Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Metode analisis menggunakan teknik

kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa
diam cairan atau padatan.
  Sistem pemasukan sampel: manual, tidak
Color volumetrik  Injektor
 Waktu analisis lama, mengandalkan gaya
gravitasi dan kapiler  pompa
 Hasil pemisahan kurang baik  pengemasan
kolom
 Kesulitan Pengamatan hasil pemisahan untuk
analit tidak berwarna  Detektor
 Kesulitan penghitungan kadar  integrator
 KCKT dikembangkan dari kromatografi kolom terbuka untuk
menjawab kekurang-kekurangan tersebut

 Injektor: Sistem pemasukan sampel: sampel loop dan robotik

injektor, sangat volumetrik
 Pompa: Waktu analisis singkat, pengulangan/presisi baik
 Kolom: baja, packing kompak, partikel sangat kecil, tekanan dapat
dibuat besar  Hasil pemisahan baik
 Detektor: semua zat dapat diamati (tidak harus berwarna)
 Integrator:dilengkapi komputer, bisa menghitung  mudah
penghitungan kadar 
Sehingga disebut: Kinerja Tinggi
Kromatografi Adsorbsi

Kromatografi Partisi

Kromatografi Fasa Terikat

Kromatografi Penukar Ion

Kromatografi Eksklusi Ukuran

 Kromatografi adsorbsi sangat cocok untuk pemisahan
senyawa-senyawa yang bersifat agak polar.
 Partikel-partikel silika atau alumina biasanya digunakan
sebagai adsorben.
 Jenis kromatografi ini menggunakan fasa gerak non
polar seperti heksana dan disebut juga kromatografi
fasa normal.
 Kromatografi partisi sangat cocok untuk pemisahan
senyawa-senyawa non polar.
 Jenis kromatografi ini disebut dengan kromatografi fasa
terbalik karena fasa geraknya lebih polar daripada fasa
diam.
 Salah satu kendala kromatografi ini adalah keterbatasan
selektivitas sebagai ketidakcampuran kedua fasa. Karena
keterbatasan ini maka kromatografi partisi tidak
digunakan lagi sebagai teknik analisis rutin.
 Kromatografi fasa terikat merupakan teknik HPLC yang
paling penting dan paling banyak digunakan saat ini.
 Dalam hal penerapan kromatografi fasa terikat dan
kromatografi partisi memiliki persamaan. Akan tetapi,
sorben fasa terbalik terdiri dari partikel silika yang
dimodifikasi secara kimia dengan rantai alkil. Sebaliknya,
fasa diam pada kromatografi partisi terdiri dari partikel
yang dilapisi secara fisik dengan zat cair non polar.
 Fasa terikat merupakan fasa yang stabil
 Kromatografi penukar ion merupakan teknik pemisahan
campuran ion-ion atau molekul-molekul yang dapat diionkan. Ion-
ion bersaing dengan ion-ion fase gerak untuk memperebutkan
tempat berikatan dengan fasa diam.
 Muatan ion sangat penting dan pH fasa gerak dapat divariasikan
 Terdiri dari dua jenis yaitu anionik (-NH4+X-) dan kationik (-SO3-A+)
 Dasar pemisahan kromatografi ini berasal dari perbedaan afinitas
senyawa bermuatan terhadap permukaan penukar ion.
 Ukuran molekul merupakan kriteria utama dalam pemisahan
dengan kromatografi eksklusi ukuran.
 Pemisahan terjadi karena solut-solut berdifusi masuk dan keluar
pori-pori paking kolom. Molekul-molekul yang lebih besar dari
diameter pori-pori akan melewati kolom secara cepat dan dikenal
dengan istilah volume terekslusi begitu pula sebaliknya.
 Teknik ini berguna untuk mengkarakterisasi distribusi berat
molekul polimer, pemurnian cuplikan biologis dan pemisahan
senyawa-senyawa dengan berat molekul 2000 atau lebih
 Detektor

Kolom
Injektor
Pompa Oven

Wadah
solven
WADAH FASE GERAK
Integrator
 Merupakan tandon berisi fase gerak
 Mempunyai sistem penyaring
 Pelarut harus baik, murni, jernih dan tidak kental
 Mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar dan
tidak beracun
 Sesuai dengan detektor
 Detektor

Kolom
Injektor
Pompa Oven

Wadah
solven POMPA
Integrator
Merupakan sistem agar fase gerak mengalir.
Kinerja pompa yang diinginkan :
 Tekanan yang dihasilkan tinggi
 Fluktuasi tekanan rendah
 Kecepatan aliran fase gerak tepat
 Menghasilkan tekanan hingga 6000 psi
 Keluaran yang bebas denyut
 Kecepatan alir dalam kisaran 0, 1 – 10 ml/menit
 Pengaturan kecepatan alir dengan keterulangan setara
dengan 0,5 % atau lebih baik
 Tahan terhadap korosi.
 Pompa

