Droplet digital

PCR
Giáo viên hướng dẫn : GS Khuất Hữu Thanh
Những người thực hiện:
Trần Thị Khánh Ngọc 20175006
Nguyễn Thảo Lan 20174823
Nguyễn Mai Hiền 20174668
Đoàn Thị Hạnh 20174646
Vi Thị Thanh Hà 20174602
• Cơ sở hình thành và phát triển
• Nguyên tắc
• Ưu nhược điểm
• Ứng dụng
Phần 1:
cơ sở hình thành
và phát triển
Các pha PCR

Trục tung- cường độ màu, trục hoành- chu

kỳ khuếch đại
+ ngưỡng phát hiện màu- khi nồng độ tín
hiệu huỳnh quang bắt đầu vượt qua
ngưỡng này thì máy mới phát hiện được
tín hiệu huỳnh quang
Đường chuẩn

+ Đồthị thể hiện mối quan hệ giữa

chu kì ngưỡng- trục tung với số
DNA đích ban đầu X= 10^x, x là
giá trị trên trục hoành ( mẫu ban
đầu được pha loãng với hệ số10)
+ Biết được chu kì ngưỡng suy ra
sốlượng DNA đích ban đầu
 

KẾT LUẬN
Có thể thấy real time PCR đang gặp 2 vấn đề lớn là ngưỡng phát hiện tín hiệu màu và
xác định số lượng DNA đích bằng đồ thị đường chuẩn- độ chính xác không cao
Nhưng ddPCR lại giải quyết được 2 vấn đề này:
+ Có hệ thống đầu dò nhạy hơn, chia mẫu phản ứng ban đầu thành nhiều vi giọt, và
chỉ cần 1 DNA đích trong vi giọt cũng được đầu dò thu nhận tín hiệu huỳnh quang
+ Không sử dụng đường chuẩn mà sử dụng mô hình phân phối possion để tính ra
nồng độ DNA mục tiêu ban đầu
Phần 2
Quy trình
thực hiện
Quy trình
Bước 1: Chuẩn bị phản ứng PCR

Bước 2 : Tạo vi giọt

Bước 3: Nhân bản DNA trong vi giọt

Bước 4: Đọc tín hiệu trong vi giọt

Bước 5: Phân tích dữ liệu

Chuẩn bị phản ứng PCR

Tương tự như phản ứng PCR thông thường:

- DNA khuôn
- dNTP (nucleotide tự do)
- Mồi
- Enzyme DNA polymerase
- Dung dịch đệm
- Chất phát quang hoặc mẫu dò huỳnh quang Taq man
* Bên cạnh các phản ứng cho mẫu xét nghiệm, kỹ thuật viên
thường chạy thêm các phản ứng chứng dương (chứa DNA mục
tiêu) và phản ứng chứng âm (không chứa DNA mục tiêu).
 Tạo vi giọt

- Mẫu xét nghiệm và dầu được đưa vào thiết bị

Droplet Generator. Ở đây, chúng được kết hợp
với nhau để tạo thành nhũ tương.
- Một phản ứng 20 μL ở trên sẽ được phân chia
ngẫu nhiên thành rất nhiều vi giọt có thể tích
khoảng 1 nL.
- Mỗi vi giọt này chứa đầy đủ các thành phần của
1 phản ứng PCR như trên và trở thành 1 phản
ứng tí hon. Các phân tử DNA sẽ được phân bố
ngẫu nhiên vào các vi giọt này.
Nhân bản DNA có trong giọt

- Tất cả 20.000 vi giọt được tạo ra từ 1 phản ứng ban đầu

sẽ được chuyển vào 1 giếng trong đĩa PCR 96 giếng và
được đặt vào máy PCR thông thường.
- Chương trình luân nhiệt diễn ra, DNA có trong mỗi vi giọt
sẽ được nhân bản như một phản ứng PCR thông thường. Tín
hiệu huỳnh quang tạo ra do mẫu dò hoặc chất phát quang sẽ
được tích tụ trong từng vi giọt, tùy vào số lượng DNA mục
tiêu được phân bố vào vi giọt
 Đọc tín hiệu từng vi giọt

- Sau khi phản ứng PCR kết thúc, các vi giọt sẽ

được phân tích bởi một thiết bị đọc huỳ
nh quang.
- Từng vi giọt trong mỗi ống chứa sẽ được hút vào
đường ống của thiết bị và lần lượt đi qua các đầu
đọc tín hiệu huỳ nh quang.
- Cường độ tín hiệu của mỗi màu huỳ nh quang có
trong mỗi vi giọt sẽ được đầu đọc ghi nhận lại.
 Phân tích dữ liệu

