

semicontinuo debido a la capacidad limitada de slidos del recipiente.
El uso de esta unidad requiere la parada de la centrfuga durante el
procesado de la carga :
La naturaleza de la operacin semicontinua de estas centrfugas
puede incrementar los tiempos del ciclo de proceso por la
introduccin de lminas desechables para actuar como forros del
recipiente.
La naturaleza seca de los slidos generados hace que la
centrfuga tubular sea adecuada para el procesado extracelular de
protenas, ya que las prdidas en el sedimento de las clulas son
mnimas.
Por el contrario, la naturaleza seca y compacta del sedimento
puede hacer difcil la resuspensin de las clulas. Esto puede
resultar problemtico en el procesado intracelular de las protenas,
donde las clulas se homogeneizan en quebranta-dores mecnicos
que se obstruyen fcilmente.
Centrifugation Efficiency
Cetrifugation efficiency is favoured by:
large particle diameter of cells

large density difference between cell and liquid
the liquid should have a low viscosity
In practice, particles of biological material are often

small and of low density, which fermentation broths are
often viscous, and high density.
It requires :
high angular velocity
large radius(of centrifuge)
large volume
thin sedimentation layer
Types Of Centrifuge
1) Tubular bowl
Hazards to the enzyme are aeration and the
consequent foaming of the clarified solution,
which aerosol formation may be a hazard to
the user. This occurs because of turbulence
in the bowl.
Very high angular velocity turbulence
foaming & aerosol
2) Multichamber
They have large radius, low angular velocity, thus
sedimentation occurs with high efficiency over large
surface area.
They're widely used for Baker's yeast.
Some heating(because the bowl is located above the gearbox)
represents a danger to the enzyme.
3) Scroll
They used for continuously handling coarse material(such as
sewage sludge. They're few hazards to enzymes.)
4) Basket
They used for food.
Recovery and Purification of Bio-Products

- Liquid and solid separation
- solid particles: mainly cellular mass, specific gravity 1.05-1.1.
size (diameter):
bacterial cells: 0.5-3 m
yeast cells: 5 -10 m
mold: 5-15 m in diameter and
50-500 m in length
animal cells: 10 m
plant cells: 20 m
Methods: filtration and centrifugation
Liquid-Solid Separation
Filtration
Physical separation of solid particles from liquid or
gas.
a porous medium: allow fluid to pass through
solid particles to be retained.
Filter cake
Slurry flow
Filter medium
Filtrate
Filtration
Rotary vacuum filtration
Particle size: greater than 10 m, yeast, mold, animal
or plant cells.
i.e. mycelium separation for antibiotics production or
waste water treatment
Microfiltration
Particle size: 0.1 - 10 m, bacterial and yeast cells.
Ultrafiltration
Size: 10-200 , Cell debris, macromolecules
Rotary Vacuum Filter

A rotary vacuum filter is a continuous filter partially submerged
in the slurry.
- A drum is covered with a filter medium.
-Vacuum is applied to within the drum
- As the drum rotates, the solid constituent is separated by retained on the porous
medium
The liquid is drawn through the cake
into the inner filtrate pipes.
Each revolution consists of cake formation,
cake washing (if required),
drying and cake discharge.
http://www.solidliquid-separation.com/
VacuumFilters/vacuum.htm
http://www.komline.com/Products_Services/
Filtration/RotaryVac.html

The rate of filtration (the flow of the filtrate) for (vaccum) filtration
operation can be determined by (Bennet &Myers, Momentum, Heat
and Mass Transfer, 1974, p221, the equation is from the mass balance of the
cake.)
gc pA
dV
dt (rm rc )
where V is the volume of filtrate (m 3 ), A is the surface area of the filter (m 2 ),
p is the pressure drop through the cake and the filer medium (N/m 2 ),
is the viscosity of the filtrate (kg/m - s),
rm is the resistance of the filter medium (m -1 ),
rc is the resistance of the cake (m -1 ).
g c is 9.8
kg m
kg f s 2

The cake resistance rc is given by
W
CV
rc
,
A
A
where W CV
is the average specific resisitance of the cake (m/kg).

W is the total weight of the cake on filter (kg).
C is the weight of the cake deposit per unit volume of filtrate (kg/m 3 ).
Then the equation of the filtration rate with constant A becomes
g c pA
dV
CV
dt
(r
)
m
A

Assuming incompressible cake: constant & constant pressure.
Integrating the following equation (V at t, V=0 at t=0) yields
dV
Ag c p
CV
dt
(r
)
m
A
V 2 2VV0 Kt (Ruth equation)

rm
V0
A,
C
2 A2
pg c
K
C
V0 and K can be determined by experimental data.

The expermental data points V ~ t are obtained.
Ruth equation can be rearranged as
t
1
(V 2V0 )
V K
t
Plot versus V, the slope is 1/K,
V
and the intercept is 2V0 / K .
t/V
V0 , K determine parameters : rm , , or p

To design a scaled-up rotary vaccum filter
If given a total volume of fermentation broth Vb and
required time tb to complete the filtration task at the large scale,
determine the filter surface area.
Based on the results from the smaller filter
(incompressible cake: same , medium & pressure drop):
Vb 2 2Vb V0 Kt b (Ruth equation)

2A 2
rm
b pg
V0
Ab , K
c
C
C
Substitute V0 and K in the Ruth equation by the above two expressions,

A b , the surface area of the bigger filter, can be determined.

For incompressible cake: constant .
If filtration rate is constant,
dV
q0 (constant ) V q0t , V 0 at t 0
dt
dV
Ag c p
q0
dt r CV
m
A
p K1q0 t K 2 q0
rm
C
K1
, K2
2
gc A
gc A
Filtration
Rotary vacuum filtration
Particle size: greater than 10 m, yeast, mold, animal or plant cells.
i.e. mycelium separation for antibiotics production or waste water
treatment
Microfiltration
Particle size: 0.1 - 10 m, bacterial and yeast cells.
Ultrafiltration
Size: 10-200 , Cell debris, macromolecules
(antibiotics, proteins, polysaccharides)
Liquid-Solid Separation Filtration

Microfiltration & Ultrafiltration
Use membrane as porous medium for filtration.
Challenge: gel formation on the surface of membrane.
Solution: cross-flow (tangential flow filtration)
Pressure P1
Feed in
Pressure P2
Feed out
Liquid-Solid Separation Filtration

Centrifugation
- Particle size: 100-0.1 m
- more expensive than filtration
- limited for scale-up
- drive force: centrifugal force
Example (ex.11.1 in the textbook for solution)

