13.

HPLC
13. HPLC
(HIGHPERFORMANCE
(HIGH PERFORMANCELIQUID
LIQUIDCHROMATOGRAPHY)
CHROMATOGRAPHY)
May 18, 2020 1
What Is High Performance Liquid Chromatography (HPLC)?

The acronym HPLC, coined by the late Prof. Csaba Horváth for his 1970
Pittcon paper, originally indicated the fact that high pressure was used to
generate the flow required for liquid chromatography in packed columns. In
the beginning, pumps only had a pressure capability of 500 psi [35 bar].
This was called high pressure liquid chromatography, or HPLC. The early
1970s saw a tremendous leap in technology. These new HPLC
instruments could develop up to 6,000 psi [400 bar] of pressure, and
incorporated improved injectors, detectors, and columns. HPLC really
began to take hold in the mid-to late-1970s. With continued advances in
performance during this time [smaller particles, even higher pressure], the
acronym HPLC remained the same, but the name was changed to high
performance liquid chromatography.

May 18, 2020 2

 High performance liquid chromatography is now one of the
most powerful tools in analytical chemistry. It has the ability
to separate, identify, and quantitate the compounds that
are present in any sample that can be dissolved in a liquid.
Today, compounds in trace concentrations as low as parts
per trillion [ppt] may easily be identified. HPLC can be, and
has been, applied to just about any sample, such as
pharmaceuticals, food, nutraceuticals, cosmetics,
environmental matrices, forensic samples, and industrial
chemicals.

HPLC Column

May 18, 2020 3

Dasar Pemikiran Lahirnya HPLC
Dari kromatografi gas menuju HPLC. Perbedaan yg pertama
adalah pada fasa geraknya. Dimana pada HPLC
menggunakan cairan. Dibandingkan dgn gas, cairan
mempunyai viskositas yg relatif lebih besar dan kecepatan
aliran yg relatif lebih kecil. Sebagai akibatnya kromatografi
cairan menyita waktu analisa yg relatif lebih lama.
Pada awal tahun 1960, para peneliti mulai memikirkan cara
yg harus ditempuh untuk memperbaiki teknik ini. Timbul
pemikiran untuk memperbesar kecepatan aliran fasa gerak
dalam kolom dangan bantuan suatu pompa.
Masalahnya sekarang, dari persamaan Van Deemter
H = A + B/u + Cu
Terlihat bahwa jika u maksimum, maka H akan minimum
dan efisiensi kolom menurun.
May 18, 2020 4
Tetapi ternyata kurva Van Deemter dari kromatografi cairan
mempunyai karakterisasi yg agak berbeda dengan
kromatografi gas. Hal ini disebabkan koefisien difusi molekul
komponen di dalam fasa gerak cair jauh lebih kecil
dibandingkan dgn koefisien difusinya dalam fasa gerak gas

H GAS

CAIRAN

May 18, 2020

Kecepatan aliran (u) 5
Terlihat dari gambar, naiknya H pada kecepatan aliran yg
cukup tinggi utk kromatografi cairan, relatif lebih mendatar
dibandingkan dgn kromatografi gas. Pada kromatografi
cairan, tebal pelat teori utk kec aliran yg relatif tinggi dapat
dikatakan konstan.

Hal ini berarti bahwa sangat mungkin, demi menghemat

waktu digunakan kecepatan aliran yg sangat tinggi, tanpa
mengorbankan terlalu banyak resolusi kromatografi.
Kenyataan inilah yg menjadi dasar lahirnya kromatografi cair
tekanan tinggi (HPLC). Sedikit berkurangnya efisiensi pada
HPLC dapat diatasi dengan menggunakan kolom yg sedikit
lebih panjang.

