Sinaptik Vezikül Ekzositozu

Doç. Dr. Güvem Gümüş Akay

Ank. Üniv. Disiplinlerarası Sinirbilim Doktora Programı/

Sinapsların Moleküler Nörobiyolojisi
 Sinaptik Veziküller

• NT salınımında merkezi rol oynayan ~ 40nm

çapındaki organellerdir.
• Her presinaptik aksonal buton NT ile
doldurulmuş yüzlerce sinaptik vezikül içerir.
 Ekzositoz sırasında
• Aksiyon potansiyeli presinaptik membranı depolarize
ettiği zaman Ca2+ kanalları açılır
• Ca2+ nöron içerisine doğru giriş yapar
• İçeri giren Ca2+ , sinaptik vezikül ekzositozunu
tetikleyerek NT’lerin sinaptik yarığa salınmasına
neden olur.
• Bu tetikleme Ca2+‘un sinaptotagmin’e bağlanması ile
gerçekleşir.
 Ekzositozdan sonra

• Veziküller endozitozla hücre içerisine alınır ve

geridöşüme uğratılarak tekrar NT ile doldurulurlar.
 Vezikül Geridönüşümü

• Çok sayıda paralel yolakla meydana gelebilir:

• «Kiss-and-Run»
• «Kiss-and-Stay»
• «Endozomal aracılı»
 Sinaptik Veziküler
• Küçük hacimleri nedeni ile sınırlı sayıda protein
içeriğine sahiptirler.
• Vezikül bileşenlerinin tam olarak fonksiyonları
aydınlatılmayı beklemekle birlikte, pekçok vezikül
bileşeni 3 temel işleve sahiptir.
1. NT’lerin alınması ve depolanması
2. Vezikül ekzositozu
3. Vezikül endositozu ve geridönüşümü
• Vezikül bileşenlerinin, vezikül biyogenezinde de rol
oynadığı düşünülmekle birlikte; veziküllerin nasıl
yapıldığı ve büyüklüklerini neyin belirlediği tam
olarak net değil.
 Membran Füzyonu
• Ökaryotik hücreler için evrensel bir süreçtir.
• Membranöz organellerin oluşturulması ve füzyonu
yaşamsal pekçok sürecin temelini oluşturur.
• Hücrelerin kompartmanlar şeklinde organize
edilmesi  sinaptik iletim, fertilizasyon, immün
yanıt vb…
SNARE proteinleri sinaptik vezikül
füzyonuna aracılık eder
 SNARE proteinlerinin keşfi
• Clostridial botulinum ve tetanoz toksinleri
• Güçlü nörotoksinler
• Presinaptik uca girer ve son derece özgül
proteazlar olarak davranarak aksonal buton
morfolojisini değiştirmeden membran füzyonunu
engellerler
 SNARE proteinleri
1. Snaptobrevin/VAMP (R-SNARE)
2. SNAP-25
3. Sintaksin-I

Bu 3 protein membran füzyon makinesinin

temel bileşenleridir.
• Clostridial nörotoksin çalışmalarından önce
gerçekleştirilen in vitro füzyon çalışmaları sırasında
«NSF» adı verilen ve membran trafiğinde önemli rol
oynayan bir protein tanımlanmıştır
• NSF= N-ethylmaleimide Sensitive Factor
• Nörotoxin verileri ışığında staptobrevin, SNAP-25
ve sintaksin proteinlerinin tanımlanmasının
hemen ardından bu 3 proteinin birbirleriyle
kompleks oluşturduğu ve bir ATPaz olan NSF’nin
bu kompleksi bileşenlerine ayırdığı gözlendi.
• Bunedenle komlekse SNARE adı verildi
• Soluble NSF-Attachment protein Receptor
 Hipotez
• Trans-SNARE kompleksleri veziküller ve plazma
membranı arasında köprü vazifesi görerek
veziküllerin membrana yönelip kenetlenmesi için
spesifikliği belirlemektedir.
 SNARE kompleksi
• Yapı olarak son derece stabil
• Snaptobrevin ve sintaksinin transmembran
domainlerine komşu olan helikal bölgelerinin paralel
düzenlenmesi ile oluşur
• SNARE kompleksinin kurulumu enerji açığa çıkarır ki
bu enerji membranların füzyonu sırasında
membranlarını birbirine yaklaştırıcı güç olarak
kullanılır.
 trans-SNARE kompleksi