The following data were obtained in a constant-pressure
unit for filtration of a yeast suspension:
t(min)
4
20
48
76
120
V(L)
115 365 680 850 1130
Characteristics of the filter are as follows:
A=0.28m2, C=1920kg/m3, =2.9X10-3 kg/m-s, =4m/kg
Determine:
a) The pressure drop across the filter.
b) The filter medium resistance.
c) The size of the filter for the same pressure drop to
process 4000L of cell suspension in 20 min.
Membranes Filtration
Reverse osmosis, ultrafiltration, nanofiltration :
Concentration of enzymes
Ultrafiltration :
molecules are forced hydraulically through a membrane of
very small pore size.
Reverse osmosis :
A ultrafiltration using a membrane with pores small enough to
allow the passage of solvent molecules only, as in the
desalination of sea water.
Ultrafiltration is a particularly useful method for enzyme work.
Electrophoresis
A separation technique often applied to the analysis of
biological or other polymeric samples
Among the most powerful for estimating purity
because of its simplicity, speed, and high resolution,
and also because there is only a small probability that
any of the components being analyzed will be lost
during the process of analysis
Has frequent application to analysis of proteins and
DNA fragment mixtures and has been increasingly
applied to the analysis of nonbiological and
nonaqueous sample
The electric field doest not effect a molecules
structure, and it is highly sensitive to small difference
in molecular charge, size and sometimes shape
Electrophoresis
Principles
The fundamental principle behind electrophoresis is the
existence of charge separation between the surface of a
particle and the fluid immediately surrounding it
An applied electric field acts on the resulting charge density,
causing the particle to migrate and the fluid around the particle
to flow
The electric fields exerts a force on the particles charge or
surface potential
Two particles with different velocities will come to the rest in
different locations after a fixed time in an electric field The
particle velocity is related to the field strength by
(1) V: particle velocity, E: field strength or gradient (voltage per length),

U: apparent electrophoretic mobility.
There are two contributions to this apparent electrophoretic

mobility:
(2)
Uel: electrophoretic mobility of the charged particle

Uo: the contribution from electroosmotic flow.
Modes of Electropheretic Separation
Gel electrophoresis
In gel electrophoresis, migration takes place though a gel slab

A common gel material for the study of proteins is cross-linked
polyacrylamide
In most cases, the goal of experiment is to separate a sample
according to molar masses of its components
However, the shape and charge will also determine the drift
speed
One way to avoid this problem and to effect separation by
molar mass is to denature the proteins in a controlled way
Sodium dodecyl sulfate is an anionic detergent that is very
useful in this respect: it denatures proteins, whatever their initial
shapes, into rods by forming a complex with them
Moreover, most proteins bind a constant amount of ion, so that
the net charge per protein is well regulated
Under these conditions, different proteins in a mixture may be
separated according to size only
Figure 1 SDS-PAGE (denaturing gel electrophoresis) and Western blot results for
bovine growth hormone (bGH) expressed as a C-terminal fusion to E. coli NusA
protein. (a) Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)
results with Coomassie blue staining. (b) Western blot results obtained by using rabbit
anti-bGH polyclonal antibody and visualized by means of chemiluminescence. Fusion
proteins were expressed at 37C in E. coli by induction of the tac promoter. Equal
portions of cell lysate, soluble fraction, and insoluble fraction were loaded. Key: m,
markers; u, uninduced whole cell lysate; i, induced whole cell lysate; sol, soluble
fraction; ib, inclusion body fraction.
Capillary electrophoresis
The drift speeds attained by polymers in traditional

electrophoresis methods are rather low; as a result, several
hours are often necessary to effect good separation of complex
mixtures
One way to increase the drift speed is to increase the electric
field strength
However, there are limits to this strategy because very large
electric fields can heat the large surfaces of an electrophoresis
apparatus unevenly, leading to nonuniform distribution of
electrophoretic mobilities and poor separation
In capillary electrophoresis, the sample is diepersed in a
medium (such as methylcellulose) and held in a thin glass or
plastic tube with diameters ranging from 20 to 100 m
The small size of the apparatus makes it easy to dissipate heat
when large electric fields are applied
Figure 2 Separation of proteins by open tubular capillary electrophoresis,

carried out in a 75 cm x 75 m surface modified capillary at an applied voltage
of 75 kV. Peak identities: A, egg white lysozyme; B, horse heart cytochrome c;
C, bovine pancreatic ribonuclease a; D, bovine pancreatic -chymotrypsinogen;
F, equinemyoglobin.
Isoelectric focusing
Naturally occurring macromolecules acquire a charge when dispersed in

water
An important feature of proteins and other biopolymers is that their overall
charge depends on the pH of the medium
For instance, in acidic environments protons attach to basic groups and the
net charge is positive; in basic media the net charge is negative as a result
of proton loss
At the isoelectric point, the pH is such that there is no net charge on the
biopolymer
Consequently, the drift speed of the biopolymer depends on the pH of the
medium, with s = 0 at the isoelectric point
Isoelectric focusing is an electrophoresis method that exploits the change of
drift speed with pH
Consider a mixture of distinct proteins dispersed in a medium with a pH
gradient along the direction of an applied electric field
Each protein in the mixture will stop moving at a position in the gradient
where the pH is equal to the isoelectric point
Support Media
Paper Electrophoresis
One of the first matrices used for electrophoresis

In paper electrophoresis, the sample is applied directly to a zone
on the dry paper, which is then moistened with a buffer solution
before application of an electric field
Dyes are combined with samples and standards to help
visualize the progress of the electrophoresis
The movement of samples on paper is best when the current
flow is parallel to the fiber axis in the paper
Some advantages of paper are that it is readily available and
easy to handle, requires no preparation, and allows the rapid
development of new methodologies
Besides being easy to obtain, paper does not contain many of
the bound charges that can interfere with the separation
A disadvantage of paper electrophoresis is that the porosity of
commercial paper is not controlled, and therefore the technique
is not very sensitive, nor is it easily reproducible
Support Media
Polyacrylamide Gels
One of the most commonly used electrophoretic
methods
Analytical uses of this technique center on protein
nucleic acid characterization (e.g. purity, size, or
molecular weight, and composition)
Acrylamide is neurotoxin, however, the reagents must
be combined extremely carefully
The sieving properties of the gel are defined by the
network of pores established during the polymerization
: as the acrylamide concentration of the gel increases,
the effective pore size decreases
The most commonly used combination of chemicals to
produce a polyacrylamide gel is acrylamide,
bisacrylamide, buffer, ammonium persulfate, and
tetramethylenediamine (TEMED)
Agarose Gel
Support Media
Agarose is a polymer extracted from red seaweed

When agar is extracted from the seaweed, it is in two components,
agaropectin and agarose
The agarose portion is nearly uncharged, making it desirable for use as on
electrophoresis matrix
The advantages of agarose electrophoresis are that it requires no additives
or cross-linkers for polymerization, it is not hazardous, low concentration
gels are relatively sturdy, and it is inexpensive
Commonly used for the separation of large molecules such as DNA
fragments
Capillaries
The fused silica capillaries are flexible due to an outer polyimide coating and
are available in inner diameters ranging from 10 to 300 m
Fused silica is transparent to UV light, which enables the capillary to serve
as its own detection flow cell
Electrostatic interactions with the capillary surface can develop, however,
when charged species are being separated
To overcome this problem is to chemically modify the inner capillary surface
to produce a nonionic, hydrophilic coating, resulting in the shielding of the
silanol functionalities
Support Media
Comparison of Electrophoresis Matrices
Detection Techniques
Chemical Staining
Incorporate a fixing step, such as a soak in dilute acetic acid