May 18, 2020 6

Daya Pisah (Resolusi)
Pada umumnya posisi pita-pita elusi pada sumbu horizontal
kromatogram dan lebar mereka akan menentukan betapa
sempurnanya suatu pemisahan campuran awal itu telah
dicapai. Meskipun sampel-sampel itu mungkin mempunyai
banyak komponen, kita andaikan bahwa sepasang
komponen akan paling sulit dipisahkan dan membatasi
pembatasan pemisahan campuran pada sistem 2 komponen
saja.
Pemisahan, R, dari dua komponen didefinisikan di bawah ini,
dengan menggunakan suku/faktor yg ditunjukkan dalam
gambar berikut :
2  t R 2 - t R1 
R
Wb 1  Wb 2
May 18, 2020 7
 tR2

tR1
Respon detektor

W1/2 1 W1/2 2

Wb 1 Wb 2

waktu

May 18, 2020 8

Cara lain, jika lebar pita diukur, setengah tinggi antara garis
dasar dan puncak pita, persamaan akan menjadi

2  t R 2 - t R1 
R
1,699  W1/2 1  W1/2 2 
Jika R = 1,5 kedua zat terlarut itu dapat dikatakan
terpisahkan dengan sempurna; hanya akan terjadi 0,3%
tumpang tindih dari kedua pita elusi. Jika R = 1 pemisahan
akan memadai untuk kebanyakan analisis; tumpang tindih
kira-kira akan sebesar 2%. Dengan mengecilnya R menjadi
kurang dari 1, tumpang tindih itu menjadi makin parah,
sehingga kira-kira pada R = 0,75 (50% tumpang tindih),
pemisahan itu menjadi tidak memuaskan bagi kebanyakan
maksud.
May 18, 2020 9
Faktor Pemisahan
Jika usaha yg logis untuk mencapai pemisahan dgn
menyempit agar berpisah lebih jauh, dengan mengubah nilai
K untuk zat terlarut. Angka banding waktu-waktu retensi tR2 /
tR1, disebut faktor pemisahan, S (beberapa menggunakan
lambang SF atau  untuk angka banding ini). Biasanya
angka banding waktu retensi kira-kira sama seperti angka
banding nilai K untuk kedua zat terlarut.
tR 2 K2
S 
t R 1 K1
Perhatikan bahwa S tidak sama dengan pemisahan R.
Angka banding waktu retensi, yg diukur pada puncak-puncak
(dari) pita elusi, tidaklah dgn sendirinya memberikan
keefektifan pemisahan, karena tidak mengatakan apapun
mengenai
May 18, 2020 lebar pita. 10
Faktor – Faktor Retensi

Untuk banyak maksud, volume retensi suatu zat terlarut , VR,

jauh lebih nyaman daripada waktu retensi. Volume retensi
merupakan hasil kali waktu retensi dengan laju alir fasa
gerak; karena terdapat hubungan terbalik antara laju alir dgn
waktu retensi, maka VR tidak bergantung pada laju alir.

VR  t R  v

May 18, 2020 11

 Identifying and Quantitating Compound

Identification

May 18, 2020 12

 Identification and Quantitation
May 18, 2020 13
High-Performance Liquid Chromatography [HPLC] System

May 18, 2020 14

Peralatan
Semenjak lahirnya HPLC sampai saat sekarang banyak
kemajuan yg diperoleh baik di dalam peralatan, cara analisa
maupun waktu analisa yg diperlukan. Didalam pemilihan
suatu sistem peralatan HPLC diperlukan suatu patokan akan
digunakan untuk apa, karena banyak komponen-komponen
HPLC yg harganya relatif mahal. Dari itu dalam pemilihan
suatu komponen dianjurkan beberapa pemikiran sbb :

1. Keunikan dari sampel yg akan dianalisa, apakah elusi

dilakukan isokratik atau gradien.
2. Jumlah sampel yg akan dianalisa dan tujuan analisa,
apakah pemisahan biasa atau preparatif.
3. Sensitifitas.
4. Jumlah analisa akan dilakukan.
5. Frekuensi pemakaian.
May 18, 2020 15
Pompa
Gunanya untuk mendorong fasa gerak masuk ke dalam
kolom. Karena kecilnya ukuran partikel fasa diam yg ada
dalam kolom maka tekanan pompa yg diperlukan untuk
memompakan fasa gerak harus cukup tinggi. Adapun tipe
pompa yg digunakan haruslah memenuhi persyaratan
berikut :

