Professional Documents
Culture Documents
Analisa Produk Rekombinan
Analisa Produk Rekombinan
Rekombinan
Putu Yustiantara
Metode deteksi
Metode berbasis asam nukleat (DNA/RNA)
Metode berbasis protein
Amplifikasi DNA target
dalam genom organisme
DETEKSI GEN REKOMBINAN
Deteksi kimia fisik
Spektrofotometer
Elektroforesis gel agarosa
Kebenaran ukuran
DNA sekuensing
Kebenaran urutan nukleotida (DNA sekuenser
otomatis)
Quantifying DNA: Spectrophotometry
Maximum absorption of
DNA at 280 nm
Convert absorption to
OPTICAL DENSITY (OD)
OD = absorption X dilution
factor
1 OD = 50 mg dsDNA per ml
Generally need large Images from Wikipedia
sample size
Gel electrophoresis
A method of separating DNA
in a gelatin-like material using
an electrical field
DNA is negatively charged
when its in an electrical field it
moves toward the positive side
DNA
+
Produk DNA Pewarnaan
rekombinan DNA:
ethidium
bromide
binds to
DNA
fluoresces
under UV
light
-
power
source
+
Gel Agarose
Most agarose gels are made between 0.8% and 2%.
A 0.8% gel will show good resolution (separation)
of large DNA fragments (5-10 kb)
A 2% gel will show good resolution for small
fragments (0.2-1kb)
Low percentage gels are very weak and may break when you
try to lift them.
High percentage gels are often brittle and do not set evenly.
What is needed?
Buffer - either TBE or TAE
The buffer provides ions
in solution to ensure
electrical conductivity
Not only is the agarose
dissolved in buffer, but the
gel slab is submerged
(submarine gel) in buffer
after solidifying
Also needed are a power
supply and a gel chamber
DNA ladders/markers
Frequently, one of
the wells in your gel
will contain a DNA
ladder
This is used as a
marker to compare
the sample DNA
fragments and
estimate their sizes
Contoh deteksi DNA: Hasil transformasi (sel dilisis)
1 2 3 4 5 6 7 8
Cat:
Transformasi ke-1
awalnya gagal
karena
DH5_pjx_ctrl
Tidak ada yang
tumbuh pada ink.
O.N.
Ket:
1 = pJx_ctrl transf.ke-1 (resque) 7 = pJx_ctrl klon1 transf. ke-2
2 = pJx ctrl transf.ke-1 (stlh 48jam ada koloni) 8 = pJx_cgtase klon 1 transf. ke2
3 = pJx_cgtase klon 1 transf. ke-1
4 = pET 16_bmp2 (kontrol +) Kesimpulan:
5 = pJx ctrl klon 2 transf. ke-1 Sumur 7 dan 8 Dipilih untuk isolasi plasmid,
6 = pJx_cgtase klon 2 trans. Ke-1 karakterisasi, dan transformasi ke BL21
Sequencing
Sanger method (dideoxy)
4 Steps:
1. Denaturation
2. Primer attachment and extension of
bases
3. Termination
4. Gel electrophoresis
Overview: Dideoxy (Sanger) Method
2
3
1
4
Gel
electrophoresis
5
Dideoxy (Sanger) Method
ddNTP- 2,3-
dideoxynucleotide
No 3 hydroxyl
Terminates chain when
incorporated
Add enough so each
ddNTP is randomly and
completely incorporated
at each base
Automated Version of the Dideoxy
Method
METODE BERBASIS PROTEIN
Karakterisasi protein :
Berdasarkan :
- bobot molekul : SDS-PAGE
- muatan : Isoelectric focusing
- reaksi imunokimia : Western blot, ELISA
SDS-PAGE
7,5% 30 120 kD
5% 60 212 kD
A. Pembuatan separating gel
B. Pembuatan stacking gel
Chemsrv0.pph.univie.ac.at/methods.htm
Contoh hasil SDS-PAGE
205 kDa
116 kDa
97 kDa
66 kDa
45 kDa
29 kDa
Batas deteksi :
Coomassie : 36 - 47 ng
Silver : 0,5 - 1,2 ng
Native-PAGE
Tanpa penambahan SDS
Protein tidak terdenaturasi
Non-denaturing PAGE
Migrasi protein pada gel berdasarkan konformasi protein
