BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM

ĐỀ TÀI: QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG Clostridium perfringenes

GVHD: Phan Thị Kim Liên

Tiết 3-4, Thứ 5
Nhóm 13
 Danh sách nhóm
STT Họ và tên MSSV

1 Hứa Nhật Cường 2006140029

2 Nguyễn Hoàng Huân 2006140118

3 Huỳnh Thị Huyền Trâm 2006140352

4 Mai Thị Hoài Thu 2005140563

5 Đoàn Thị Cẩm Tú 2006140378

NỘI DUNG
 1. Tổng quan về Clostridium perfringenes (C. Perfingenes)
Tình hình ngộ độc:
C. Perfringenes là một trong những nguyên
nhân gây ngộ độc thực phẩm trong giống
Clostridia, chúng chiếm một vị trí khá đặc biệt
bởi đồng thời là tác nhân gây bệnh do thực
phẩm và cũng là tác nhân gây ngộ độc thực
phẩm
Trong quá trình sinh trưởng vi khuẩn C.
Perfringenes sản sinh 17 loại độc tố khác nhau
(𝛼, 𝛽, 𝜀, 𝑖, …) người ta phân chia thành 5 typ
độc tố: A,B,C,D và E.
 Thời gian ủ bệnh trung bình 10-12h,
có khi chỉ cần 6-8h, nhưng không quá
24h bệnh sẽ xuất hiện
Triệu chứng: đau bụng, tiêu chảy,
phân lỏng hoặc toàn nước, viêm ruột, dạ
dày, có trường hợp nôn, nhứt đầu, sốt,…
Nguồn nhiễm: đất, phân người, thịt
nguyên liệu, gia cầm, thức ăn để
nguội,…
Để phòng trúng độc do C.
perfringenes nên bảo quản thực phẩm
trong tủ lạnh ở 4℃ trở xuống và nên
đun thức ăn nguội lại trước khi ăn.
 Đặc điểm vi khuẩn C. perfringenes:
- Trực khuẩn gram dương, kỵ khí bắt buộc, sinh
bào tử.
- Tạo các khuẩn lạc màu đen trong môi trường
phân lập quy định.
- Khử nitrat thành nitrit, lên men đường glucose
và lactose.
- Hóa lỏng gelatin và đông tụ sữa.
- Nhiệt độ sống tối ưu 37-45℃ , pH: 5-8
- Hình que lớn giúp phân biệt với các loại khác
thuộc chi Clostridium, có vỏ kết nang và không
di động.
-C. perfringenes có thể sống sót ở
điều kiện khắc nghiệt nhờ biến đổi
thích nghi của hệ thồng biến dưỡng
tế bào với khả năng chịu đựng cao
và sản sinh nội bào tử.
-Các chủng C. perfringenes gặp
phổ biến trong đường tiêu hóa của
người nên dùng làm VSV chỉ thị về
khả năng nhiễm phân.
2. Nguyên tắc định lượng
 Cấy một lượng mẫu thử qui định ( sản phẩm ban đầu ở dạng lỏng, hoặc
một lượng huyền phù ban đầu qui định nếu sản phẩm ở dạng khác) lên bề mặt
môi trường cấy đặc chọn lọc đựng trong các đĩa petri.
 Chuẩn bị các đĩa khác trong cùng điều kiện, sử dụng dung dịch pha loãng
thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu.
 Rót môi trường chọn lọc (kỹ thuật rót đĩa) và sau đó phủ lên trên bằng
chính môi trường này.
 Ủ trong điều kiện hiếu khí các đĩa ở 37℃ trong khoảng 24h.
 Định lượng các khuẩn lạc điển hình.
 Khẳng định số lượng các khuẩn lạc điển hình và tính số lượng C.
perfringenes trong 1ml hoặc 1g mẫu.
3. Dụng cụ, thiết bị, môi trường và hóa chất

 Thiết bị và dụng cụ:

- Cân, dao lấy mẫu, pH kế.
- Bể điều nhiệt, que cấy thẳng, que cấy vòng.
- Nồi triệt trùng, phiến kính, lam kính.
- Tủ ấm, ống nghiệm, pipet.
- Tủ cấy, hộp petri.
 Môi trường và hóa chất

Môi trường và hóa chất Mục đích

SPW Pha loãng mẫu
TSC agar base
Nuôi cấy C. perfringenes
D-xycloserin
Thioglycolat lỏng
LS (lactose sunfit)
Nitrat (thử di động) Khẳng định C. perfringenes
Lactose-gelatin
HCl và NaOH 10% Chỉnh pH
4. Quy trình thực hiện Sản phẩm dạng khác
Sản phẩm dạng lỏng 10g mẫu+90mL SPW
Dịch mẫu 10−1 Dịch mẫu 10−2
Dịch mẫu 10−1

02 đĩa 02 đĩa 02 đĩa 02 đĩa

petri petri petri petri
TSC TSC

15-20mL 15-20mL 15-20mL

15-20mL

Sau khi đông đặc thêm 10mL TSC mỗi đĩa, chờ đông đặc, lật ngược đĩa ủ kỵ khí ở 37℃
trong 20±2h
Thioglycolate broth, ủ kỵ khí 37℃, 18-24h
Lactose sunfit hoặc Nitrat, Lactose-gelatin
ủ hiếu khí 46℃/18-24h
Đọc kết quả Clotridium perfringenes
5. Các bước thực hiện

Bước 1: Bước 4:
Chuẩn bị Bước 2: Đếm và chọn
Bước 3:
mẫu thử và Pha loãng các khuẩn lạc
Cấy và ủ mẫu
huyền phù mẫu để khẳng
ban đầu định
Bước 1: Chuẩn bị mẫu và huyền phù ban đầu