• SNARE kompleksi parelel 4 heliks demeti içerir

• Hipotez değil
 SNARE proteinleri ve Füzyon
• «Kurulma ve Ayrılma Döngüsü» şeklinde iş görürler
• SNARE kompleksinin oluşması: Füzyon için gerekli
gücü sağlamak
• SNARE kompleksinin ayrılması: Bir sonraki füzyonda
kullanılmak üzere SNARE proteinlerinin hazır olmasını
sağlamak
 SNARE Döngüsü
• Amino-uç  Karboksi-uç
• Füzyona uğrayacak membranlar arası boşlukta
köprü oluşturan trans-SNARE komplekslerinin
fermuar gibi kapanması ile başlar
• Fermuarın tam kapanması membranda füzyon-
porunun açılmasına neden olur
 SNARE Döngüsü
• Porun açılmasından sonra, iki membran tamemen
birbiri üzerine çakışmış hale gelir
• trans-SNARE kompleksleri, cis-SNARE
komplekslerine dönüştürülür.
• cis-SNARE kompleksleri daha sonra NSF ve SNAPler
tarafından monomerlerine ayrılır.
 SNARE Döngüsü
• Bu döngüde NSF, SNARE proteinlerini «enerji ile
yükler»
• Reaktif SNARE proteinlerinin enerjisi, SNARE
kompleksinin kurulumu yoluyla füzyon işleminde
kullanılır.
 SNARE Kompleksinin Kurulumundaki
Özgüllük
• SNARE proteinleri karakteristik aa dizisine sahiptir
– 6 adet heptad tekrarı içeren 60-70 aa uzunluğunda
• Pek çok SNARE proteini 1 adet SNARE motifine
sahiptir.
• SNAP25’de ise 2 adet SNARE motifi bulunmaktadır.
• SNARE proteinlerinde bulunan SNARE motifleri, SNARE
kompleksinin 4-heliks sarmal bobin (coiled coil)
yapısını oluştururlar
 SNARE Proteinleri
• SNARE proteinleri içerisinde en basit yapıya sahip olan
Sinaptobrevindir
• SNAP-25de 2 adet SNARE motifi ve bir bağlayıcı bölge
bulunur.
– Bu bölgenin palmitoilasyonu ile membrana tutunur
• Sintaksin ise en kompleks yapıya sahip SNARE proteinidir
– Korunmuş amino-terminal bölgesi, buna komşu kendiliğinden
katlanan Habc domaini, SNARE motifi ve TM çapa domaini
içerir
 Sintaksin
• Genel olarak bakıldığında membrana tutunma
domaini ve SNARE motifleri proteinin yaklaşık 1/3’ini
oluşturur.
• Proteinin büyük bir kısmı ise «non-SNARE» dizilerden
oluşmaktadır.
• Kompleksteki 4-heliks demeti temel olarak hidrofobik
etkileşimler sonucu oluşturulur
 SNARE Motifleri
• Protein dizi analizleri sonucunda SNARE motiflerinin 4
grup şeklinde sınıflandırılabileceği görülmüştür.
1. Qa-SNARE
2. Qb-SNARE
3. Qc-SNARE
4. R-SNARE
• R-SNARE: Transport vezikülü  v-SNARE
• Q-SNAREs: Alıcı membran  t-SNARE
 SM Proteinleri
• Membran füzyonunda SNARE proteinlerinin son
derece önemli partneridirler
• Biri veya diğerinin olmadığı koşullarda füzyon
meydana gelmez
• Yaklaşık 600 aa uzunluğunda evrimsel olarak
korunmuş proteinlerdir.
• Yay şeklinde tokaya benzer
 SM Proteinleri

• Sintaksin’lerin amino-ucundaki korunmuş dizi SM

proteinleri ile bağlanır
 SM Proteinleri
• Bu bağlanma SNARE kompleksinin oluşmasına engel
değildir.
• Bağlanma bölgesi SNARE motiflerini içermez
 Sinaptik Ekzositoz için SNARE
proteinleri neden SM proteinlerine
ihtiyaç duyuyor?
• Net bir yanıtı yok.
• SNARE kompleksinin paketlenmesinde rol
oynayabileceği düşünülüyor.
• «Bu bağlanmanın SNARE komplekslerini uzaysal
organizasyonunu sağlıyor ve füzyone olan membranlar
arasındaki boşluğun içine doğru kaymalarını
engelleyerek kompleksin oluşmasına yardımcı oluyor
olabilir»
• «Füzyon sırasında doğrudan fosfolipid karışmasını
katalizliyor olabilir»
 SM Proteinleri
• Primer fonksiyonları füzyonu regüle etmek değil,
yönetmek
• Delesyonları füzyonu ortadan kaldırıyor
• Ca2+, fosforilasyon ve diğer ikincil mesajcılar gibi klasik
sinyal iletim mekanizmaları ile düzenlenmiyorlar
 SNARE- ve SM-protein kompleksleri
• Veziküllerin hedef membranlara tutunmasını stabilize
ederek «kenetlenme»de rol oynarlar
• Vezikül yönlendirilmesi sırasında, ekzositozdan önce
meydana gelmektedir.
 SNARE Şaperonları: CSP- α ve
Sinükleinler:
• Herbir NT salınma olayı, SNARE kopmlekslerinin kurulması ve bu
komplekslerin NSF ve SNAPler aracılıyla ayrılması süreçlerini
içermektedir.
• Belirli bir zaman anında pre-sinaptik uçta yüzlerce katlanmamış
veya kısmen katlanmış SNARE-protein molekülleri bulunur.
• Bu katlanmamış veya kısmen katlanmış proteinler spesifik olmayan
etkileşimlere veya yanlış katlanma olaylarına yatkın SNARE
motiflerine sahiptir.
• Bu nedenle nöronlarda bu katastrofiyi engelleyecek, yani SNARE
proteinlerini işlevsel konformasyonlarında tutacak ve
SNARE-kompleks oluşumunu destekleyecek en azından iki
şaperon sistemi bulunmaktadır.
• CSP- α, Hsp70 ve SGT
• Sinükleinler
• Her ikisi de nörodejenerasyon ile ilişkili
• Yanlış katlanmış ve/veya anormal yapılanma gösteren
SNARE proteinlerinin varlığı nöronal sağ kalıma engel
olmaktadır.
 CSP- α
• Evrimsel olarak korunmuş sinaptik vezikül proteinidir
• Şaperonlara özgü DNA-J domain içerir.
• DNA-K domain içeren Hsp-70 ve tetratrikopeptid tekrar proteini
SGT ile kompleks oluşturduğunda, deneysel olarak
– Denatüre edilmiş proteinlerin katlanmasına aracılık ettiği
– SNAP-25’lerin agregasyonunu engellediği
gösterilmiştir.
• Farede CSP-α delseyonu
– NT salınmasına hemen etkisi görülmüyor
– SNAP-25lerin ubiquitin aracılı degredasyonunu artıyor
– 2-3 aylıkken nörodejenerasyon nedeni ile ölüyor
 Sinükleinler
• α-, β- ve Ɣ-sinükleinlerden oluşan bir protein
ailesi
• α -sinüklein mutasyonları veya aşırı ifadesi
Parkinson hastalığı ile ilişkili
• Pek çok nörodeneratif hastalıkta gözlenen Lewy
cisimcikleri alfa-sinüklein içeriyor
 Sinükleinler
• Negatif yüklü fosfolipidlere bağlanan küçük
proteinlerdir.
• CSP-α KO farelerde orta seviyede ekspresyonları bile
letal nörodejenerasyonu engelleyebiliyor.
• Tüm sinüklein izoformalarının delete olduğu farelerde
– Letalite gözlenmiyor
– 1 yaştan sonra yaşa-bağlı nörojenerasyon gözleniyor
• α-sinüklein normal olarak SNARE-kompleksinin
kurulumuna aracılık eder.
• Ancak bu genin duplikasyonu veya triplikasyonunun
gözlendiği hastalarda, alfa-sinüklein’in aşırı ifadesi
neden nörodejenerasyona neden oluyor?
1. Artmış SNARE-şaperonlanması füzyon
dengesini bozacağı için zararlı olabilir
