HROMATOGRAFIJA

TLC
HPTLC

Na TLC ploe moe da se nanese od 0,5 do 5 L rastvora uzorka

Na HPTLC ploe moe da se nanese od 0,1 do 1 L rastvora uzorka
2

Na HPTLC plou dimenzija 20 x 10 cm mogu da se nanesu 72

polazne mrlje - obostrano.
3

TLC ploe sa silika-gelom

- veliina zrna 5 17 m, debljina sloja 250m (analitike
ploe), 500m (preparativne ploe).
HPTLC ploe sa silika-gelom
- veliina zrna 2 10 m, debljina sloja 200m

duina puta koju je prela supstanca (x)

duina puta koju je prela mobilna faza (y)
5

 Razdvajanje se vri migracijom razliitih aktivnih supstanci i

formiranjem zona u zavisnosti od njihove pokretljivosti na
tankom sloju.
Detekcija zona se vri fizikim i hemijskim metodama.
Supstance sa UV hromofornom grupom ili sa prirodnim
izvorom fluorescencije mogu se detektovati u UV spektralnoj
oblasti ( 254nm ili 325nm UV lampa)
Bojenim reakcijama
Za kvantitativnu analizu migraciona zona se skida, izvri se
teno-vrsta ekstrakcija i ekstrahovana supstanca odredi UV
/ VIS spektrofotometrijskom metodom ili direktno na ploi
denzitometrijski.
6

Stacionarna faza
Stacionarnu fazu u tankoslojnoj hromatografiji
predstavljaju razni adsorbensi, koji su aplikovani u
obliku tankog sloja na ploe (staklene ili plastine) ili
na folije (aluminijumske ili plastine).
Debljina sloja iznosi 0,25 0,50 mm
Najvie se koriste silika-gel i aluminijum-oksid.

Silika-gel
Silika-gel je izrazito polaran adsorbens i ima mogunost graenja
velikog broja vodoninih veza.
Hemijski je hidratisana silicijumova kiselina i reaguje slabo kiselo.
Standardna veliina estica je 20 m.
Adsorpcione osobine se poboljavaju dodatkom CaSO 4 kao vezivnog
sredstva.
Koristi se u tankoslojnoj hromatografiji normalnih faza.

OH
Si
O

Si
O
O
Si

OH

OH

Si
O
O
Si

O
O
O

Si
O
O
Si

O
O
Si

OH

OH
O
O
Si
O
O
Si

O
O

Si

O
O

O
O
Si

O
O

O
O

10

Aluminijum-oksid
Veoma se esto koristi kao adsorbens u
tankoslojnoj hromatografiji.
Aluminijum-oksid je manje polaran u odnosu na
silika-gel.
Zbog manje polarnosti razdvajanje tee sporije u
odnosu na silika-gel

11

OH

OH

OH

OH

Al

Al

Al

Al

Al

kiseo
neutralan
bazni
12

 C12 sorbent
2,5

10

pH stabilnost 1,5 -10

primenljiva za bazne komponente

13

 C18 sorbent
hidrofoban
2,5

10

100% stabilan u odnosu na vodu

14

15

 polarno vezana faza

2,5

pH stabilnost

10
1,5 -10

100% stabilnost u odnosu na vodu

ekstremno nizak protok za LC/MS

16

 polarna fenil faza

2,5

10

100% stabilnost u odnosu na vodu

primenljiv za polarna aromatina jedinjenja
17

Detekcija zona
Za razdvajanje supstanci koje u sebi sadre UV hromofore koje
apsorbuju UV zrake - koristimo ploe sa oznakom F
(u podlozi sadre fluorescentne supstance)
Otkrivanje lokacije zona pomou UV lampe na 254 nm, supstance
koje apsorbuju UV zrake detektovae se u vidu mrlja na podlozi
koja fluoresceira zeleno.
Supstance koje po prirodi fluoresciraju mogu se razdvajati na
obinim ploama, a detekcija fluorescentnih zona vri se pod
svetlou UV lampe na 325 nm.

18

 Detekcija razdvojenih zona moe se vriti reagensima

koji daju bojene reakcije sa aktivnom supstancom.
NEDESTRUKTIVNI testovi
Nanose se pomou spreja:
- pare joda
- pH indikatori
- bojeni reagensi za jedno jedinjenje ili grupu.

