KỸ THUẬT

CẤY VÀ PHÂN LẬP VI SINH

Bộ môn Vi sinh

Khoa Dược – Đại học LẠC HỒNG
Bệnh
phẩm

QUY TRÌNH PHÂN LẬP VI KHUẨN

MT
chuyên Lactose
chở
Các
MT Chọn Phản
phân khuẩn KIA/TSI Ứng
lập lạc Oxidase -
Sinh
Hóa
MT tăng
sinh Glucose
 THAO TÁC TRONG ĐIỀU KIỆN VÔ TRÙNG
• Que cấy: đốt và khử trùng trước và sau khi lấy
vi khuẩn
• Ống nghiệm: hơ miệng ống nghiệm trước khi
mở nút bông và trước khi đóng nút bông lại
• Que cấy, hộp lồng (đĩa petri) và miệng ống
nghiệm phải để trong vùng an toàn của ngọn
lửa (cách ngọn lửa < 20cm). Không để hộp
lồng, ống nghiệm ngay trên ngọn lửa trong khi
cấy.
VÙNG AN TOÀN
DỤNG CỤ CẤY
KHỬ TRÙNG QUE CẤY
KHỬ TRÙNG ỐNG NGHIỆM
 CẤY CHUYỂN VI KHUẨN
Là chuyển một loại vi khuẩn từ môi trường chuyên
chở hay môi trường đang nuôi cấy sang môi
trường mới để vi khuẩn tiếp tục nhân lên.
• Thu hoạch lượng lớn vi khuẩn.
• Khảo sát hình thái, tính chất sinh lý, sinh hóa của
vi khuẩn.
 CÁC PHƯƠNG PHÁP CẤY CHUYỂN
Lỏng
o Môi trường lỏng

Thạch nghiêng

Lỏng

o Thạch đĩa Thạch nghiêng

Đĩa thạch
DỤNG CỤ VÀ MÔI TRƯỜNG CẤY
 CẤY CHUYỂN TRÊN MÔI TRƯỜNG LỎNG
• Tay phải cầm que cấy, tay trái cầm ống nghiệm
• Khử trùng que cấy
• Mở nút ống nghiệm
• Khử trùng không khí ở miệng ống nghiệm
• Dùng que cấy lấy vi khuẩn từ ống giống
• Chuyển que cấy sang ống môi trường
• Hơ miệng ống nghiệm, đậy nắp
• Khử trùng que cấy
• Đem ủ
CẤY TRUYỀN VI SINH VẬT TRÊN
MÔI TRƯỜNG LỎNG
CẤY CHUYỂN TRÊN ỐNG THẠCH NGHIÊNG
• Đốt que cấy
• Mở nút ống nghiệm
• Hơ miệng ống nghiệm trên ngọn lửa đèn cồn
• Dùng que cấy lấy vi khuẩn từ ống giống
• Lướt que cấy trên mặt thạch
• Hơ miệng ống nghiệm, đóng nút
• Đốt que cấy
• Đem ủ
CẤY TRUYỀN VI SINH VẬT TRÊN
MÔI TRƯỜNG THẠCH NGHIÊNG
CẤY CHUYỂN TRÊN ỐNG THẠCH NGHIÊNG
Các cách cấy lướt que cấy trên thạch

Hình chữ chi Hình vòng xoắn Hình vạch song song
QUAN SÁT VSV SAU KHI NUÔI CẤY
CẤY CHUYỂN TRÊN ỐNG THẠCH ĐỨNG
• Áp dụng nuôi cấy vi sinh vật kỵ khí
• Kỹ thuật tương tự cấy trên ống
thạch nghiêng, khác các điểm
o Sử dụng que cấy đầu nhọn

o Sau khi lấy mẫu, đâm sâu que cấy

vào khối thạch hình trụ cách đáy

ống nghiệm (2-3mm)
CẤY TRUYỀN VI SINH VẬT TRÊN
MÔI TRƯỜNG THẠCH ĐỨNG
 CẤY TRÊN ĐĨA THẠCH
• Cấy ria trên thạch
• Cấy trải trên hộp thạch
• Cấy đổ đĩa thạch