1. Dapat memompakan fasa gerak secara konstan (0,1 – 10

ml/menit)
2. Dapat memberikan tekanan yg cukup tinggi
3. Memberikan fluktuasi tekanan seminimal mungkin
4. Memberikan gangguan (noise) yg rendah
5. Cara kerja yg sederhana
6. Cukup inert terhadap pelarut-pelarut yg digunakan.

May 18, 2020 16

Ada dua tipe pompa yg digunakan dlm HPLC :
a. Pompa dengan tekanan tetap
b. Pompa dengan kecepatan alir tetap.

Dari kedua jenis pompa di atas yg sering digunakan

adalah pompa dgn kecepatan alir tetap.

Untuk suatu campuran senyawa yg kompleks yg terdiri dari

komponen-komponen yg mempunyai afinitas yg sangat
berbeda sering didapatkan pemisahan yg tidak sempurna
apabila digunakan sistem isokratik. Untuk pemecahan
persoalan ini komposisi fasa gerak dapat diubah selama
proses pemisahan sesuai dgn tingkat afinitas masing-masing
komponen. Elusi dgn cara ini dikenal sebagai elusi gradien
atau programming pelarut.

May 18, 2020 17

Ada dua tipe elusi gradien, yaitu :

1. Sistem gradien tekanan rendah

Fasa gerak dicampurkan pada tekanan atmosfir dan
campuran dipompakan dengan pompa single high
pressure. Gradien tekana rendah relatif tidak terlalu
mahal. Kelemahan sistem ini adalah agak sulit di dalam
operasional, kurang reproducible dan pertukaran
komposisi fasa gerak relatif lambat.

2. Sistem gradien tekanan tinggi

Elusi ini menggunakan 2 pompa. Masing-masing larutan
dipompakan dengan satu pompa saling terpisah. Kedua
pompa dihubungkan dengan alat pemogram, dengan
melewati alat ini maka larutan dialirkan utk masuk ke
dalam kolom.
May 18, 2020 18
 Isocratic LC System

May 18, 2020 19

 Low-Pressure-Gradient System

May 18, 2020 20

 High-Pressure-Gradient System

May 18, 2020 21

Injektor
Adalah tempat memasukkan contoh yg akan dianalisa ke
dalam sistem HPLC. Untuk mendapatkan pemisahan yg
sempurna selain ditentukan oleh kolom yg baik juga
ditentukan oleh banyaknya zat yg dimasukkan ke dalam
sistem melalui injektor.
Suatu injektor dikatakan baik jika :
- Dapat memasukkan zat ke dalam kolom sesedikit mungkin.
- Memiliki keberulangan tinggi.
- Dapat digunakan pada situasi dimana tekanan balik pada
kolom relatif tinggi.
- Mudah digunakan.

May 18, 2020 22

May 18, 2020 23
 LOAD
Sampel
2

Fasa gerak Masuk 1

3

6
Menuju
Kolom 5

Drain

INJECTION VALVE
May 18, 2020 24
 INJECT
Sampel
2

Fasa gerak Masuk 1 3

6 4
Menuju
Kolom
5

Drain

INJECTION VALVE
May 18, 2020 25
 LOAD
Sampel

Fasa gerak Masuk

Menuju
Kolom

Drain

INJECTION VALVE
May 18, 2020 26
 INJECT
Sampel

Fasa gerak Masuk

Menuju
Kolom

Drain

INJECTION VALVE
May 18, 2020 27
 (polyetheretherketone)

Column Hardware Examples

May 18, 2020 28

 Column Length and Mechanical Separating Power [Same Particle Size]