for 1 h, etiher before or in conjunction with staining.
Frequently used stains: Coomassie brilliant blue (R250 and
G250) and silver stain
The gel then is scanned with densitometer
Fluorescence
Provides much better detection limit than simple chemical
stains, typically involves the covalent binding of the fluorescent
residue to the analyte
Fluorescamine- popular reagent for labeling of proteins
At room temp. and alkaline pH, fluorescamine can react with
primary amine on the protein to generate a fluorescent
derivative
The reagent ethidium bromide often used to visualize DNA
Detection Techniques
Radioactivity
If a sample is radioactive, the bands that separate during

electrophoresis are subsequently radioactive
When the separation is complete, the electrophoretic matrix can
be placed against x-ray film until the radiation makes a mirror
image of the banding pattern on the film
Immunoelectrophoretic Techniques
Known as crossed immunoelectrophoresis
A sample is first run longitudinally through an agarose gel for a
predetermined time
Second, a longitudinal strip of the gel area in which of the
sample was electrophoresed is typically cut out and placed into
a similarly sized area of an antibody containing gel
As an electric current is applied to the gel, each band of the
sample with form an antigen-antibody precipitation pattern
through the gel
Qu es la electroforesis?
Tcnica de separacin que se basa en la

diferente movilidad o velocidad de
migracin de partculas cargadas debido a
la accin de un campo elctrico
La electroforesis convencional ha sido utilizada durante

muchos aos para separar especies complejas de
elevado peso molecular de inters biolgico y
bioqumico. Las separaciones se llevan a cabo sobre
una capa delgada y plana o placa de un gel semislido y
poroso que contiene un tampn acuoso en el interior de
sus poros. Esta ser la sustancia encargada de ofrecer
resistencia al movimiento de las molculas, controlando
as
su
migracin
uniforme
.
Mediante esta tcnica se pueden separar varias

muestras simultneamente. Dichas muestras se
depositan sobre el gel, se aplica un potencial de
corriente continua a travs del mismo durante un tiempo
fijo. Cuando las separaciones se han completado se
interrumpe el paso de corriente y las especies
ELECTROFORESIS
Separar y analizar molculas:
protenas
ADN/ARN
... en funcin de su diferente movilidad al aplicar un campo elctrico

(depender de su carga elctrica)
ctodo
nodo
* Molc. (+) polo (-) o ctodo

* Molc. (-) polo (+) o nodo
ELECTROFORESIS LIBRE
molculas en disolucin o suspensin:
poco resolutiva
SOPORTE
ctodo
nodo
ELECTROFORESIS DE ZONA
SOPORTE que retiene las molculas:
elevado poder de resolucin
FUNDAMENTO DE LA ELECTROFORESIS
Estudia
la
migracin de
las partculas
coloidales en
el seno de un
campo
elctrico
SEPARACIN DE LOS ELEMENTOS DE

UNA MEZCLA
Separa
los diferentes
elementos que componen
una mezcla compleja en
funcin de la carga elctrica
de los mismos
VELOCIDAD DE LAS
PARTICULAS
Depende de ...
La carga de las
mismas
La intensidad del
campo elctrico y
Del coeficiente de
friccin de las
molculas con el
medio
TIPOS DE ELECTROFORESIS
Libre
Tipos de
electroforesis
Papel
Sobre
soporte
Acetato de celulosa
Gel
Almidn
Poliacrilamida
Agar
APLICACIN DE LA
ELECTROFORESIS
Fraccionamiento
de
las hemoglobinas
Diferenciacin de la
hemoglobina fetal
Diagnstico de
talasemias, anemias
falciformes, etc
Protenas
sricas
Protenas urinarias
Lipoprotenas
cidos nucleicos
Enzimas
Inmunoelectroforesis
Etc.
La electroforesis en gel es muy utilizada

en la deteccin, control de pureza,
caracterizacin, cuantificacin (por
comparacin con controles) as como
preparacin y purificacin (por extraccin
de bandas desde el gel) de molculas y
fragmentos de DNA y RNA.
3.1 Precipitacin.
La precipitacin de producto, impurezas o contaminantes se
puede inducir mediante
la adicin de solventes,
sales o polmeros a la solucin,
por incremento de temperatura o por ajuste del pH de la
solucin
Se usa en las etapas iniciales de la secuencia de separacin,
en las etapas que siguen a la centrifugacin, filtracin y/o
homogeneizacin.
La precipitacin se lleva a cabo en dos etapas,
extraccin de las impurezas masivas y
la precipitacin y concentracin la protena de inters.
Generalmente, se forman precipitados amorfos debido a la
oclusin de sales o solventes, o a la presencia de impurezas.
Las sales se pueden usar para precipitar las protenas

mediante los efectos de desalacin. La efectividad de
diferentes sales se determina por las series de Hofmeister, con
aniones que son efectivos en el orden siguiente:
citrato >PC>4 > SO4 > CH3COO-> Cl~ > NO3,
y en los cationes de acuerdo a: NH4 > K+ > Na+
Las sales deben ser baratas debido a las grandes cantidades
usadas en las operaciones de precipitacin. El sulfato de
amonio es el precipitante ms usado comnmente.
Las desventajas de este enfoque incluyen la baja
selectividad, alta sensibilidad a las condiciones de operacin y
las complicaciones corrientes abajo asociadas con la
extraccin de sal y la disposicin de la corriente de alto
contenido de nitrgeno.
los agregados formados en la precipitacin con sulfato de

amonio son frgiles y fcilmente se rompen por esfuerzo
cortante. Por eso, estas operaciones de precipitacin son,
siguiendo a la adicin de sal, envejecidas sin agitacin
antes de alimentarse a una centrfuga por gravedad o bombas
de bajo esfuerzo cortante (por ejemplo, las bombas de
diafragma).
Los disolventes orgnicos ms usados comnmente para la
precipitacin de protenas son la acetona y el etanol
Estos disolventes (acetona etanol) pueden causar alguna
desnaturalizacin de la protena producto. Se pueden usar
temperaturas por debajo de 0 C debido a que los disolventes
orgnicos reducen el punto de congelacin del agua. El
precipitado
formado
es
a
menudo
un
polvo
extremadamente fino que resulta difcil de centrifugar y
manipular.
Con disolventes orgnicos se prefieren los mezcladores en

lnea, pues minimizan los gradientes de concentracin del
disolvente y las regiones de concentraciones altas de
disolvente, que pueden conducir a una desnaturalizacin
significativa y a la precipitacin local de componentes
indeseados, tpicamente abandonados en los licores madre.
En general, la precipitacin con disolventes orgnicos a

temperaturas ms bajas incrementa el rendimiento y
reduce la desnaturalizacin. Se lleva mejor a efecto para
fortalezas inicas de 0,05-0,2 M.
Los polmeros solubles en agua y los polielectrolitos (por

ejemplo, el polietilenglicol, el cido poliacrlico de polietilenoimina) se usan con xito en las precipitaciones de
protenas, y han tenido xito en precipitaciones por afinidad en
donde ligandos apropiados y asociados a polmeros se pueden
acoplar con las protenas de inters para mejorar su
agregacin.
La precipitacin de protenas puede tambin lograrse por

ajuste del pH, ya que las protenas exhiben generalmente su
ms baja solubilidad en un punto isoelctrico.
Las variaciones de temperatura a concentracin salina

constante permiten la precipitacin fraccional de protenas.
La precipitacin se lleva a cabo normalmente en tanques