Cân 10g mẫu Dung dịch pha

(rắn), hoặc 10mL loãng SPW
mẫu (lỏng) Bình 90mL
tam giác

Đồng nhất mẫu và dịch pha loãng SPW trong máy dập mẫu
trong 1 phút hoặc lắc đều bình tam giác có mẫu và dịch pha
loãng trong 2-3 phút
Bước 2: Pha loãng mẫu

pipet
1mL

Dd huyền 9mL
Dịch
phù dịch
Trộn kỹ bằng máy vortex pha
pha
trong 5-10s loãng
loãng
10−2
SPW

Nếu cần lặp lại thao tác trên để có được dung dịch pha loãng
10−3 , 10−4 , 10−5 , …
Bước 3: Cấy và ủ mẫu
- Dùng pipet vô trùng chuyển 1mL mẫu thử dạng lỏng hoặc 1mL
huyền phù ban đầu đối với sản phẩm khác cho vào đĩa petri.
- Lặp lại quy trình với các dung dịch pha loãng thập phân tiếp
theo (nếu cần).
- Sử dụng 2 nồng độ liên tiếp, mỗi nồng độ 2 đĩa petri.
- Rót vào mỗi đĩa 10-15mL môi trường TSC, trộn đều bằng cách
xoay nhẹ từng đĩa.
- Khi môi trường đã đông đặc lại thì phủ kính thêm một lớp dày
10mL của cùng loại môi trường TSC.
- Để cho đông đặc lại.
- Lật úp đĩa và ủ trong điều kiện kỵ khí ở 37℃ trong 24h.
Bước 4: Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định

 Đếm khuẩn lạc:

- Đếm các đĩa có số khuẩn lạc dưới
150 sau 24h nuôi cấy.
- Khuẩn lạc C. perfringenes điển
hình có màu đen trên môi trường
TSC.
- Đếm khuẩn lạc C. perfringenes
trên những đĩa có số đếm phù hợp.
 Chọn 5 khuẩn lạc điển hình và chọn một trong hai kỹ thuật sau:

• Cấy từng khuẩn lạc đã chọn vào môi trường thioglycolat

lỏng, ủ 37℃ trong 24h trong điều kiện kỵ khí.
• Sau khi ủ dùng pipet vô trùng chuyển ngay 5 giọt dịch cấy
trong môi trường thioglycolat sang môi trường LS, ủ ở
Kỹ thuật 1: kỹ thuật 46℃ trong 24h trong điều kiện hiếu khí.
khẳng định sử dụng
môi trường LS • Kiểm tra các ống nghiệm chứa môi trường LS về sự sinh
khí và có xuất hiện kết tủa màu đen được gọi là dương tính.
 • Cấy đâm sâu từng khuẩn lạc chọn lọc sang môi trường nitrat để thử
tính di động, ủ 37℃ trong 24h trong điều kiện kỵ khí.
• Kiểm tra ống môi trường nitrat để thử tính di động đối với các loại
mọc dọc theo đường cấy đâm sâu.
• Tính di động là bằng chứng phát triển lan rộng vào môi trường cách
Kỹ thuật 2: kỹ xa đường cấy đâm sâu.
thuật khẳng • Kiểm tra sự có mặt của nitrit bằng cách thêm 0,2-0,5mL thuốc thử
định sử dụng phát triển nitrit vào từng ống môi trường nitrit để kiểm tra sự có mặt
môi trường của nitrit.
• Tương tự cấy từng khuẩn lạc chọn lọc đã chọn ở trên sang môi
nitrat để thử trường lactose-gelatin, ủ ở 37℃ trong 24h trong điều kiện kỵ khí.
tính di động và • Kiểm tra ống nghiệm về việc sinh khí và có sự xuất hiện màu vàng
môi trường cho thấy sự lên men lactoza.
lactose-gelatin • Làm lạnh các ống 1h ở 5℃ để kiểm tra sự hóa lỏng gelatin, nếu môi
trường đông đặc thì ủ lại thêm 24h và kiểm tra lại sự hóa lỏng gelatin.
Kết quả:

 Đối với kỹ thuật 1: vi khuẩn hình thành các khuẩn lạc điển hình trên
môi trường thạch TSC và được khẳng định dương tính với môi trường LS
được coi là C. perfingenes.
 Đối với kỹ thuật 2: các vi khuẩn sinh ra các khuẩn lạc màu đen trong
môi trường TSC mà không di động, thường khử nitrat thành nitrit, sinh
acid và sinh khí từ lactoza và hóa lỏng gelatin được gọi là C. perfringenes.
Clostridium perfringenes trong 1g/1mL mẫu (X) được tính
theo công thức:
𝐶1∗𝑅1 + 𝐶2∗𝑅2 + 𝐶3∗𝑅3 +(𝐶4∗𝑅4)
X= (CFU/g hay CFU/mL)
𝑉∗ 𝑛1 +0,1∗𝑛2 ∗𝑑
Trong đó:
- C1,2,3,4: số khuẩn lạc C. perfringenes đếm được tương ứng trên 4 đĩa của hai nồng
độ pha loãng liên tiếp.
- V: thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa (ml)
- 𝑛1 : số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được giữ lại.
- 𝑛2 : số đĩa ở độ pha loãng thứ hai được giữ lại.
- d: hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại.
- R1,2,3,4: tỷ lệ khẳng định dương tính tương ứng trên 4 đĩa của hai nồng độ pha
loãng liên tiếp.
6. Ví dụ: