Professional Documents
Culture Documents
PCR 3
PCR 3
PCR 3
LANANA REAKCIJA
POLIMERIZACIJE
PCR
Lanana reakcija polimerizacije
Kary Mullis je osmislio PCR 1983
1993 Nobelova nagrada za hemiju
In vitro amplifikacija definisane DNK sekvence koja
predstavlja imitaciju procesa DNK replikacije
Ciklus:
a. Denaturacija DNK
b. Hibridizacija dva oligonukleotida prajmera koji su komplementarni
krajevima sekvenci koja se umnoava
c. Ekstenzija hibridizovanih prajmera od strane termostabilne DNK polimeraze
Uspenost PCR amplifikacije proverava se elektroforezom na agaroznom gelu
Shema PCR-a
Uzorak DNK
IZ HUMANOG BIOLOKOG MATERIJALA
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
Prajmeri
5'
Prajmer
1
3'
Prajmeri
Sparivanje 3'
komplementarnih
5' krajeva prajmera
3'
Prajmer
2
5'
5'
5'
5'
Elongacija
Ne sadre 3 kraj
komplementaran 3
kraju drugog prajmera
u PCR jer mogu
meusobno
hibridizovati i posluiti
kao matrica to za
rezultat ima prajmer
drajmer artefakt
Ne sadri palidromske
sekvence koje na niim
temperaturama
stvaraju strukture
ukosnice stabilizovane
intralananim
vodoninim vezama
Prajmer-dajmer
artefakt
Palindromska sekvenca
5' Prajmer
3'
Struktura
ukosnice
5'
3'
Smanjena
efikasnost ili
inhibicijaPCR
RT-PCR
PCR kome prethodi
reverzna transkripcija
RT - PCR
Kvalitativno i kvantitativno izuavanje RNK
RT-PCR
Primena:
-analiza ekspresije gena, molekularna dijagnostika detekciji HIV-a
RT - PCR
-
RT-PCR
RT na 42 C u trajanju od 15 min. do 1 sata
Nakon sinteze prvog cDNK lanca,
RT se inhibira kuvanjem RT smee na 99 C
5 minuta i dranjem na ledu jo 5 minuta
Za PCR
specifini prajmeri ako su se koristili nasumini heksameri ili
oligo dT prajmeri
ili samo uzvodno specifini prajmeri ako su se za RT koristili
nizvodno specifini prajmeri
RT - PCR
RT-PCR
OTKRIE
TERMOSTABILNIH POLIMERAZA KOJE ZA SINTEZU DNK
KORISTE KAKO DNK TAKO I RNK MATRICU Tth polimeraza
OMOGUILO JE IZVOENJE RT-PCR-a u JEDNOM KORAKU
http://www.youtube.com/watch?v=eEcy9k_
KsDI&feature=related
http://www.youtube.com/watch?
v=o_0dFor_syw