cilndricos estndar con impulsores de bajo esfuerzo
cortante. Si se va a usar el mezclado en lnea del agente
precipitante, este mezclado se emplea justo antes de que el
material entre al tanque para hacerle reposar por un tiempo.
Debido a la pobre filtrabilidad que presentan normalmente

los precipitados, se recolectan usando una centrfuga.
3.2 Extraccin.
El reparto de la protena deseada a una segunda fase en una
operacin de extraccin lquido-lquido se puede lograr
usando sistemas acuosos de polmeros en dos fases (o
soluciones micelares de fase separada
Los disolventes orgnicos tpicamente ms identificados con

las operaciones de extraccin por disolvente no se pueden
usar aqu a causa de las restricciones en la solubilidad de la
protena y porque conducen a la desnaturalizacin y a la
degradacin de la protena.
3.2.1 Extraccin con sistemas acuosos de polmeros de dos

fases:
Son
buenos para caldos no clarificados, ya que las
partculas tienden a colectar en la interfase entre las dos
fases, haciendo su extraccin muy eficiente.
Tambin pueden usarse inicialmente en la secuencia de
procesado para la reduccin inicial de volumen masivo y la
purificacin parcial.
Estos procesos no han sido aplicados ampliamente todava,
debido tanto a la carencia general de experiencia con estos
sistemas de fase como por la necesidad de extraer los
reactivos qumicos de formacin de las fases (polmeros, sales,
detergentes) de los productos.
La separacin se fundamentan en que cuando dos

polmeros, o un polmero y ciertas sales, se mezclan juntos en
agua son incompatibles, formando dos fases inmiscibles
pero con predominio de las fases acuosas, cada una rica en
uno solo de los componentes.
Un diagrama de fase para un sistema de dos fases de polietilenglicol (PEG)-Dextrano.
Se sabe que las protenas se distribuyen irregularmente

entre estas fases, y puede usarse para la concentracin
selectiva y la purificacin parcial de los productos.
La particin entre las dos fases se controla mediante la

concentracin y el peso molecular del polmero, la carga neta
de la protena y su tamao, as como las interacciones
hidrofbicas y electrostticas.
Los ligandos con afinidad covalentemente enlazados a uno

de los polmeros de formacin de las fases se ha encontrado
que resultan efectivos en la mejora sustancial de la
selectividad y del comportamiento de la particin.
La recuperacin del producto de estos sistemas se puede

lograr tanto mediante cambios de temperatura o en la
composicin del sistema.
3.2.1.a Pasos Recuperacin del producto con extraccin en

sistemas de dos fases:
1.
2.
3.
El polmero de formacin de fases y la sal se aaden

directamente al caldo de fermentacin.
Las clulas o desechos de clulas y las protenas que
contaminan se reparten en la fase rica en sal y se
descartan.
A continuacin del ajuste de pH de la fase rica en
polmero, se aade ms sal para inducir la formacin de
un sistema nuevo de dos fases en el cual el producto se
recupera en la fase salina y el polmero se puede reciclar.
3.2.2 Extraccin Selectiva

Se usan soluciones micelares invertidas
En estos sistemas se agregan detergentes solubles en una
fase de aceite para estabilizar las pequeas gotitas de agua
que tienen dimensiones similares a las de las protenas que
van a separarse y pueden hospedar especies hidroflicas
como protenas en disolventes orgnicos de otra manera
inhabitables, permitiendo as que estas fases orgnicas se
usen como extractoras de protenas.
La efectividad de la solubilizacin de los disolventes se
determina por el pH relativo al punto isoelctrico de la
protena, la distribucin de carga y la asimetra en la
superficie de la protena y el tipo (aninico o catinico) del
surfactante usado en la fase micelar invertida.
La recuperacin del producto a partir de soluciones

micelares invertidas se da mediante :
simple extraccin hacia atrs, por contacto con una
solucin acuosa que tenga una concentracin salina y un
pH que desfavorezca la solubilizacin de protenas, pero
ste no resulta siempre un mtodo de confianza.
La adicin de cosolventes como el acetato de etilo o
alcoholes conducen a la ruptura de las micelas y a la
expulsin de las especies de protenas, pero esto
tambin puede conducir a la desnaturalizacin Estos
aditivos deben eliminarse mediante destilacin,
La eliminacin del agua de las micelas invertidas mediante

tamices moleculares o gel de slice se ha usado tambin para
provocar la precipitacin de la protena de la fase orgnica.
Las soluciones detergente-acuosas de concentracin y

temperatura apropiadas pueden separar la fase para formar
dos fases, una rica en detergentes, posiblemente en la forma
de micelas, y la otra agotada en detergente (Pryde y Phillips,
op. cit.).
Las protenas se distribuyen entre las dos fases:
las hidrofbicas (por ejemplo, la membrana) en la fase rica
en detergente y
las hidroflicas en la fase libre de detergente. Hay
indicaciones de que las propiedades de exclusin de
tamao de estos sistemas se pueden explotar tambin para
las separaciones virales.
Estos sistemas se pueden manejar de la misma forma que los
sistemas acuosos de dos fases.
Extraccin lquido-lquido
Disolventes utilizados:
- Diclorometano CH2Cl2
Cloroformo CHCl3
Tetracloruro de carbono CCl4
Benceno C6H6
Alcohol isoproplico CH3CHOHCH3
Eter dietlico CH3CH2OCH2CH3
Extraccin slido-lquido
Ejemplos:
Obtencin de aceite de frutos oleaginosas.
Lixiviacin de minerales.
Sistemas bifsicos acuosos

POLMERO 1
POLMERO 2
POLIETILENGLICOLES
DEXTRANOS
POLIETILENGLICOLES
1-4-DEXTRINAS
POLIETILENGLICOLES
ALQUILCELULOSAS
POLIPROPILENGLICOLES
1-4- DEXTRINAS
POLMERO
SAL
POLIETILENGLICOLES
SULFATO DE MAGNESIO
POLIETILENGLICOLES
FOSFATO DE POTASIO
POLIETLENGLICOLES
CITRATO DE POTASIO
POLIETILENGLICOLES
SULFATO DE AMONIO
Aplicacin de Sistemas Bifsicos Acuosos (SBA)

para el aislamiento de toxinas ofdicas.
En este proceso se aplica el sistema bifsico acuoso
plietilnglicol (PEG)-Fosfato, para el aislamiento de
una enzima acdica con actividad fosfolipasa,
componente que, junto a las proteasas, es el
principalmente responsable de la intoxicacin que
causa el veneno de Bothrops alternatus (yarar
grande).
Reparto de protenas vegetales en sistemas

bifsicos acuosos
Intervienen las caractersticas del reparto de protenas
de ltex de Ficus carica en sistemas bifsicos acuosos
para el aislamiento y purificacin de papana, una de las
ms valiosas enzimas del ltex, por la multiplicidad de
sus aplicaciones. Para ello se prepararan sistemas
bifsicos formados por polietilenglicol de peso molecular
4000 y fosfato de potasio en presencia de 4% de NaCl y
agua. La papana, tiene preferencia por la fase rica en
fosfato de potasio.
Obtencin del acido Giberlico por el hongo