19

20

21

22

23

DESTRUKTIVNI testovi

Reagensi koji izazivaju razgradnju organskih

supstanci uz pojavu boje.

Nakon destrukcije supstance nije mogue

ekstrahovati i kvantifikovati ve samo
identifikovati.

Izvode se pomou:
1. H2SO4
2. H2SO4 + K2Cr2O7
3. H2SO4 + HNO3
24

Faktori koji utiu na Rf vrednost:

Stacionarna faza (kvalitet, uniformna veliina estica,

sloj adsorbensa iste debljine, t, pre izvoenja
hromatografije ploa za TLC se aktivira na 105-110 C
2h, a komercijalne 5-10 minuta).
Mobilna faza (posebno je vano da se meanje
rastvaraa za mobilnu fazu izvri neposredno pre
upotrebe).
Sa poveanjem temperature dolazi do poveanja
isparljivosti mobilne faze - samim tim se ona i bre
kree po adsorbensu, a Rf opada (t 20-25 C)
Masa uzorka 5-8 g, jer sa porastom mase uzorka
raste Rf vrednost.
25

Dvodimenzionalna TLC
Koristi se kada se jednodimenzionalnom hromatografijom
ne izvri razdvajanje supstanci na zadovoljavajui nain.
Nakon prve hromatografije, plou izvadimo iz komore sa
mobilnom fazom, osuimo i rotiramo za 90stepeni, a
zatim plou uronimo u komoru sa drugom mobilnom fazom.
Ograniavajua okolnost je da se moe analizirati samo
jedan uzorak.

26

Solvent Properties and Elution Strengths

27

28

29

Automatic TLC Sampler 4

30

za gradijentno eluiranje
31

32

33

uranjanje ploa

34

sprej kabinet
zagrevanje ploe

35

VideoScan Digital Image Evaluation

36

BioLuminizer za bioluminescentnu detekciju

37

Runo nanoenje ploa

38

39

Efekat pred-pranja ploa:

a) bez pred-pranja, b) pred-pranje sa metanolom

Mobilna faza: toluen/etil-acetat 95:5
Derivatizacija: uranjanje u rastvor anizaldehida
sa leva na desno: kamilica, timijan, gorka pomoranda, anis, ulje
iglica smreke
40

Efekat vlanosti:

Fingerprint (karakterizacija) nekih alkil amida Echinacea purpurea

Mobilna faza: toluen/etilacetat/cikloheksan/mravlja kiselina = 24 /6 / 3 / 0,9
Derivatizacija (izazivanje): anizaldehid
Levo: 45% vlanost

Desno: 32% vlanost

Trake 1-4: uzorak

120oC

Traka 5: dodekatetraenska kiselina

Traka 6: -sitosterol

41

Efekat impregniranja:

Posle nanoenja obavezno suenje

na 120oC, 30 min

a) bez; b) impregnirano sa 4% natrijum-acetatom, 2 s

c) impregnirano sa 10% natrijum-acetatom, 20 s
Mobilna faza: toluen/etilacetat/aceton/ metanol = 20 / 10 / 10 / 1,2
Izazovanje: anhidrid siretne kiseline
Trake: 1-ginkolid A, 2-ginkolid B, 3-4-ginko lie, 5-6-ekstrakti
42

43

44

45

46

ne mogu razlikovati ATP bakterijskog

porekla od nebakterijskog

detektuje samo ATP bakterijskog

47
porekla

Detekcija se zasniva na bioluminiscenciji tj. merenju intenziteta

oslobodjene svetlosti.
ATP + luciferin/luciferaza

AMP + svetlost

Zbog brzog dobijanja rezultata (2-3 minuta) ova metoda daje

dobre rezultate za monitoring prisustva mikroorganizama.

*** pigment luciferin se oksiduje u prisustvu enzima i ATP

48

http://www.camag.com/laboratory/methods/non-food.html

Separation and identification of monosaccharides

from biological materials by thin-layer
chromatography
Application of thin-layer chromatography on
purification, separation, and quantitative
determination of steroid metabolites
Optimized two-dimensional thin layer chromatography to monitor
the intracellular concentration of acetyl phosphate and other
small phosphorylated molecules

49

50

51

52

53

54