Particle Size and Mechanical Separating Power [Same Column Length]

May 18, 2020 29

 HPLC Scale [Analytical, Preparative, and Process]

HPLC provides analytical data that can be used both to

identify and to quantify compounds present in a sample.
However, HPLC can also be used to purify and collect desired
amounts of each compound, using a fraction collector
downstream of the detector flow cell. This process is called
preparative chromatography

May 18, 2020 30

 HPLC Column Dimensions

May 18, 2020 31

 Chromatography Scale vs. Column Diameter and Particle Size

May 18, 2020 32

 Chromatographic Polarity Spectrum by Analyte Functional Group

Water [a small molecule with a high dipole moment] is a polar

compound. Benzene [an aromatic hydrocarbon] is a non-polar
compound. Molecules with similar chromatographic polarity
tend to be attracted to each other; those with dissimilar polarity
exhibit much weaker attraction, if any, and may even repel one
another. This becomes the basis for chromatographic
separation modes based on polarity.
May 18, 2020 33
 Mobile Phase Chromatographic Polarity Spectrum

Stationary Phase Particle Chromatographic Polarity Spectrum

May 18, 2020 34

HPLC Separation Modes

In general, three primary characteristics of chemical

compounds can be used to create HPLC separations. They
are:
• Polarity
• Electrical Charge
• Molecular Size

First, let’s consider polarity and the two primary separation

modes that exploit this characteristic: normal phase and
reversed-phase chromatography.

May 18, 2020 35

Normal-Phase HPLC
In his separations of plant extracts, Tswett was successful
using a polar stationary phase [chalk in a glass column; see
Figure A] with a much less polar [non-polar] mobile phase.
This classical mode of chromatography became known as
normal phase.

Normal-Phase Chromatography

May 18, 2020 36

Reversed-Phase HPLC
The term reversed-phase describes the chromatography
mode that is just the opposite of normal phase, namely the
use of a polar mobile phase and a non-polar [hydrophobic]
stationary phase. This Figure illustrates the black three-dye
mixture being separated using such a protocol.

Reversed-Phase Chromatography

May 18, 2020 37

Today, because it is more reproducible and has broad
applicability, reversed-phase chromatography is used for
approximately 75% of all HPLC methods. Most of these
protocols use as the mobile phase an aqueous blend of water
with a miscible, polar organic solvent, such as acetonitrile or
methanol. This typically ensures the proper interaction of
analytes with the non-polar, hydrophobic particle surface. A
C18–bonded silica [sometimes called ODS] is the most
popular type of reversed-phase HPLC packing.

Phase Characteristics for Separations Based on Polarity

May 18, 2020 38

Separations Based on Charge: Ion-Exchange
Chromatography [IEC]

For separations based on polarity, like is attracted to like and opposites

may be repelled. In ion-exchange chromatography and other separations
based upon electrical charge, the rule is reversed. Likes may repel, while
opposites are attracted to each other. Stationary phases for ion-
exchange separations are characterized by the nature and strength of
the acidic or basic functions on their surfaces and the types of ions that
they attract and retain. Cation exchange is used to retain and separate
positively charged ions on a negative surface. Conversely, anion
exchange is used to retain and separate negatively charged ions on a
positive surface [see Figure T]. With each type of ion exchange, there
are at least two general approaches for separation and elution.

May 18, 2020 39

 Ion-Exchange Chromatography

May 18, 2020 40

May 18, 2020 41
Separations Based on Size: Size-Exclusion Chromatography [SEC]
–Gel-Permeation Chromatography [GPC]

In the 1950s, Porath and Flodin discovered that biomolecules could be

separated based on their size, rather than on their charge or polarity, by
passing, or filtering, them through a controlled-porosity, hydrophilic
dextran polymer. This process was termed gel filtration. Later, an
analogous scheme was used to separate synthetic oligomers and
polymers using organic-polymer packings with specific pore-size
ranges. This process was called gel-permeation chromatography
[GPC]. Similar separations done using controlled-porosity silica
packings were called size-exclusion chromatography [SEC]. Introduced
in 1963, the first commercial HPLC instruments were designed for GPC
applications.