Gibberella fujikuroi
El cido giberlico (GA3) es una hormona

vegetal de gran importancia en la
agricultura ya que proporciona una gran
variedad de beneficios como la
elongacin de tallos y el aumento en el
tamao de algunos frutos.
PROTEASAS DE HONGOS: a partir de hongos que son

de inters en la industria alimenticia como anlogas de
la quimosina (elaboracin de queso), etc.
TRIPSINA : a partir de pncreas bovino. Este proceso
puede ser transferido a la industria del cuero,
alimenticia, y farmacutica.
LACTOFERRINA: a partir de suero de queso. Se
emplea como conservante de alimentos debido a su
capacidad de inhibir el crecimiento bacteriano.
ESTUDIO DEL ESTADO CONFORMACIONAL DE LA
BETA LACTO GLOBULINA POR PARTICION EN DOS
FASES INMISCIBLES
3.3 Adsorcin.
La adsorcin puede usarse para
la eliminacin de pigmentos y cidos nucleicos,
o para la adsorcin directa de las protenas deseadas.
Las operaciones de lecho expandido o de carga agitada
permiten la presencia de materia con partculas, sin embargo
los lechos fijos no se recomiendan para caldos no clarificados
debido a problemas de ensuciamiento.
Estas separaciones pueden efectuarse a travs de
interacciones de carga, hidrofbicas o
de afinidad, entre las especies y las partculas absorbentes,
como en las etapas cromatogrficas que se explican a
continuacin.
3.3.1 Aplicacin de la adsorcin en el proceso de extraccin

1.
En la extraccin reciclada por afinidad continua (CARE) las
gotas
adsorbentes
se
aaden
directamente
al
homogeneizado celular y
2.
la mezcla se alimenta a una unidad de microfiltracin. Las
gotas cargadas con el soluto deseado se retienen por la
membrana y
3.
el producto se recupera en una segunda etapa mediante
el cambio de las condiciones del tampn para
desfavorecer la ligazn.
3.4 Procesos de membrana.

Los procesos de membrana tambin se usan, y la diafiltracin
resulta conveniente para la extraccin de pequeas
especies contaminantes como sales y protenas ms
pequeas, y pueden combinarse con etapas siguientes para
concentrar la protena.
Siempre que se hayan seleccionado los materiales adecuados
de las membranas para evitar las interacciones de la
membrana con las protenas, la diafiltracin usando
membranas de ultrafiltracin es un proceso directo con alto
rendimiento y ahorro de capital.
Estas operaciones pueden tolerar a menudo las
concentraciones de la protena deseada a su lmite de
solubilidad, maximizando la eficiencia del proceso.
4 PURIFICACIN FINAL Y FORMULACIN

DEL PRODUCTO
Las etapas son las responsables de la eliminacin de las
ltimas trazas de impurezas.
Es necesaria la reduccin de volumen en las etapas
iniciales de la secuencia de sepa racin para asegurar que
estas operaciones de alta resolucin no se sobrecargan
Generalmente se emplea la cromatografa
Tambin se puede usar la electroforesis,
La preparacin del producto final puede requerir la extraccin
de solvente y secado o la liofilizacin del producto.
4.1 CROMATOGRAFA.
La cromatografa es la operacin de procesado corriente
abajo ms usada a causa de su versatilidad, selectividad y
eficiencia altas, en adicin a su adecuado potencial de
escalado basado en la amplia experiencia de las industrias de
procesos bioqumicos.
otras tcnicas como la extraccin lquido-lquido es improbable
que reemplacen a la cromatografa en las etapas finales donde
se necesitan altas purezas.
La cromatografa es una operacin de adsorcin en lecho fijo,

en la cual una columna rellena con materiales cromatogrficos se
alimenta con la mezcla de los componentes que se desean
separar.
Aparte de la cromatografa de filtracin de geles, en los procesos

industriales ms comunes, los solutos se adsorben fuertemente
por los materiales de relleno hasta que se alcanza la capacidad
del lecho.
La columna puede lavarse para extraer las impurezas en las

regiones intersticiales del lecho previas a la elucin( isocrtrica,
de gradiente de los solutos), empleando tampones o solventes
que debilitan la interaccin de ligazn de las protenas con el
relleno, permitiendo su recuperacin en la fase mvil
En la cromatografa de filtracin de geles y en la

cromatografa lquida de alto rendimiento, el principio de
operacin es diferente ya que es la migracin diferencial de
los diferentes componentes, debida a las diferentes afinidades
por los materiales de relleno, lo que permite la separacin.
Las ventajas de la cromatografa en la separacin de
protenas incluyen
el elevado nmero de posibles interacciones qumicas
que resultan de variaciones en la frecuencia y distribucin
de las cadenas laterales de aminocidos sobre las
superficies de las protenas
y la disponibilidad de diferentes medios de adsorcin.
La cromatografa tiene una eficiencia y selectividad altas,
as como un adecuado potencial de escalacin.
4.1.1 Parmetros cromatogrfcos.

La separacin de protenas usando la cromatografa puede
explotar una extensin de diferentes propiedades fsicas y
qumicas de las protenas y del medio de adsorcin. Los
parmetros que se deben considerar en la seleccin de un
mtodo cromatogrfico incluyen:
la composicin de la mezcla de reaccin,
la estructura qumica y
la estabilidad de los componentes,
la carga elctrica a un valor definido de pH y
el punto isoelctrico de las protenas, el grado hidroflico o
hidrofbico de los componentes, as como el tamao
molecular.
4.1.2 Tipos de cromatografa.

Las mas importantes sn:
La cromatografa de intercambio inico
Cromatografa por interaccin hidrofbica (HIC) y
la Cromatografa de fase invertida (RPC)
Cromatografa de filtracin de geles
a. La cromatografa de intercambio inico se basa en la
atraccin entre los grupos funcionales ionizados de protenas y
los grupos funcionales de cargas opuestas en el soporte. Se
usa para:
separar el producto de las especies contaminantes que
tienen diferentes caractersticas de carga bajo condiciones
de elucin definidas y
para la concentracin del producto, debido a la alta
capacidad de adsorcin de la mayora de las resinas de
intercambio inico y la resolucin.
Se usan con efectividad en el extremo frontal de una
cadena de procesado corriente abajo para la reduccin
inicial del volumen y la purificacin.
4.1.2 Tipos de cromatografa.