Mục đích: Tạo khuẩn lạc riêng lẻ thuần

khiết
 CẤY RIA TRÊN THẠCH
• Lấy một vòng vi khuẩn
• Mở hé nắp hộp
• Trải vi khuẩn: theo đường zic-zac sát nhau, trục
dây cấy tạo với mặt thạch góc 30o, mặt phẳng
vòng dây cấy gần song song với mặt thạch,
đường cấy rời nhau cách nhau 1 – 2 mm, đốt
que cấy.
• Xoay hộp thạch 90o. Trải vi khuẩn từ đường cấy
trên theo đường zig- zag. (Chỉ chạm vào đường
cũ 1-2 lần, các đường cấy rời, cách nhau 2-
3mm), đốt que cấy.
 CẤY RIA TRÊN THẠCH
• Xoay hộp thạch 90o. Trải vi khuẩn từ đường cấy
trên theo đường zic-zac (chỉ chạm vào đường cũ
1-2 lần, các đường cấy rời, cách nhau 3-4mm)
• Đốt dây cấy hoàn tất và đem ủ.
CẤY TRUYỀN VI SINH VẬT
TRÊN THẠCH ĐĨA
CẤY RIA TRÊN THẠCH

Dây cấy tạo Đốt nhẹ dây cấy

góc 300 với
đường cấy

Đốt nhẹ dây cấy

VI SINH VẬT MỌC TRÊN ĐĨA THEO ĐƯỜNG CẤY
 QUAN SÁT VSV SAU KHI NUÔI CẤY
− Môi trường lỏng: vi khuẩn làm đục môi trường.

− Thạch nghiêng: vi khuẩn xuất hiện dầy trên mặt

thạch trong hay trắng đục.

− Thạch đứng: vi khuẩn kỵ khí phát triển ở thạch

đứng cách miệng ống nghiệm 2-3mm.

− Hộp thạch petri: khuẩn lạc xuất hiện tách rời

riêng lẻ.
 PHÂN LẬP VÀ QUAN SÁT
VI KHUẨN TRÊN ĐĨA THẠCH
Màu sắc
o Màu vàng: S.aureus

o Vàng chanh: Sarcina lutea

o Trong như hạt sương: Streptococcus

o Tạo sắc tố xanh tiết ra môi trường: P.aeruginosa

Hình dạng
o Bìa khuẩn lạc

o Chiều cao

o Kích thước

Mùi
Sarcina lutea P. aeruginosa
QUAN SÁT HÌNH DẠNG KHUẨN LẠC
 KÍCH THƯỚC VÀ MÙI
− Kích thước của khuẩn lạc : TD Streptococcus
có kích thước khuẩn lạc < 0,5 mm
− Mùi hôi như E.coli

Streptococcus
 NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý

• Bề mặt môi trường thạch phải khô.

• Khi cấy truyền tránh chạm đầu que lấy vi khuẩn
vào bất cứ vật gì.
• Lau ngay dịch vi khuẩn khi bị rơi xuống mặt bàn.
• Cầm hai ống trên tay khi cấy truyền: ống vi
khuẩn xa người thao tác hơn ống môi trường.
• Hơ que cấy trên ngọn lửa trước và sau khi cấy
truyền.
MỤC ĐÍCH
• Giúp quan sát dễ dàng hình dạng tế bào, các
thành phần cấu trúc của tế bào VSV.
• Phân biệt các chủng VSV khác nhau  phân
loại, định dạng VSV.
 TIÊU BẢN NHUỘM VSV KHÔNG CỐ ĐỊNH
• VSV sống dùng dung dịch thuốc nhuộm loãng.
o Tế bào chết : bắt màu ngay
o Tế bào sống : bắt màu sau vài phút

• Các loại thuốc nhuộm thường dùng

o Dung dịch xanh methylene hay fuschin (1:1.000).

o Dung dịch đỏ Congo bão hoà 5%.

o Dung dịch đỏ trung tính (0,001 – 0,00001%).