Isoelectric focusing
www.food.rdg.ac.uk/online/fs460/lecture4/lecture4.htm
IEF
Normal Asp (asam)
N C
Mutan Arg (basa)
N C
Mutan Glu (netral)
N C
Alat isoelectric focusing
Elektroforesis dua dimensi
Gabungan dari IEF dan SDS-PAGE
Digunakan untuk karakterisasi protein dengan berat molekul
sama tetapi muatan berbeda
Konfirmasi kemurnian protein
IEF SDS-PAGE
Contoh hasil 2D-SDS-PAGE
ELEKTROFORESIS
SEKUENSING UJUNG
AMINO (10-15 asam amino
pertama)
SEKUENSING UJUNG
KARBOKSI
PEMETAAN PEPTIDA
(Peptide mapping)
SEKUENSING UJUNG SEKUENSING UJUNG
KARBOKSI (C-terminal)
AMINO (N-terminal)
C
N
PEMETAAN PEPTIDA
Metode Sequencing
protein
KEGUNAAN PEPTIDE MAPPING
IDENTITAS
KONFIRMASI STABILITAS GENETIK
KONSISTENSI LOT KE LOT
PEPTIDE TERGLIKOSILASI (MAB)
ASAM AMINO YANG SALAH (1 ATAU >1)
Prinsip Western Blot
Karakterisasi protein berdasarkan reaksi antigen - antibodi
Mampu mendeteksi satu protein dalam campuran
Dapat memberikan informasi mengenai MW protein
menggunakan rainbow marker
Diperlukan antibodi yang spesifik mengenali protein
target antibodi primer
Antibodi sekunder dikonjugasi dengan enzim tertentu
Contoh : horseradish peroxidase, alkalin fosfatase
warna ungu
+ Nitro blue tetrazolium (NBT)
Protein ditransfer ke
AP + 5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl phospate (BCIP)
membran nitroselulosa SDS-PAGE
Ab 2o
Ab 2o
Ab 1o
Protein target
Membran nitroselulosa
LT1
ST1
SLT1
SLT2
VT1
VT2
VTE
Slide menunjukkan simulasi PCR multipleks. Pada S: semua gen target teramplifikasi
dan ada 7 produk PCR dengan ukuran yang berbeda. Pada A: sampel mengandung
LT1, SLT1 dan VT2. Pada B: sampel mengandung ST1 dan VT2. Pada C: sampel
mengandung ST1, SLT1, SLT2, VT1 dan VTE. Pada D: sampel mengandung LT1 dan
VT1.
Nested-PCR
GEN FLAGELIN S. typhi
ST1
ST2
PCR pertama
ST3
458 pb
ST4
PCR kedua
343 pb
Nested PCR
Nested-PCR menggunakan > 1 pasang primer tetapi untuk gen target yang sama.
Perhatikan bedanya dengan PCR multipleks. Pada slide ini, gen target yang
digunakan untuk deteksi Salmonella typhi adalah gen flagelin. Primer yang
digunakan ada 4 yaitu ST1, ST2, ST3 dan ST4. Nested-PCR melibatkan 2 kali PCR.
Pada PCR pertama digunakan primer ST1 dan ST2 (primer eksternal) dan
menghasikan produk PCR berukuran 458 pb. Sebagian kecil produk PCR pertama
diambil untuk digunakan sebagai cetakan pada PCR kedua. PCR kedua
menggunakan ST3 dan ST4 (primer internal). Karena ST3 dan ST4 mengenali
urutan pada produk PCR pertama di bagian internalnya, maka produk PCR kedua
mempunyai ukuran yang lebih kecil dari produk PCR pertama. Apa keunggulan
nested-PCR? Karena primer yang digunakan ada 4 (2 pasang) maka spesifitas
dengan nested-PCR akan meningkat. Bila dalam spesimen terdapat inhibitor yang
dapat menghambat Taq (sehingga PCR tidak berjalan), maka akan memberikan
hasil negatif palsu. Pada PCR pertama ke PCR kedua terjadi pengenceran sehingga
inhibitor dapat terencerkan. Pada kasus seperti ini, biasanya produk PCR pada PCR
pertama tidak tampak pada elektroforesis tetapi pada elektroforesis kedua produk
PCRnya muncul
Reverse Transcription (RT) PCR
lisis
PCR
deteksi kolorimetri
molekul target sinyal denaturasi
hibridisasi
substrat
DETEKSI KOLORIMETRI
TMB
H2O2
Biotin
Produk PCR
Pelacak
END-POINT DETECTION
DAERAH DETEKSI REAL-TIME PCR