Flutningur efnahópa: Transferasar og hydrolasar

(EC 2/3)

Frey, Kaflar/hlutar: 3, 6, 10, 12, 14, 15

2 Category:Transferases (EC 2) (Transferase)
2.1 Category:EC 2.1 (transfer one-carbon groups, Methylase)
2.2 Category:EC 2.2 (transfer aldehyde or ketone groups)
2.3 Category:EC 2.3 (acyltransferases)
2.4 Category:EC 2.4 (glycosyltransferases)
2.5 Category:EC 2.5 (transfer alkyl or aryl groups, other than methyl groups)
2.6 Category:EC 2.6 (transfer nitrogenous groups)
2.7 Category:EC 2.7 (transfer phosphorus-containing groups)
2.8 Category:EC 2.8 (transfer sulfur-containing groups)
AB + C → A + BC
2.9 Category:EC 2.9 (transfer selenium-containing groups)

3 Category:Hydrolases (EC 3) (Hydrolase)

3.1 Category:EC 3.1 (act on ester bonds)
3.2 Category:EC 3.2 (act on sugars - glycosylases)
3.3 Category:EC 3.3 (act on ether bonds)
3.4 Category:EC 3.4 (act on peptide bonds - Peptidase)
3.5 Category:EC 3.5 (act on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds)
3.6 Category:EC 3.6 (act on acid anhydrides)
3.7 Category:EC 3.7 (act on carbon-carbon bonds)
3.8 Category:EC 3.8 (act on halide bonds) AB + H O → AOH + BH
2
3.9 Category:EC 3.9 (act on phosphorus-nitrogen bonds)
3.10 Category:EC 3.10 (act on sulfur-nitrogen bonds)
3.11 Category:EC 3.11 (act on carbon-phosphorus bonds)
3.12 Category:EC 3.12 (act on sulfur-sulfur bonds)
3.13 Category:EC 3.13 (act on carbon-sulfur bonds)
 Acyl-flutningur: Próteasar/peptidasar
• Þrjár megingerðir út frá rofí á peptíðtengi
– Amínopeptídasar (exo-)
• Kljúfa –NH2 enda amínósýru
– Carboxypeptídasar (exo-)
• Kljúfa –COOH enda amínósýru
– Innankeðju próteasar (endo-)

• Fjórar megingerðir út frá gerð hvarfstöðva

– Serín próteasar (Trypsin, chymotrypsin, subtilísin)
• Sjá fyrirlestur 1 fyrir nánari umfjöllun
– Cysteine próteasar (Papain)
– Aspartic próteasar (Pepsín, HIV-próteasi)
– Metallo-próteasar (Thermolysin)
 Málmjóna (metallo) próteasar:
• Stærstu fjölskyldur próteasa
– „mononuclear“ Zn2+
• Lang algengast
– „binuclear“ (Mn, Co)
• Binding vatns við málmjón LÆKKAR pKa gildi vatns
– Auðvelt að mynda OH- við hlutlaust pH
• Veikur basi getur fjarlægt H+ af málmbundu H2O
• Minni jónaradíus hefur meiri áhrif til lækkunar

pKa H2O = 15.7

DDG =
3-16 kcal/mol
 Carboxypeptidase A: EC 3.4.17.1
• Klýfur a.s. á –COOH enda
– Virkastur gagnvart vatnsfælnum a.s.
– Hvatar einnig rof estera/thioestera
• Áhrif pH
– kcat/KM er „bjöllulaga“
• Glu270, pKa = 6.2 (kcat)
• Zn2+H2O , pKa= 9 (KM)
• Pre-steady state (stopped flow) RDS

Amíð
ester
Carboxypeptidase A: Hvarfgangur
 Esterasar

• Esterasar hvata vatnsrof á estertengjum

– Acetylcholinesterasi
• Acetylcholine = taugaboðefni
– Alkaline phosphatase (phosphomonoester)
• Virkni AP mældur í blóði; „clinical chemistry“
• Hjálpar við að greina lifrartengda sjúkdóma
– Lípasar
• Esterar af fitusýrum
• Phospholipase A2
• Svipuð og hvörf próteasa
– Flestir próteasar (amíð) eru líka esterasar
– Auðveldara að kljúfa ester en amíð
• 104 munur í hvarfgirni gagnvart OH-
 Fosfórýl-flutningur: Almennt
• Flutningur eða vatnsrof fosfórhópa er með algengustu
og mikilvægustu efnahvörfum allra lífvera
– Efnaskiptahvörf (metabolism)
– Orkumiðlun (energy transduction)
– Kjarnsýrumyndun og vinnsla (eftirmyndun/replication)
– Boðskiptaferlar
• Boðflutningur (signal transduction)
• Frumuþroski
• Stýrður frumudauði (apoptosis)
• Tvennskonar gerðir:
– Fosforýl (-PO3-) og alkylfosforýl (ROPO2-)
Efnafræði fosforýl flutnings: „Monoesterar“

• Fosfómónóesterar (-RO-PO32-)
– Adenosine monophosphate (AMP)

