Diagnostic molecular in

virusologie
 Diagnosticul molecular in
virusologie

AMPLIFICAREA TINTEI
–PCR
–NASBA (nucleic acid sequenced based
amplification)
AMPLIFICAREA SEMNALULUI
–B-DNA (branched DNA)
 PCR
POLYMERASE
CHAIN
REACTION

Metoda utilizata pentru detectia ADN-ului de orice tip.

-se bazeaza pe obtinerea unui numar mare de catene
tinta prin repetatea unui nr. n de cicluri, ce contin in
principal 3 etape:
- denaturarea
- aditia primerilor la capetele secventei tinta
- extensia primerilor
PCR Amplifies a Targeted
Sequence
Target Sequence

DNA Strand
Double Helix
Supercoiled DNA Strand
DNA Strand

Chromosome
PCR – 1- Denaturare
Secventa tinta
PCR- 2 – CUPLAREA PRIMERILOR LA
CAPETELE SECVENTEI TINTA

Target Sequence

Biotin

Primer 2 Primer 1

Biotin

Target Sequence
PCR -3 – Elongarea primerilor sub actiunea
Taq Polimerazei
Secventa tinta

ADN Polimeraza Taq

Secventa tinta
End of the 1st PCR Cycle - Results in Two
Copies of Target Sequence
 Target Amplification
No. of No. Amplicon
1 cycle = 2 Amplicon
Cycles Copies of
Target
2 cycle = 4 Amplicon

1 2
3 cycle = 8 Amplicon

2 4
4 cycle = 16 Amplicon

3 8
5 cycle = 32 Amplicon
4 16

6 cycle = 64 Amplicon 5 32

6 64
7 cycle = 128 Amplicon 20 1,048,576

30 1,073,741,822
 PCR:
Master Mix
Target DNA

Taq DNA
Mg2+ Polymerase

Mn2+

Primers
dNTP •forward primer
•reverse primer
 RT- PCR
Reverstranscriere + PCR
Reverse Transcription - Step 1 – Aditia Primer
la secventa tinta ARN
 Reverse Transcription - Step 2 –
Reverstranscriptaze Catalizeaza extensia
Primerului prin incorporarea nucleotidelor
complementare
 End of Reverse Transcription - Step 3 –
Rezulta sinteza ADNcomplementar (cDNA)
pe secventa tinta ARN
Basic Lab Setup

Unidirectional workflow!
Safety Gloves, Laboratory Coat
Safety Glasses
Biohazard Container

0.5% sodium hypochlorite, ethanol,

Biological Safety Hood
Vortex Mixer
Centrifuge and/or Microcentrifuge (min. RCF 12,500 x g),
some tests require a refrigerated, high speed centrifuge (min. RCF 24,000 x g)
Dry-heat Temperature Block

Incubator (37 0C ± 2 C)
 Dedicated Pipettor and Screw-cap Tube Rack,
Multichannel Pipettor and Tips

•Screw-cap tube racks (to hold Master Mix tubes)

PCR System consumables
(tubes, base, tray and retainer).
Analyser Consumables/parts
D-cups

A-rings, A-ring Holder

Thermal Cycler
PCR System 9600 or System 2400
COBAS AMPLICOR™ Analyser
 DETECTIA AMPLICONULUI
• Electroforeza in gel de agar, colorare
cu bromura de ethidiu si comparare
cu markeri de GM cunoscuta

• Hibridizare cu sonde moleculare

marcate complementare si apoi
detectie (+/- spectrofotometrica)
 Hibridizare

Avidin-horseradish peroxidase
(Av-HRP conjugate)

Biotin Tetramethylbenzidine
(TMB) Substrate

BSA
Hydrogen
Peroxide
Addition
of Substrate
Microwell Plate
Capture
Probe
BSA
Detectie

spectrofotometrica Add Stop Solution and

Measure Absorbance
Diagnostic molecular in
infectia HIV
DIAGNOSTIC SEROLOGIC
TESTE DE TRIAJ- sensibilitate inalta
ELISA
TESTE RAPIDE

TESTE DE CONFIRMARE- specificitate inalta

WESTERN BLOT
RADIOIMUNOPRECIPITAREA (RIPA)
IMUNOFLUORESCENTA INDIRECTA

DETECTIA VIRUSULUI SAU A PRODUSELOR

VIRALE
IZOLARE VIRALA
DETECTIA ANTIGENEMIEI p24
DETECTIA ACIDULUI NUCLEIC VIRAL
(ARN HIV PLASMATIC SAU ADN HIV PROVIRAL LIMFOCITAR)
Utilizarea metodelor moleculare in
infectia HIV

• Fereastra serologica
• Nou-nascuti din mame seropozitive HIV
• Initierea si monitorizarea terapiei
antiretrovirale
• iv>5-10.000 corelat cu nr. CD4 si status clinic
• iv>30-50.000 indiferent de nr. CD4 si status clinic
• Monitorizarea: reducerea iv sub 50 copii ARN
HIV/ml la 24 sapt
Precizati tipul de
reactie
reprezentata
mai sus si
principiul
tehnicii.
In ce viroze
aceasta
tehnica este de
electie?
• MC, 25 ani . Se apreciaza ca se gaseste
in fereastra serologica pentru infectia HIV.
Ce semnifica aceasta notiune si ce etapa
urmeaza in diagnostic.
Nou nascut din mama seropozitiva HIV.
Care este testul de electie folosit pentru
diagnosticul infectiei, precizand si etapele
sale.
• CE TEHNICA ESTE UTILIZATA IN
ETAPA DE CONFIRMARE A INFECTIEI
HIV? CE CRITERII TREBUIE
OBLIGATORIU INDEPLINITE PENTRU A
SPUNE CA TESTUL ESTE POZITIV?
CUM SE PROCEDEAZA IN CAZUL UNUI
TEST INDETERMINAT? MENTIONATI
PRINCIPALELE CAI DE TRANSMITERE
ALE INFECTIEI HIV.