La cromatografa de intercambio inico
b. Cromatografa Por Interaccin Hidrofbica (HIC)

Se basa en las interacciones entre los residuos hidrofbicos
expuestos y los ligandos hidrofbicos que se distribuyen
uniformemente a travs de una matriz hidroflica porosa.
Caractersticas:
En la HIC, las interacciones hidrofbicas son relativamente
dbiles, a menudo conducidas por sales de concentracin
moderada (1 a 2 M),
la preservacin del estado natural, biolgicamente activo, de la
protena es una caracterstica importante.
La elucin se puede lograr de forma diferente mediante la
disminucin de la concentracin salina o incrementando la
concentracin de los perturbantes de la polaridad (por
ejemplo, el etilenglcol) en el eluente.
b. Cromatografa Por Interaccin Hidrofbica (HIC)
c. La cromatografa de fase invertida RPC

se basa en interacciones hidrofbicas ms fuertes que en la
HIC, que resulta en el desarrollo y exposicin de los residuos
hidrofbicos interiores, que llevan a la desnaturalizacin e
inactivacin irreversible de la protena; como tal,
la RPC depende del contenido total del residuo hidrofbico.
La elucin se efecta por disolventes orgnicos aplicados bajo
condiciones de gradiente.
Los ligandos tanto para HIC como para RPC son compuestos
aromticos simples. Incrementando el nmero de carbonos y
la densidad de mezcla de los ligandos en la superficie del
soporte se produce el incremento de la fortaleza de interaccin y
el paso del modo de operacin HIC al RPC
El aumento de la temperatura incrementa las interacciones
hidrofbicas a las temperaturas comnmente encontradas en
los procesos biolgicos.
c. La cromatografa de fase invertida RPC
d. La cromatografa de filtracin de geles

separa las protenas en base a su tamao solamente, donde
el tamao efectivo de la protena se determina por su
geometra y las caractersticas de solvatacin.
Caractersticas:
Las protenas ms pequeas son capaces de penetrar los
volmenes de los poros de las bolas de relleno y por ello
quedan retenidos con respecto a las protenas grandes, los
cuales permanecen en el fluido que fluye rpido en las
regiones intersticiales del lecho.
ya que las protenas pueden interactuar adsortivamente con la

matriz de gel, afectando as su relativo comportamiento de
elucin. La cromatografa de filtracin de geles se usa en la
desalacin, la eliminacin de impurezas de bajo peso
molecular y la extraccin de oligmeros deseados del
producto. Se usa en las ltimas etapas de la secuencia de
separacin, a menudo como una etapa de pulido final.
d. La cromatografa de filtracin de geles
e. La Cromatografa De Afinidad De Proteinas

Se basa en las interacciones moleculares muy especficas y
bien definidas entre la protena y los grupos de afinidad
inmovilizados en el material soporte de empaquetam incluyen
antgenos-anticuerpos, hormona-receptor, inhibidor anlogo de
enzima-sustrato ligando-in de metal y pares de ligandos de tinte
Caractersticas:
se puede usar para :
la separacin de un compuesto individual o un grupo de
compuestos similares estructuralmente a partir de mezclas
de reaccin, caldos de fermentacin
para el aislamiento de un producto puro directamente a
partir de mezclas de fermentacin en un paso
cromatogrfico simple.
La cromatografa por afinidad no encuentra uso amplio a escala
de proceso a causa de su alto coste, si se usa un ligando de
protena como A o G.
es susceptible a suciedad e inactivacin.
e. La Cromatografa De Afinidad De Proteinas
f. La cromatografa por afinidad de in de metal inmovilizado

(IMAC) Se fundamenta en la interaccin de ciertos residuos
aminocidos, particularmente la histidina, cistena y el triptfano
sobre la superficie de la protena con iones de metal fijados al
soporte por quelacin con compuestos apropiados, derivados
invariablemente del cido aminodiactico.
Caractersticas:
Los iones de metal comnmente usados son el Cu2+. Zn2+, Ni2+
y el Co2+. A pesar de su relativa complejidad en trminos del
nmero de factores que influyen en el proceso, la IMAC comienza
a encontrar aplicaciones industriales.
La seleccin del grupo quelante, el in metlico, el pH y los

constituyentes del tampn determinarn las caractersticas de
adsorcin y desorcin.
La elucin se puede efectuar por varios mtodos, incluyendo el

gradiente de pH, los ligandos competitivos, los disolventes
orgnicos y los agentes de quelacin.
f. La cromatografa por afinidad de in de metal inmovilizado

(IMAC)
4.1.3 Desarrollo cromatogrfico.

Las protenas difieren de los solutos pequeos en que el
nmero grande de residuos cargados y/o hidrofbicos sobre la
superficie de la protena proporcionan mltiples sitios de
ligazn, que aseguran una unin ms fuerte a los adsorbentes,
as como alguna discriminacin basada en la distribucin de
residuos aminocidos en la superficie.
Las protenas se recuperan mediante elucin con un tampn que

reduce la fortaleza de esta unin y permite que las protenas sean
barridas fuera de la columna con la solucin de tampn.
En la elucin isocrtica, la concentracin del tampn se mantiene

constante durante el perodo de elucin.
Debido a que las diferentes protenas pueden presentar

isotermas de adsorcin significativamente diferentes, la
recuperacin puede no ser completa, o bien puede tomar un
excesivo tiempo de procesado para recuperar todas las protenas
de la columna.
4.1.3 Desarrollo cromatogrfico.

En las operaciones de gradiente de elucin, la composicin de la
fase mvil se cambia durante el proceso para disminuir la fortaleza
de enlace de las protenas sucesivamente, siendo extradas
primero las protenas de uniones ms dbiles antes de que el
eluente se fortalezca para lograr la recuperacin de las especies
adsorbidas ms fuertemente.
El cambio en la composicin del eluente puede ser:
gradual y continuo o
puede ser por pasos.
Industrialmente, en columnas a gran escala resulta difcil
mantener un gradiente continuo debido a las dificultades en
la distribucin del fluido y por eso se usan los cambios por
paso casi universalmente.
En algunos modos de adsorcin, la protena se puede recuperar

por la adicin sucesiva de compuestos competitivos para
desplazar las protenas adsorbidas. En todos los casos, el
producto se eluye segn un pico de una gaussiana
Para una adsorcin eficiente es recomendable equilibrar tanto la

columna como la muestra con el tampn ptimo para la
ligazn. Previo a esto, la columna se debe limpiar para eliminar las
impurezas estrechamente unidas mediante el incremento de la
concentracin salina ms all de la que se us en las etapas de
elucin del producto.
Al final de la operacin de limpieza, la columna se debe lavar con

algunos volmenes del tampn incicial para extraer el
remanente de material adsorbido.
En la desorcin resulta necesario conducir en forma favorable el

equilibrio de enlace de la sustancia adsorbida desde la fase
estacionaria a la mvil. Las interacciones ligando-protena son
generalmente una combinacin de enlaces electrostticos,
hidrofbicos y de hidrgeno, y la importancia relativa de cada uno
de stos y el grado de estabilidad de la protena enlazada se debe
considerar para la seleccin apropiada de las condiciones de
elucin; frecuentemente deben establecerse compromisos. A
menudo, el gradiente de elucin da buenos resultados.
Los cambios en el pH o en la fortaleza inica son generalmente

no especficos en el rendimiento de la elucin; los incrementos
de fortaleza inica son efectivos cuando el enlace de la protena es
predominantemente electrosttico, como en IEC.
Los cambios de polaridad son efectivos cuando las interacciones

hidrofbicas juegan el papel principal en el enlace de las
protenas. Mediante la reduccin de la polaridad de la fase mvil
eluyente, esta fase se convierte en un ambiente
termodinmicamente ms favorable para la protena que la
adsorcin en el soporte del empaquetado.
Una sal de (KSCN, KCNO, KI en el intervalo 1-3 M) o un agente

desnaturalizador (urea, guanidina HC1; 3-4 M) en el tampn
tambin puede conducir a una mejor desorcin.
Para las protenas ms hidrofbicas (por ejemplo, las protenas

de membrana) se pueden usar detergentes justamente por debajo
de sus concentraciones crticas de micelas para solubilizar las
protenas y retirarlas de la superficie del empaquetado.
4.1.4 Empaquetados de columna.