• Fosfóanhýdríð(-O2P-O-PO2-2)
– Adenosine triphosphate

• Fosforamídöt (-R2N-PO32-)
– Phosphocreatine
 Monoesters: „Dissociative“ rof

• Víxlverkun gjafa (donor) og viðtaka (acceptor) er lítil í virkjaða

ástandinu
– Binding við fosfór er minni en í grunnástandi
– „Bond order“ fyrir X og Y er einungis 0.1-0.2
– Rofið er „dissociative“; unimolecular Metafosfat
– „laust“ virkjunarástand“ Mjög laust
 Áhrif sýrustigs á vatnsrof alkylfosfats
• Þrátt fyrir að
„einjónin“ rofni
hraðast þá er það í
raun „zwitter“ jónaða
formið sem hvarfast
• Súrefni er tvíjónað

• Almennt: Gerð
kjarnsækis skiptir litlu
máli
Vatnsrof Monoestera: Mikilvægi tvíjónunar
A B
• Fosfóanhydríð
– A og B eru tautomerur
– Vatnsrof þeirra er 2000X
hraðara en C
– D er rofið með svipuðum C D
hraða of B

• Arylfosföt
– Rafeindasæknir hópar (-
NO2) gera prótóneringu á
súrefni óþarfa
– Tvíjónað fosfat mun
hvarfgjarnara en einjónað

Tvíjónun á fosfati er drifkraftur fosforýlflutnings

 Fosfótvíesterar
• Ólíkt monoesterum er vatnsrof tvíestera meira háð
stöðugleika farhóps og styrk kjarnsækis
– „bimolecular hvarf
– há neikvæð virkjunaróreiða (-DS‡)
– Stöðugri gagnvart vatnsrofi en monoesterar (104)
– Geta ekki myndað tvíanjón í virkjaða ástandinu
– Þétt (tight) virkjunarástand (associative)
– Bond order = 0.5 í virkjaða ástandinu
– Mögulegt pentavalent millistig
 Fosfóþríesterar
• Vegna þess að fosfóþríesterar eru ekki með neikvæða
hleðslu eru hvörf þeirra mun hraðari gagnvart
kjarnsækjum en annarra fosfóestera
– Fráhrindikraftar vegna neikvæðrar hleðslu á fosfójón(um)
ekki til staðar
– 2000-falt hraðara basahvatað vatnsrof en hjá diesterum
– Mjög þétt, „associative“ virkjunarástand

Mono-

Di-

Tri-
 Ensímatísk fosforýl hvörf
• Einþætt eða tvíþætt tilfærsla
– Single or double displacement
– Myndast fosfó-ensím milliefni (tvíþætt) eða ekki?
A-P + B A + B-P

Alltaf tvíþætt
A fer áður en B binst
E-P milliefni nauðsynlegt Ekki auðvelt að greina með hraðafræði
 Rúmefnafræði fosforýl flutnings
Associative (SN2)

Dissociative (SN1)

Umsnúningur (inversion) um fosfór á sér stað við flutning

 Rúmefnafræði fosforýl flutnings
• Hægt er að gera fosfór hendið með að setja inn
brennistein eða þungar samsætur af súrefni
• Hver staða er „pro-chiral“

• Hendni fosfórs fyrir og eftir hvarf ákveðið með 31P NMR

mælingum
Rúmefnafræði ensímhvataðra
fosforýlhvarfa
 Gerðir af fosforýlensímun
• Kínasar
– Pyruvate kinase, creatine kinase, phosphofructokinase
• Prótein kínasar
– Fosforýlering á próteinum (Ser/Thr eða Tyr)
• Fosfomónóesterasar
– His, Cys, Ser/Thr fosfatasar
– Málm og pyrofosfatasar (PPi)
• Phosphodiesterasar
– cAMP diesterasar, Ribonuclease A
• Nucleotidyl transferaser
• Polymerasar
• Ríbósím
 Pyruvate Kinase: EC 2.7.1.40

• Fjórliða (hver undireining 40-50 kDa)

• Ekkert E-P milliefni (einþætt færsla)
• Varmafræðilega liggur hvarfið í átt að ATP (-6 kcal/mol)
– Mjög hátt efnamætti (chemical potential) PEP
• Þarf bæði Mg2+ og K+ fyrir virkni
Pyruvate Kinase: Hvarfstöðin
Pyruvate Kinase: Hvarfgangur
 Fosfómónoesterasar- Fosfatasar

R-OPO3-2 + H2O R-OH + HPO4-2

R = smásameindir, peptíð, prótín

• Ser/Thr, Cys og His fosfatasar mynda allir E-P milliefni

– E-Ser kjarnsækir; Alkalískur fosfatasi
– E-His kjarnsækir; „súr fosfatasi“
– E-Cys kjarnsækir Prótín týrosín fosfatasi (PTP)

• Málmfosfatasar (pyrophosfatasi > PPi)

