Krebsov ciklus

Radili: Miladin Koćalo,

Vladimir Jevtović i Ratko
Ćirović
 Krebsov ciklus ili ciklus
limunske kiseline ili TCA
ciklus je jedan od
temeljnih metaboličkih
ciklusa kod stanica koje
koriste kiseonik u procesu
staničnog disanja. Kod
aerobnih organizama,
Krebsov je ciklus ključni
metabolički proces koji
spaja puteve degradacije
(katabolizma) ugljikohidra
ta, lipida (masti)
i bjelančevina u ugljični
dioksid i vodu uz
oslobađanje hemijske
energije.
 Krebsov ciklus je amfibolički metabolički put, pošto
sudjeluje i u degradaciji organskih molekula
(katabolizam) i u biosintezi molekula (anabolizam).
Najvažniji metabolički putovi koji se vežu na Krebsov
ciklus su glikoliza i oksidativna dekarboksilacija
piruvata koje mu prethode i oksidativna
fosforilacija koja mu slijedi. Krebsov ciklus je važan i
kao izvor prekursora aminokisjelina (acetil CoA, α-
ketoglutarat, sukcinil
CoA, sukcinat, fumarat, oksalacetat).
 Ciklus nosi ime po Hansu Adolfu Krebsu, britanskom
biohemičaru njemačkog porijekla koji je otkrio ključne
elemente procesa i za to dobio Nobelovu nagradu za
medicinu 1953. godine.
 Osnovne reakcije

Krebsov ciklus se odvija u mitohondrijima eukariotskih stanica i

u citoplazmi prokariotskih stanica. Katabolizam ugljikohidrata i masti stvara acetil-

CoA, molekulu sastavljenu od jedne acetilne skupine vezane na koenzim A. Acetil-

CoA je osnovni supstrat Krebsovog ciklusa. Dvije molekula acetil-CoA oslobađaju

svoje acetilne skupine, koje se spajaju s oksalacjetatom i formiraju limunsku

kisjelinu. Limunska kiselina prolazi kroz niz metaboličkih procesa, oslobađa dvije

molekula ugljičnog dioksida (CO2) i regeneriše se ponovo u oksalacetat koji je

spreman za sljedeći ciklus. Najbitnije reakcije u energetskom smislu su formiranje

molekula GTP, koja odmah regenerira jednu molekulu ATP, proizvodnja tri

molekula NADH i jedne FADH2.
 Reducirani kofaktori (NADH i FADH2) imaju ulogu prelaznih
molekula u procesima oksidacije i redukcije. U redukcionom
stanju prenose elektrone od oksidovanih molekula iz samog
Krebsovog ciklusa i glikolize do prve faze oksidativne
fosforilacije, tzv. lanca prenosa elektrona. Tada dolazi do
oksidacije u NAD+ i FAD i davanja elektrona, koji će za
vrijeme oksidativne fosforilacije bili iskorišteni za
regeneriranje ATP iz ADP.
 Konačna stehiometrijska formula svih reakcija je sledeća:
 Energija koja se dobije od potpune razgradnje
jednog molekula glukoze kroz tri faze
staničnog disanja (glikoliza, Krebsov ciklus
i oksidativna fosforilacija) je 36 molekula
ATP. U stvarnosti se proizvede 38 molekula
ATP, ali dvije su iskorištene za prenos
(aktivnim transportom) dviju molekula
NADH proizvedenih putem glikolize
iz citoplazme kroz membranu mitohondrija.
Stepeni Krebsovog
ciklusa
 1. Citrat sinteza
 Prvi enzim u Krebsovom ciklusu, citrat sintetaza katalizira reakciju kondenzacije acetil-
CoA s oksalacetatom iz kojeg nastaje citrat (limunska kisjelina). Enzim ima dvije strukturne
podjedinice i svaka od njih sposobna je vezati oba supstrata za svoje aktivno mjesto. Enzim
katalizira aktivaciju acetil-CoA, kako bi povećao afinitet prema oksalacetatu. Nakon
povezivanja acetilne skupine na oksalacetat, tioesterna se grupa (CoA)
odvaja hidrolizom kako bi se oslobodila limunska kisjelina.