La calidad de la separacin cromatogrficas depender de la
capacidad, selectividad y propiedades hidrulicas de la fase
estacionaria, que normalmente consiste en gotas porosas de
polmeros hidroflicos llenos de disolvente.
Los xerogeles (por ejemplo, dextrano entrecruzado) se encogen y

se hinchan dependiendo de las condiciones del disolvente,
mientras que los aerogeles tienen dimensiones independientes de
las condiciones de la solucin.
Una gama de materiales se emplea en la fabricacin de gotas de

gel, clasificadas de acuerdo a si son inorgnicos, sintticos o
polisacridos. Los materiales ms comnmente usados se basan
en polisacridos neutros y poliacrilamida.
Los geles de celulosa, como el dextrano entrecruzado, se usan

generalmente como medios de filtracin de geles, pero pueden
tambin emplearse como matriz en intercambiadores de iones.
4.1.4 Empaquetados de columna.

El uso principal de estos geles es para la desalacin e intercambio
de tampn en soluciones de protenas. La agarosa, fraccin de
baja carga de la alga polisacrida agar, se usa comnmente
como material de empaquetado.
Los geles microporosos de dextrano entrecruzado o

poliacrimidas se usan para las separaciones por tamices
moleculares, pero normalmente son demasiado blandos a las
porosidades requeridas para una eficiente cromatografa de
protenas.
Los geles macroporosos entre stos se encuentra la agarosa,

poliacrilamidas macrorreticulares, slice y polmeros sintticos.
son buenos para la cromatografa de intercambio inico y la
cromatografa por afinidad, as como para otras tcnicas de
adsorcin cromatogrfica. Los geles compuestos, en los cuales el
gel microporoso se introduce en los poros de los geles
macrorreticulares, combinan las propiedades de ambos tipos.
4.1.5 Secuencia de las etapas en cromatografa.

La secuencia de pasos usados en la cromatografa debe disearse
de tal forma que las
tcnicas para obtener alguna reduccin de volumen (efecto
de concentracin) y eliminar impurezas que pueden ensuciar
las unidades subsiguientes; estas unidades robustas deben
tener una alta resistencia fsica y qumica que permita una
eficiente regeneracin y limpieza, y deben ser de materiales de
bajo coste.
operaciones ms sensibles y selectivas, con una secuencia tal
que se eviten los cambios de tampn y etapas de concentracin
entre aplicaciones a columnas cromatogrficas.
Pasos
Generalmente, la cromatografa de intercambio de iones se usa
como un primer paso.
Estas columnas pueden tambin usarse como operaciones de

desalacin, y los tampones empleados para eluir las columnas
pueden seleccionarse para permitir la aplicacin directa de los
picos eluidos a la siguiente etapa cromatogrfica.
4.1.5 Secuencia de las etapas en cromatografa.

Los factores de seleccin de las etapas del proceso cromatogrfico
son:
coste,
volumen de la muestra,
concentracin de la protena y viscosidad de la muestra,
grado de pureza del producto proteico, presencia de cidos
nucleicos, pirgenos y enzimas proteolticas.
Tambin debe considerarse la facilidad con la que diferentes
tipos de adsorbentes pueden liberarse por lavado de
contaminantes adsorbidos y protenas desnaturalizadas.
Column Chromatography
The initial step in purification process ;
a) to liberate and concentrate the protein of interest
b) to remove particularly undesirable contaminant
Ex) lipids etc.: results in fouling or clogging of chromatographic
system
Further purification by column chromatography
- Characteristics of protein are important;
Ex) Size and shape
Overall charge
The presence of surface hydrophobic groups
The ability to bind various ligands
Types Of Chromatography
Ion-exchange chromatography - based on charge
Gel-filtration chromatography - based on size and shape
Hydrophobic interaction chromatography
- based on degree of hydrophobicity
Affinity chromatography - based on ability to bind specific ligands
Chromatographic techniques
In general, 75 - 95% recovery
Minimization of chromatographic step
(Optimization: 3 - 5 steps, in general)
Gel Filtration Chromatography

(Size exclusion chromatography or molecular sieving)
- packed with a porous gel matrix in bead form
- large proteins cannot enter the gel beads and hence are quickly
eluted
- the smaller the protein, the more potential internal routes
(like maze), and the longer it is retained within the bead structure
- Gel matrices; chemically cross-linking polymeric molecules
(Dextran, Agarose, Acrylamide, Vinyl polymers)
Ex) Sephadex G-25 or Bio-Gel P2(Dextran particles)
Ion Exchange Chromatography

- Amino acids of proteins exhibit charged side chains due to N-terminal
amino group and C-terminal carboxyl group
- At pH 7.0, aspartic acid and glutamic acid; overall negatively-charged
acidic side groups
lysine, arginine, histidine ; positively-charged basic side groups
- Ion-exchange chromatography is based on the principle of reversible
electrostatic attraction of a charged molecule to a solid-matrix which
contains covalently attached side groups of opposite charge.
- Anion exchangers contain covalently attached positive groups;
Adsorption of anionic proteins(negative charge)
- Cation exchangers contain covalently attached negative groups;
Adsorption of cationic proteins(positive charge)
-Elution may be achieved using a salt-containing irrigation buffer

Advantages
High level of resolution
Straight-forward scale-up
Ease of use
Ease of column regeneration
Concentration of protein
Inexpensive
- At physiological pH, most proteins have negative charges
Anion exchange chromatography is most commonly used
- Ideal matrix; inert, rigid, highly porous
Ex) Cellulose-based ion-exchangers(DEAE Sephacel)
Affinity Chromatography
- The most powerful and highly selective method
- This technique relies on the ability of most proteins to bind
specifically and reversibly to other compounds(ligands)
- A wide variety of ligands may be covalently attached to an enert
support matrix and packed into a chromatographic column
- Only the protein molecules that selectively bind to the immobilized
ligand will be retained on the column
- Washing the column with a suitable buffer will flush out all
unbound molecules
- An appropriate change in buffer composition result in desorption
of the retained proteins
4.3 Liofilizacin y secado.
Despus de los ltimos pasos de purificacin de alto rendimiento,

es necesario preparar el producto final para aplicaciones
especiales. Por ejemplo, los productos finales de enzimas se
requieren generalmente como polvo seco para dotarlos de
estabilidad y facilitar su manejo, mientras que las preparaciones
farmacuticas necesitan de una alta pureza, estabilidad durante la
formulacin, ausencia de carga microbiana y amplio perodo de
vida til.
Esta etapa de formulacin del producto puede incluir el secado de

los productos finales mediante el secado por congelacin,
secado por aspersin, secado por lecho fluidizado o la
cristalizacin
Despus de los ltimos pasos de purificacin de alto rendimiento,

es necesario preparar el producto final para aplicaciones
especiales. Por ejemplo, los productos finales de enzimas se
requieren generalmente como polvo seco para dotarlos de
estabilidad y facilitar su manejo, mientras que las preparaciones
farmacuticas necesitan de una alta pureza, estabilidad durante la
formulacin, ausencia de carga microbiana y amplio perodo de
vida til.
Esta etapa de formulacin del producto puede incluir el secado de

los productos finales mediante:
el secado por congelacin,
secado por aspersin,
secado por lecho fluidizado o la cristalizacin

4.3.1 El secado por congelacin,
se restringe normalmente a materiales sensibles a la
temperatura como las vacunas, enzimas, microorganismos y
protenas teraputicas, ya que puede representar una parte
significativa del coste total de produccin.
Este proceso se caracteriza por tres etapas diferentes,

empezando por:
la congelacin de la disolucin de producto, seguido por
la eliminacin del agua mediante sublimacin en una etapa
primaria de secado y finalizando con
un secado secundario por calentamiento para eliminar la
humedad residual.