 „Súrir“ Fosfatasar – His
• Vinna við lágt pH (pH 2.5)
– Leysikorn (lysosome)
• His12 er kjarnsækir sem myndar E-P milliefni
• Arg15/79/11 binda fosfat
• Asp258 (304) er sýra sem prótónerar –O í farhóp
Hvarfstöðin með Vanadate TS hindra
Van = „Trigonal bipyrimidal“
 Hlutverk Asp304: LFER/SAR
• Vmax (kcat) sem fall af pKa gildum
Linear free energy relationship (LFER)
fyrir mismunandi phenyl-fosfat Structure activity relationship (SAR)
hvarfefni H2O
Pase R1 OH
R1 O PO3-2
R2 R3 R2 R3
-2
HPO4
pKa

• Vmax lækkar um 30-1600-falt við

D304A breytingu
– Mikil áhrif eftir pKa gildi farhóps
– Sýru/basa hvati
• Breyting á hraðatakmarkandi
skrefi (RLS)
– Rof P-esters er RLS í D304A
– Lítil áhrif farhóps í WT WTslope = -0.08
– Rof E-P er RLS D304Aslope = -0.5
 Hvarfgangur His-Pasa

• Þrjár Arg a.s. stöðga fosfathóp hvarfefnis

– Rafstöðu (electrostatic) hvötun
– Bindihópar
• His12 er kjarnsækir myndar E-P milliefni
– Hvötun með samgildum tengjum (covalent catalysis)
• Asp304 er sýru/basa hvati
– Stöðgar farhóp
Flutningur sykrukeðja: Glycosyl transfer
• Myndun (biosynthesis) og niðurbrot:
– Nucleotíð
– Sykruprótín (glycoproteins)
– Sykraðar fitur (glycolipids)
– Ákveðnir DNA viðgerðarferlar

– Rof við „anomer“ kolefni (a-axial eða b-equatorial)

– Y-R2
• H2O (glycosidasar)
• ROH, RNH2, RNHCO, RSH, RPO42- (glycosyltransferases)
 Sykrurof: SN1- eða SN2-lík hvörf?
Sykrur eru stöðugar gagnvart basa og brotna nær
eingöngu niður með sýruhvötuðu rofi

• A) Myndun á oxocarbenium milliefni (virkjunarástandi)

– SN1 líkur hvarfgangur
– Oxocarbenium jónin er stöðguð í gegnum resonance við
súrefni (-O+=C <-> -O-C+)
• B) Vatn er kjarnsækir í SN2 líkum hvarfgangi
Flutningur alkýlhópa: Alkyltransferasar

• R = H eða lífræn sameind (önnur en sykra)

• „Einföld“ hvörf
– Kjarnsækir (X) leggst á kolefni og rafsækir (Y) fer
• A) Associative (SN2)
• B) Dissociative (SN1); karbókatjónir
 S-Adenosylmethionine (SAM)

• Algengasti hjálparþáttur/hvarfefni sem notaður er í flutningi

metýlhópa
• Frekar óstöðug sulfonium jón (t1/2 = 12-60 tímar)
– Hvarfast auðveldlega við kjarnsækja
– SAH mjög góður farhópur
• SAM einnig notað í „radical“ hvörfum (sjá síðar)
Catechol-O-Methyltransferases (COMT)
• Methýlering nauðsynleg í ýmsum lífefnafræðilegum
ferlum
– Myndun taugaboðefna (neurotransmitters)
– Merkingu DNA (DNA metýlering)
– Esterun á boðefnapróteinum (Asp-b carboxyl)
– Losun eiturefna (xenobiotics)
 COMT: Hvarfgangur

• Mg2+ lækkar pKa gildi catechol með bindingu við báða

–OH hópana
– Monoanjónin er virka hvarfefnið
– Aukin kjarnsækni beggja súrefnisatóma
• Glu199 virkjar annan –OH hóp catechols fyrir
kjarnsækna árás á metýlhóp SAM (SN2)
• Ensímið gerir í raun lítið annað en leggja kjarnsæki og
rafsæki í rétta stöðu fyrir árás
 Endurnýjun SAM: 3 ensím
• SAM er ekki endurnýjað beint með metýleringu á
SAH
• SAH er brotið niður í adenosine og homocysteine
– SAH hydrolase
• Homocysteine er metýlerað í methionine
– Methionine synthase (MetH)
– 5-methyl-tetrahydrofolate
• Methionine breytt í SAM
– SAM synthetase (Met + ATP > SAM + PPi + Pi)
Squalene Synthase EC 2.5.1.21: Carbókatjónir
• Myndun karbókatjóna í ensímhvötuðum hvörfum er
sjaldgæf
– Glycosyltransferasar
– Myndun terpena (23,000!)
• Allyl pyrofosföt > allyl carbókatjónir
• Squalene synthase Isoprene
– Nýmyndun á cholesteroli
– Kúplun tveggja farnesyl-pyrophosphate sameinda
A ) Myndun PSPP (cyclopropyl)

B) Myndun Squalene

Cyclopropylcarbinyl katjón