ΔG'°=-31.4 kJ/mol
 hemijska reakcija : Acetil-CoA +
oksakacetat + H2O → citrat + CоА
+ H+
*Reakcija je vrlo egzoergonska tj.
oslobađa energiju (ΔG'°=-31.4 kJ/mol)
što sprječava da reakcija teče u
suprotnom smjeru. Limunska kisjelina
ima i ulogu regulisanja aktivnosti samog
enzima, pošto djeluje kao kompetitivni
inhibitor. Sposobnost inhibicije citrat
sintetaze je jako bitna za reguliranje
cijelog Krebsovog ciklusa, pošto ona
funkcionira kao
biohemijski pacemaker.*
struktura sitrat sintetaze
 2. Akonitaza
 Akonitaza katalizira izomerizaciju limunske kisjeline (citrata) u izocitrat kroz
prijelazno formiranje cis-akonitata. Citrat prolazi proces dehidracije C3 ugljika
i stvaranje međuspoja cis-akonitata, koji se potom hidrira u C2 formirajući
izocitrat. Reakcija može teći i u suprotnom smjeru, ali to se ne događa u
Krebsovom ciklusu zbog zakona o djelovanju masa. Koncentracija citrata je
91%, međuspoja cis-akonitata je 3%, a izocitrata 6%. Reakcija stoga
nepovratno teče prema izocitratu.

*U aktivnom mjestu
akonitaze nalazi se skupina
željezo-sumpor koja
veže supstrat, zajedno s
određenim
ΔG'°=+6.3 kJ/mol
polarnim aminokisjelinama.
Hemijska jednačina: citrat → cis-akonitat + H2O → izocitrat  Prostorna struktura aktivnog
mjesta dopušta samo
vezivanje 1R,2S citrata,
odbijajući suprotni izomer.
Struktura
Struktura akonitaze
akonitaze
 3. Izocitrat dehidrogenaza
 Mitohondrijska izocitrat dehidrogenaza je enzim koji zavisi o
NAD+, Mn2+ i/ili Mg2+. U početku enzim katalizuje
oksidaciju izocitrata u oksalsukcinat i proizvede jednan molekul NADH od NAD+.
Potom jedan bivalentni ion (Mn2+ ili Mg2+) veže kiseonik iz karboksilne skupine i
povećava elektronegativnost tog dijela molekula. Dolazi do preraspodjele
elektrona u molekuli, kidanja hemijske veze i oslobađanja karboksilne skupine.
Dekarboksilacijom dolazi do formiranja α-ketoglutarata i oslobađanja jednog
molekula CO2.

ΔG'°=-8.4 kJ/mol

Hemijska jednačina : izocitrat + NAD+ → Oksalsukcinat + NADH + H+;

Oksalsukcinat → α-ketoglutarat + CO2
Struktura isocitrat deidrogenaze Escherichie
coli
 4. α-ketoglutarat dehidrogenaza
 Pretvaranje α-ketoglutarata u sukcinil-CoA od strane α-ketoglutarat
dehidrogenaze događa se putem oksidativne dekarboksilacije. Reakcija
predviđa dekarboksilaciju α-ketoglutarata i formiranje tioesterne veze s
koenzimom A uz konačni produkt sukcinil CoA i oslobađanje CO2.
Istovremeno dolazi do redukcije NAD + u NADH.