TIÊU BẢN NHUỘM VSV KHÔNG CỐ ĐỊNH
• Cho một giọt thuốc nhuộm lên phiến kính (xanh
methylene 0,001%).
• Dùng que cấy đưa vào đó một ít VSV lấy từ
khuẩn lạc hay một giọt dịch nuôi cấy.
• Đậy lamelle lên giọt dịch.
• Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi ở vật kính
(10X) rồi (40X).
CHUẨN BỊ TIÊU BẢN NHUỘM VSV CỐ ĐỊNH
 Tạo và cố định vết bôi
• Cố định bằng nhiệt (phần thực hành)
• Cố định bằng hoá chất :

 Nhúng vết bôi vào cồn 95o khoảng 10 –15

phút rồi sấy khô rượu methylic ngâm khoảng 2
- 5 phút).
 Ngâm trong aceton 5 phút. Sấy bằng hơi

formol 10 –15 giây.

 Nhuộm và quan sát
 TẠO VẾT BÔI VÀ CỐ ĐỊNH VI SINH VẬT

VSV từ môi trường

thạch

VSV từ môi
trường lỏng
 NHUỘM ĐƠN (một loại phẩm nhuộm)
• Nhỏ vài giọt thuốc nhuộm lên vết bôi, để yên từ 1 - 2
phút.
• Rửa vết bôi bằng nước.
• Dùng giấy thấm khô tiêu bản hoặc hơ nhẹ tiêu bản
trên đèn cồn
• Quan sát tiêu bản ở vật kính (40X) rồi chuyển sang
vật kính (100X), soi với giọt dầu.

Một vài thuốc nhuộm: Fuchsin kiềm, xanh methylene,

tím gentian, đỏ trung tính.
NHUỘM GRAM (nhuộm kép)
 QUI TRÌNH NHUỘM GRAM VI KHUẨN

Tím Gentian 30s Rửa nước

Lugol trong 30s Rửa nước

Tẩy màu bằng cồn 8 - 10s Rửa nước

Nhuộm Fuchsin
30s hoặc Safranin Rửa nước

Làm khô
 LƯU Ý
• Thời gian tăng trưởng của chủng vi khuẩn phải tối
ưu, chuẩn bị trước 16 - 24h. Tế bào già mất khả năng
giữ màu thuốc nhuộm tím gentian giai đoạn đầu và
quan sát hình dạng không rõ.
• Tạo và cố định vết bôi vi khuẩn quá dày: VK Gram –
có thể bắt màu Gram + do không tẩy được hết màu
và không nhận diện được cách sắp xếp tế bào.
• Tẩy màu quá ngắn hoặc quá nhanh.
• Không hơ quá nóng  cháy hoặc thay đổi hình dạng
tế bào.
SOI KINH HIỂN VI 40X rồi 100X
 LƯU Ý KHI QUAN SÁT VI KHUẨN TRÊN
KÍNH HIỂN VI

Quan sát vi khuẩn sống Quan sát VK đã nhuộm

- Quan sát ở vật kính 40X - QS ở vật kính 100X
- Quan sát với giọt nước - Quan sát với giọt dầu
- Hạ thấp tụ quang, đóng - Nâng tụ quang lên cao
bớt chắn sáng tối đa, mở hết chắn sáng
- Tiêu bản đậy lamelle - Tiêu bản không đậy lamelle
HÌNH ẢNH NHUỘM GRAM VI KHUẨN

S.aureus S.feaclis

B.subtilis E.coli
 PHẦN THỰC HÀNH
• Quan sát sự di động của E.coli bằng phương
pháp giọt ép.
• Quan sát hình thái vi khuẩn trên các Lame đã
được chuẩn bị: mô tả, vẽ hình báo cáo theo mẫu
E.coli
S.aureus
S.feacalis
B.subtilis
• Nhuộm và quan sát vi khuẩn:ghi nhận kết quả
E.coli
S.aureus
• Thực hiện kỹ thuật cấy ria trên thạch
 BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC TẬP

Bài 1: CÁC KỸ THUẬT CƠ BẢN

Họ và tên:............................................Nhóm:.......................Lớp..............
1. Quan sát sự di động của vi khuẩn (Mô tả sự di động, không vẽ hình)
..................................................................................................................................
2. Quan sát lame mẫu

Tên vi Màu Hình Cách Vẽ hình

khuẩn sắc dạng sắp xếp

B.Subtilis Tím Que Chuỗi