Reciprocating Displacement Pneumatic

Pompa Bolak-balik (reciprocating pump)
 Jenis pompa yang paling banyak digunakan.
 Kelebihan:
• volume internalnya kecil sekitar 35 – 400 μl;
• tekanan hingga 10.000 psi;
• kemampuan untuk adaptasi menggunakan elusi gradien;
• aliran yang konstan sehingga terbebas dari tekanan balik
kolom dan akibat dari kekentalan solven.
Pompa Sistem Penggantian (displacement pump)
 Sistem penggantian menggunakan sebuah wadah besar seperti
syringe dengan sebuah penekan yang digerakan oleh motor.
 Menghasilkan aliran yang bebas tekanan balik, tidak
dipengaruhi kekentalan dan bebas denyut.
 Kekurangan : kapasitas pompa terbatas hanya 250 ml dan
cukup sulit saat solven harus mengalami penggantian.
Pompa Tekanan Udara (pneumatic pump)
 Bentuk paling sederhana sebuah pompa pneumatik merupakan
wadah yang ditekan oleh gas bertekanan tinggi.
 Kelebihan: harga relatif murah dan bebas denyut.
 Kekurangannya terletak pada kapasitas terbatas, tekanan
keluaran terbatas hanya sekitar 2000 psi, dipengaruhi oleh
tekanan balik dan kekentalan solven dan tidak dapat digunakan
untuk sistem elusi gradien.
 Detektor

Kolom
Injektor
Pompa Oven

Wadah
solven
Integrator
Injektor
Alat untuk pemasukan sampel ke dalam
sistem HPLC
 Pump Pump

Column
Column

[INJECT] [LOAD]
 Cuplikan

Injeksi
Injeksi syringe Kran cuplikan
stop-flow
 Injeksi Syringe
Syringe disuntikan melalui septum (seal karet) dan untuk ini
dirancang syringe yang tahan tekanan sampai 1500 psi.
 Injeksi ‘stop-flow’
Jenis injeksi syringe kedua tapi aliran pelarut dihentikan
sementara, sambungan pada ujung kolom dibuka dan cuplikan
disuntikan langsung ke dalam ujung kolom. Setelah
menyambungkan kembali kolom maka pelarut dialirkan kembali
 Kran Cuplikan
Disebut juga loop dan paling banyak digunakan.
 Sistem sample loop injektor

posisi load Posisi inject

pompa kolom pompa kolom

sample loop
 Detektor

Kolom
Injektor
Pompa Oven

Wadah
solven Oven Kolom – Instrumen Pemanas
Integrator
Syarat:
1. Keseragaman temperatur yang baik
2. Kestabilan temperatur yang baik
3. Ketepatan kontrol temperatur yang baik
 Kolom utama
• Berisi fasa diam tempat terjadinya
pemisahan campuran
• Panjang berkisar 5-30 cm, diameter
4-10 mm
• Dipaking dengan partikel berukuran
3-10 μm
 Kolom pengaman (guard column)
• Untuk menyaring kotoran dan untuk menjenuhkan fasa diam
• Diletakkan sebelum sistem pemasukan cuplikan
• Berukuran pendek, 5 cm dengan diameter 4,6 mm
• Biasanya dipaking dengan partikel silika berukuran > dari
ukuran partikel kolom utama
Syarat detektor
1. Sensitif
2. Stabilitas dan keterulangan tinggi
3. Respon linear terhadap solut
4. Waktu respon pendek
5. Relibilitas tinggi dan dapat digunakan
6. Tidak merusak cuplikan
 Detektor

Kolom
Injektor
Pompa Oven

Wadah Yang umum dipakai:

solven  Detektor Ultraviolet / Visible (UV/Vis)
 Detektor Photodiode Array (PDA) Integrator
 Detektor Fluorescence (RF)
 Detektor Konduktivitas (CDD)
 Detektor Refraktive Indeks (RID)
 Detektor Elektrokimia (ECD)
 Detektor Spektrometer Massa
Prinsip: penyerapan sebagian energi (hv) oleh molekul pada panjang gelombang
tertentu => tereksitasi elektronik

Eksitasi elektronik
kuvet

Ein Eout
l
Hk.Lambert-Beer
A= eCl = - log (Eout / Ein)
A= eCl = - log (Eout / Ein)
absorbansi

Kisaran linear
1

konsentrasi
Pemilihan λ: quantitative / preparative?
275 nm
208 nm

275 nm
208 nm
Mode Isokratik
• Fasa gerak sama selama pengukuran berlangsung

Mode Gradien
• Komposisi fasa gerak divariasikan selama pengukuran
berlangsung
1. Preparatif sampel
2. Pemisahan
3. Identifikasi senyawa
4. Kuantifikasi suatu senyawa
 Mampu memisahkan molekul-molekul campuran
 Mudah melaksanakannya
 Kecepatan analisis dan kepekaan tinggi
 Resolusinya baik
 Dapat dihindari terjadinya dekomposisi
 Dapat menggunakan macam-macam detektor
 Kolom dapat digunakan kembali