4.3.1 El secado por congelacin
La congelacin se lleva a cabo en placas enfriadas en bandejas o
con el producto distribuido en forma de pequeas partculas en un
tanque refrigerante; dejando caer la disolucin de producto en
nitrgeno lquido o cualquier otro lquido congelante; por
pulverizacin con C02 lquido o nitrgeno lquido, o mediante el
enfriamiento por recirculacin de aire fro.
Las propiedades del producto secado por congelacin, como la

textura y facilidad de rehidratacin, dependen de las dimensiones y
formas de los cristales de hielo formados, los cuales a su vez
dependen del grado de subenfriamiento.

4.3.1 El secado por congelacin
Es costumbre enfriar por debajo de la temperatura mnima de
equilibrio eutctico de la mezcla, aunque muchas mezclas de
mltiples componentes no presentan puntos eutcticos. La
congelacin debe ser rpida para evitar los efectos de gradientes
locales de concentracin.
La eliminacin del agua de la solucin por la formacin de

cristales de hielo conduce a cambios en la concentracin salina
y pH, al igual que incrementa la concentracin del producto en la
solucin restante; a su vez, esto puede aumentar las velocidades
de reaccin e incluso puede cambiar el orden de la reaccin,
resultando una desnaturalizacin fra del producto.
Para procesos aspticos, la congelacin directa en plantas de

secado por congelacin asegura una ms fcil carga de la solucin
tras la filtracin que si la, transferencia se realizara separadamente
de congeladores remotos.

4.3.1 El secado por aspersin
Usa menos del 50% de energa que las operaciones de secado por
congelacin y encuentra aplicacin en la produccin de enzimas ,
como aditivos para detergentes y como ltima etapa en la
produccin de protenas unicelulares.
El producto normalmente se alimenta en el secador como solucin,

suspensin o como sustancia hmeda que fluye libremente.
El secado por aspersin es un proceso adiabtico, y la energa se

obtiene de un gas caliente (normalmente aire caliente) a
temperaturas entre 120 y 400 C.

La estabilidad del producto se asegura por un muy corto tiempo
de secado en el equipo de secado por aspersin, tpicamente en el
rango de subsegundo a segundo, lo cual limita la exposicin a altas
temperaturas en el secador. Se puede incluir una proteccin por
medio de aditivos (por ejemplo, galactomann, polivinilpirrolidona,
metilcelulosa, celulosa).
requiere la dispersin de la alimentacin en pequeas gotas para

proporcionar un mayor rea de transferencia de calor y masa.
La dispersin del lquido se logra usando discos rotatorios,

diferentes tipos de toberas o ultrasonidos, y resulta afectado por la
tensin interfacial, la densidad y la viscosidad dinmica de la
solucin de alimentacin, as como por la temperatura y las
velocidades relativas del lquido y el aire en la zona de mezcla.

Los atomizadores de disco rotativo operan a una velocidad de
4.000 a 50.000 rpm para generar las fuerzas centrfugas necesarias
para la dispersin de la fase lquida; se obtienen normalmente
gotitas de tamao de 25 a 950 m. Estos atomizadores se adecan
especialmente para la dispersin de suspensiones que pueden
tender a atascar las toberas.
El proceso requiere la dispersin de la alimentacin en pequeas

gotas para proporcionar un mayor rea de transferencia de calor y
masa.
La dispersin del lquido se logra usando discos rotatorios,

diferentes tipos de toberas o ultrasonidos, y resulta afectado por
la tensin interfacial, la densidad y la viscosidad dinmica de la
solucin de alimentacin, as como por la temperatura y las
velocidades relativas del lquido y el aire en la zona de mezcla.

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Challenges in bioseparations

An ideal bioseparation process should

Biological products (contd..)

DNA based products:

Strategies for bioseparation

The volume of process stream

The relative abundance of the product in this

The intended use of the product, i.e. purity

The cost of the product

for purification and polishing

High resolution-low throughput

Bioseparation methods (contd..)

In this course we will discuss:

1.1 ETAPAS DE PROCESAMIENTO

Los productos de peso molecular bajo, generalmente

Las tcnicas usadas en las bioseparaciones dependen de:

1.2 FASES DE SEPARACIN

Todo aislamiento inicial y las etapas de recuperacin

1.2 FASES DE SEPARACIN

Para los compuestos intracelulares, la recoleccin inicial de

A continuacin de esta fase se emplea un conjunto de etapas

La prevencin y/o evitacin de la contaminacin es otra

Por ello, debe prestarse cuidadosa consideracin a la

En la seleccin de los procesos de separacin debe tenerse en

1.5 PURIFICACIN DE PROTENAS

1.6 ELECCIN DE LOS PROCESOS UNITARIOS

La liberacin de las protenas enlazadas debe considerarse

se debe prestar adecuada atencin al medio de suspensin; los

Al contrario, los cuerpos de inclusin se protegen por medio de la

Condiciones ms crticas se emplean tpicamente para su

Para protenas naturales se requieren mtodos ms suaves y

La liberacin del producto intracelular de las protenas se

Los mtodos mecnicos usan la presin, como en la prensa

Los medios no mecnicos incluyen el uso de desecantes o

mientras que la lisis de las clulas se puede dar por medios:

En los homogeneizadores basados en presin, las clulas

A presiones excesivamente altas se puede asegurar una buena

Los cuerpos de inclusin, se recuperan normalmente mediante

. Se pueden resuspender y centrifugar mltiples veces (a menudo

En los molinos de bolas de alta velocidad de

tiempos de residencia ms grandes que los

Esta aproximacin tiene la desventaja de que puede conducir

La destruccin enzimtica de las paredes de las clulas es

Los mtodos fsicos como el choque osmtico, en el cual las

En la homogeneizacin, el lisado puede incrementar

Alternativamente, los precipitantes o enzimas de digestin de

Para el procesado posterior a la lisis, se debe llevar a

Cell disruption is a method or process for

Some Elements of Cell Structure

Some Elements of Cell Structure

Figure 3 Diagrammatic representations of the structural features of

Some Elements of Cell Structure

Most biological membranes are phospholipids bilayers

Some Elements of Cell Structure

Some Elements of Cell Structure

Figure 5 Eukaryotic cells. Simplified diagrammatic representation of

Some Elements of Cell Structure

Osmotic and Chemical Cell Lysis

Osmotic drastic reduction in extracellular concentration of solutes

The weakening or partial destruction of these walls can be achieved with

Mechanical Methods for Cell Lysis

Disruption takes place due to the grinding action of the

Typical rotation speeds: 10,000 to 50,000 rpm