*α-ketoglutarat dehidrogenaza je u biti

kompleks sastavljen od tri različita
enzima. Podjedinica E1 (2-ketoglutarat
dehidrogenaza) i E2 (transsukcinilaza)
vrlo su slične podjedinicama prisutnim
u jednom drugom enzimu: piruvat
dehidrogenazi. Podjedinica E3 je pak
istovjetna podjedinici istog enzima.
Najvjerovatnije jedan enzim
evolutivno potieče od drugoga.
ΔG'°=-30.1 kJ/mol
hemijska reakcija : α-ketoglutarat + NAD+ +
CоА-SH → sukcinil CоА + CO2 + NADH + H+
Katalitičko
Katalitičko aktivno
aktivno mjesto
mjesto dihidrolipoamid
dihidrolipoamid suciniltransferaze,
suciniltransferaze,
segmenta
segmenta enzima α-ketoglutarat deihdrogenaze Escherichie coli
enzima α-ketoglutarat deihdrogenaze Escherichie coli
 5. Sukcinil CoA sintetaza
 Sukcinil CoA je tioester visoke hemijske energije (njegova ΔG°′ hidrolize je -33.5 kJ mol-1, slična onoj
ATP -30.5 kJ mol-1). Enzim sukcinil CoA sintetaza koristi ovu energiju za fosforilaciju purinskog
nukleozid difosfata kao GDP u jednoj od ključnih reakcija stvaranja hemijske energije iz Krebsovog
ciklusa. Energija prisutna u tioesteru se jednostavno pretvori u energiju u obliku fosfatnih veza koje se
kasnije koriste kao univerzalni izvor energije u gotovo svim endoergonskim metaboličkim procesima u
cijelom organizmu. U prvom koraku reakcije enzim eliminiše Koenzim A iz sukcinil CoA i nastaje
međuspoj visoke energije sukcinil fosfat. Potom dolazi do primanja fosfata od jednog
molekula histidina prisutom u aktivnom mjestu enzima koji oslobađa sukcinat kao konačni proizvod
reakcije i formiranja fosfohistidina. Fosfohistidin odmah prebacuje fosfat na GDP pretvarajući ga u GTP.
To je jedina reakcija u Krebsovom ciklusu kod koje dolazi do fosforilacije na nivou substrata.
*Organizam ne koristi direktno
GTP kao molekulu visoke
energije. Njegova je uloga u
Krebsovom ciklusu da posluži
kao međuspoj koji prebacuje
ΔG°′ = -3.3 kJ mol-1
fosfatnu grupu na ADP kako bi se
stvorio ATP. Tu reakciju
hemijska jednačina : sukcinat-CоА + Pi + GDP →
sukcinat + GTP + CоА-SH katalizira enzim nukleozid
difosfokinaza.
Struktura
Struktura sukcinil-CoA
sukcinil-CoA sintetaze
sintetaze izolirane
izolirane iz
iz svinjskog
svinjskog srčanog
srčanog
mišića
mišića
 6. Sukcinat dehidrogenaza
 Prvu reakciju oksidacije katalizuje enzimski kompleks sukcinat dehidrogenaze,
jedini enzim iz ciklusa koji ima FAD kao primatelja vodika umjesto NAD+. FAD
je kovalentno vezan za enzim, preko jednog molekula histidina. Enzim koristi
FAD kao primatelj vodika, pošto reakcija ne razvija dovoljno slobodne energije
da reducira NAD+. Enzim katalizira oksidaciju sukcinata u fumarat.
*Enzimski sustav sukcinat
dehidrogenaze je jedini iz cijelog
ciklusa koji se nalazi unutar
mitohondrijske membrane. Enzim se
nalazi u toj poziciji pošto ulazi i u
metabolički put lanca prijenosa
elektrona (u kojem nosi
naziv kompleks II). Nakon prijelaza na
ΔG'°=0 kJ/mol FAD, enzim ubacuje elektrone direktno
u lanac prijenosa elektrona, koji je prvi
hemijska jednačina : sukcinat+ FAD → fumarat + FADH2
dio oksidativne fosforilacije. To je
moguće upravo zbog stabilne veze
između enzima i samog kofaktora FAD.
Struktura enzimskog kompleksa sukcinat
dehidrogenaze i kompleksa II lanca prijenosa
elektrona Escherichia coli
 7. Fumaraza
 Enzim fumaraza dodaje fumaratu jedan proton i
jednu hidroksilnu grupu (OH-) dobijenu hidrolizom vode i
formira malat kao konačni produkt. Enzim može vezati grupu
OH- samo s jedne strane, tako da fumarat prelazi samo u L-
malat.