May 18, 2020 42

May 18, 2020 43
Detektor

Detektor digunakan untuk mendeteksi komponen-komponen

yg telah dipisah dalam kolom. Pendeteksi ini gunanya untuk
menentukan komponen-komponen baik secara kuantitatif
maupun kualitatif. Didalam analisa kuantitatif sinyal detektor
bergantung pada konsentrasi contoh. Perbandingan antara
sinyal dan konsentrasi disebut sensitifitas. Suatu detektor
dikatakan amat sensitif apabila terjadi perubahan sinyal yg
besar oleh perubahan konsentrasi yg kecil.

Berbagai macam detektor yg telah dikembangkan untuk

kromatografi cairan adalah : Detektor Indeks Refraksi (RI),
Detektor UV/Vis, Detektor Fluoresense, Detektor Hantaran

May 18, 2020 44

1. Detektor Indeks Refraksi (RI)

Detektor RI adalah detektor universal yg memberikan respon

apabila ada perbedaan indeks refraksi antara fasa gerak dan
fasa gerak yg mengandung komponen. Sensitifitas dari
detektor ini lebih rendah kalau dibandingkan dengan detektor
UV dan fluoresense. Perbedaan indeks refraksi sangat
dipengaruhi oleh temperatur. Biasanya detektor RI dapat
mencatat perubahan indeks refraksi sebesar 10-7. Detektor
ini dapat digunakan utk percobaan dgn elusi gradien.

May 18, 2020 45

2. Detektor UV/Vis

Tipe pengukuran pada detektor ini didasarkan pada

absorpsi pada daerah UV dan Visible. Detektor UV/Vis
paling banyak dipakai pada HPLC karena lebih sensitif dan
kebanyakan zat-zat organik menyerap radiasi pada UV/Vis.
Pada umumnya ada 4 tipe detektor UV/Vis :

1. Detektor dgn panjang gelombang tunggal, biasanya panjang

gelombang 254 nm
2. Detektor dgn beberapa panjang gelombang
3. Detektor dengan panjang gelombang yg menggunakan
monokromator utk pemilihan panjang gelombang
4. Detektor UV/Vis yg dilengkapi dengan kemampuan
spektrum dan dapat menyimpan spektrum
May 18, 2020 46
 3. Detektor Fluoresense
Detektor ini merupakan detektor yg paling peka dan sangat
selektif. Digunakan dalam analisa biokimia dan biomedikal
karena senyawa-senyawa seperti ; porpirin, ribiflavin,
aflatoksin, vitamin dan obat-obatan berfluoresensi kuat.
Deteksi dgn detektor ini lebih sensitif drpd detektor UV/Vis
karena yg diukur adalah energi emisi dari komponen yg
dieksitasikan oleh radiasi sinar lembayung. Batas deteksi
minimum dapat mencapai pikogram.

Bila komponen yg pada awalnya tidak berfluoresensi, dapat

direaksikan menjadi bentuk yg berfluoresensi. Detektor ini
dapat digunakan utk elusi gradien apabila pelarut yg
digunakan dapat bersifat meredam fluoresensi seperti
CH2Cl2, CHCl3 dll.
May 18, 2020 47
 4. Detektor Hantaran
Detektor ini digunakan untuk mendeteksi ion-ion yg
didasarkan pada sifat-sifat elektrokimia ion. Pengukuran
dapat dilakukan dengan konduktometer. Teknik ini pada
dasarnya adalah mengukur hantaran listrik dari ion-ion. Tiap-
tiap ion mempunyai hantaran jenis tertentu, tergantung pada
muatan dan besarnya jari-jari ion.

May 18, 2020 48