2. α-sinükleinin yanlış katlanması
nörodejenerasyona neden oluyor
olabilir.
 SNARE/SM Protein Füzyon
Makinesinin Aktif Zona Montajı
• Sinaptik ekzositoz sırasında sinaptik veziküller
proteince son derece zengin aktif zona kenetlenir ve
füzyon gerçekleşir.
• Aktif zonda en az 4 anahtar protein bileşeni
bulunmaktadır
1. Munc13’ler
2. RIM’ler
3. RIM-BP’ler
4. Alfa-riprinler
Piccolo/Bassoon, ELKS(CAST)
• CASK, Velis, Mints , endositik iskele proteinleri
(intersektin, sindapin, amfifisin,…)
• Bu aktif zon proteinleri bütün sinaps türlerinde
mevcut
– Eksitatör/inibitör
– Nöromusküler junction
– Ribbon sinapslar
 Aktif zon
• Pre-sinaptik uçların birbiri ile örtüşen 3 temel
fonksiyonuna aracılık eder
1. Sinaptik veziküller, Ca2+ kanalları ve diğer pre-sinaptik
bileşenleri tek bir kompleks şeklinde fiziksel olarak
birbirine bağlamak
• Hızlı sinaptik iletim için tüm bileşenlerin
kolokalizasyonunu gereklidir.
 Aktif zon
2. Pre-sinaptik reseptörleri organize ederek NT
salınımının pre-sinaptik modülasonuna olanak
sağlamak.
3. Kısa- ve uzun-süreli plastik plastisitenin pek çok
formuna aracılık etmek.
 Munc13’ler ve RIM’ler
• Yapısı en iyi tanımlanmış ve fonksiyonları en iyi
anlaşılmış aktif zon proteinleridir
• Multidomain protein yapısındadırlar
 Munc13
• Çok sayıda promotor’dan eksprese olan çok sayıda
izoformu söz konusudur
• Munc13 izoformlarında
– Amino- ucunda C2A domaini bulunur. Ca2+ bağlamaz ve
homodimerizasyonda rol oynar
– Ca2+ bağlayan bir merkezi C2B domaini
– Yönetici MUN domaini
– Ca2+ bağlamayan C2C domaini
yapısında bulunan diğer domainlerdir.
 Munc13
• Sinaptik vezkülün hazırlanması ve yönlendirilmesi
için gereklidir
• Ca2+ ve RIM tarafından sıkı düzenlenmesi söz
konusudur
• Büyük bir olasılıkla SNARE ve/veya SM proteinleri ile
etkileşerek vezikülü yönlendirmektedir
 RIM Proteinleri
• Munc13lerle karşılaştırıldığında domain yapıları daha
karmaşıktır
• İzoformaları söz konusudur
• α-RIM’ler en baskın olan izoformdur
 RIM Proteinleri
• Amino ucunda bulunan iki bölge ile bir yandan GTP-
bağlama proteini olan Rab3 ile diğer yandan da
Munc13’ün C2A domaini ile etkileşir.
• Eğer RIM varsa Munc13 homodimer oluşturmak yerine
RIM ile Munc13/RIM heterodimerini oluşturur.
 RIM Proteinleri
• Merkezi PDZ domaini ile ELKS proteinlerine ve Ca2+
kanallarına bağlanır
• İki adet Ca2+ bağlamayan C2A ve C2B domainleri bulunur
• Bu domainler arasında yer alan kısa Prolince zengin dizi
ile RIM-BP’lere bağlanır
• İkinci C domaini ile de alfa- liprine bağlanır
• Diğer aktif zon proteinleri ile bağlantıyı sağlayan merkezi
bir proteindir.
 RIM Proteinlerinin İşlevleri
1. Munc13’ün «priming» aktivitesini düzenlemek.
2. Ca2+ kanallarını aktif zona bağlamak
Doğrudan: Ca2+ kanallarına PDZ domainleri aracılığı ile
bağlanırlar
Dolaylı yoldan: RIM-BP aracılığı ile bağlanırlar
 RIM Proteinlerinin İşlevleri
• RIM proteinlerinin delesyonları pre-sinaptik
membranda Ca2+ kanallarının kaybolmasına
• Aksiyon potansiyeli ile indüklenmiş Ca2+ girişinin
engellemesine neden olur
 ÖZET
• Sinaptik ekzositoz hiyerarşik olarak organize olmuş
bir grup protein aracılığı ile gerçekleşir.
• SNARE ve SM proteinleri bu organizasyonun
çekirdeğini oluşturur
• İşlevselliği için NSF, SNAPler ve spesifik SNARE
şaperon proteinleri rol oynar
• Diğer aktif zon proteinleri tarafından düzenlenir.