ΔG'°=-3.8 kJ/mol

hemijska jednačina : umarat + H2O →

malat
Struktura fumaraze kvasca Saccharomyces
cerevisiae.
 8. Malat dehidrogenaza
 Posljednja reakcija Krebsovog ciklusa predviđa oksidaciju malata u oksalacetat.
Time se oksalacetat regeneriše i ulazi u novi ciklus. Enzim malat
dehidrogenaza koji katalizira reakciju koristi još jedan molekul NAD+ kao
primatelja vodika kako bi proizveo NADH.
*Aktivnost enzima je u
potpunosti određena
potrošnjom oksalacetata od
strane citrat sintetaze (prvog
enzima u Krebsovom ciklusu)
i potrošnjom NADH od strane
lanca prijenosa elektrona.
ΔG'°=+29.7 kJ/mo Kontinuirano smanjenje
koncentracije navedenih
hemijska jednačina : spojeva tjera enzim na stalnu
malat + NAD+ → oksalacetat + NADH + H+
proizvodnju novih spojeva.
Struktura malat dehidrogenaze
bakterije Thermus flavus.
  *U završnim fazama Krebsovog ciklusa dolazi do
preraspodjele molekula s četiri atoma ugljika do ponovne
regeneracije oksalacetata. Da bi to bilo moguće, metilna
grupa prisutna na sukcinatu mora doživjeti konverziju
u karbonilnu grupu. Konverzija nastaje u tri prijelaza:
prva oksidacija, pa hidracija, potom druga oksidacija.
Navedeni prijelazi, osim što regeneriraju oksalacetat,
omogućavaju „izvlačenje“ dodatne kemijske energije
putem nastanka flavin adenin FADH2 i NADH.
 Regulacija aktivnosti Krebsovog ciklusa

 Brzina hemijskih reakcija u Krebsovom ciklusu podložna je preciznoj regulaciji, razmjerno

energetskim potrebama same stanice. Ključne tačke kontrole su alosterični enzimi, izocitrat
dehidrogenaza i α-ketoglutarat dehidrogenaza.
 Isocitrat dehidrogenazu stimuliše prisutnost ADP, koji se veže za enzim, i
povećava afinitet prema substratu. Istovremeno vezivanje substrata (isocitrata), NAD +,
Mg2+ i ADP na enzim ima potencirajući uticaj na aktivaciju, dok NADH i ATP smanjuju
aktivnost enzima, jer zauzimaju aktivno mjesto vezivanja aktivacijskih spojeva
(kompetitivna inhibicija).
 Sljedeća ključna tačka kontrole je regulacija aktivnosti α-ketoglutarat dehidrogenaze.
Enzim je inhibiran od strane sukcinil-CoA i NADH, dva konačna produkta koji nastaju
njegovom vlastitom aktivnošću. Enzim može smanjiti aktivnost, ako u stanici već postoji
obilje visokoenergetskih molekula kao ATP. Time se smanjuje efikasnost svih procesa
proizvodnje energije, među kojima Krebsov ciklus ima središnju ulogu.
 Postoje dokazi o reguliranju aktivnosti Krebsovog ciklusa i prije samog ciklusa, na nivou
prvog enzima u procesu (citrat sintetaze). Velika koncentracija ATP smanjuje afinitet
enzima prema svom osnovnom substratu acetil-CoA, smanjujući tako proizvodnju citrata.
Stoga, što je više ATP u stanici, manja količina acetil-CoA ulazi u sam Krebsov ciklus.
KRAJ.
Dizajn prezentacije:
Miladin Koćalo
Materijal za
prezentaciju : Miladin
Koćalo, Vladimir
Jevtović i Ratko Ćirović
Slike za prezentaciju :
Vladimir Jevtović i
Ratko Ćirović