- Kết quả đọc của tất cả vi giọt được tạo ra từ từng phản ứng ban đầu sẽ được chuyển sang
phần mềm phân tích trên máy vi tính. Đối với từng phản ứng 20 μL ban đầu, kết quả được phân
tích bao gồm:
 Tổng số vi giọt (droplet) tạo ra được từ 20 μL phản ứng ban đầu, bao gồm vi giọt dương
tính và vi giọt âm tính.
 Tổng số vi giọt dương tính (chứa DNA mục tiêu và có cường độ tín hiệu huỳnh quang cao
hơn hẳn so với những vi giọt trong phản ứng chứng âm).
 Tổng số vi giọt âm tính (không chứa DNA mục tiêu và có cường độ tín hiệu huỳnh quang
ngang ngửa với những vi giọt trong phản ứng chứng âm)
Dựa vào số lượng vi giọt dương tính và tổng số vi giọt tạo ra từ mỗi phản ứng ban đầu, phần mềm
sẽ áp dụng mô hình phân phối Poisson để tính ra nồng độ DNA mục tiêu có trong 20 μL thể tích
phản ứng ban đầu.
Phần 3:
Ưu điểm
PCR vi giọt
 Ưu điểm

 Một sốưu điểm nổi bật:

- Định lượng trình tự mục tiêu hiế
m trong mẫu phức tạp
- Phát hiện sự khác nhau nhỏ trong hàm lượng – 10%
- Định lượng chính xác (chịu được ức chất ức chếPCR)
- Tối ưu hóa nhanh chóng và đơn giản
- Không cần dựng đường chuẩn
- Dung nạp các chất ức chếtốt hơn qPCR
 
 1. Định lượng trình tự mục tiêu hiếm
trong mẫu phức tạp

Kết quả ddPCR điển hình.

Đường ngưỡng có màu đỏ, dùng để phân biệt vi giọt dương tính và âm)
Định lượng trình tự mục tiêu hiếm
trong mẫu phức tạp

Kết quả định lượng DNA mục tiêu bằng phần mềm ddPCR
 
2. Phát hiện sự khác nhau nhỏ trong hàm lượng – 10%

Một phản ứng 20 μL ở trên sẽ được phân chia ngẫu nhiên thành
20.000 vi giọt có kích thước và thể tích đồng đều (khoảng 1 nL)
trong hệ thống vi kênh (microfluidics).
4. Không cần đường chuẩn

Reatime PCR cần lập đường chuẩn

- việc lập đường chuẩn gây mấ t thời gian
- Kéo theo kế t quả bị sai lệch nế u thao tác sai
 4. Không cần đường chuẩn

- các vi giọt sẽ được phân tích bởi một thiết bị đọc huỳnh
quang của hãng Bio-Rad gọi là QX200 Droplet Reader.
- Thiết bị này hoạt động theo cơ chế giống như flow
cytometer.
- Từng vi giọt trong mỗi giếng trên đĩa PCR sẽ được hút vào
đường ống của thiết bị và lần lượt đi qua các đầu đọc tín hiệu
huỳnh quang.
- Cường độ tín hiệu của mỗi màu huỳnh quang có trong mỗi vi
giọt sẽ được đầu đọc ghi nhận lại
3. Công suất trung bình – 96 phản ứng trong 1 lần chạy

- Tất cả 20.000 vi giọt được tạo ra từ 1 phản ứng ban đầu sẽ được
chuyển vào 1 giếng trong đĩa PCR 96 giếng và được đặt vào máy
PCR. Khi chương trình luân nhiệt diễn ra, DNA mục tiêu có trong
mỗi vi giọt sẽ được nhân bản như một phản ứng PCR thông thường
 Ứng dụng droplet digital PCR

- theo dõi điều trị ung thư không xâm lấn

-Phát hiện các gen mang đột biến hiếm xuất hiện ở tỷ lệ thấp trong
các mẫu khối u ung thư phức tạp hoặc mẫu liên quan đến bệnh di
truyền
-Chẩn đoán di truyền không xâm lấn dựa trên máu mẹ
-Xác định chính xác biến thể số lượng bản sao của các gen liên quan
đến bệnh lý lâm sàn
-Định lượng virus, vi khuẩn
-Nghiên cứu biểu hiện gen, đặc biệt với những mẫu khó như tế bào
đơn hã mô đúc trong
paraffin
-Định lượng các sự kiện chuyển gen có trong GMO
1. Ứng dụng kỹ thuật pcr vi giọt trong chẩn đoán di truyền
không xâm lấn dựa trên máu mẹ

- DNA của con sẽ được giải phóng từ nhau thai vào

máu của người mẹ : cff-DNA, cell free fetal DNA
- có trong mẫu máu của người mẹ cho phép tầm
soát được một số các bất thường của trẻ mà không
cần các xét nghiệm xâm lấn như chọc ối hay sinh
thiết gai nhau.-
- lượng cff-DNA thấp so với DNA của mẹ lưu hành
đòi hỏi các kỹ thuật phân tử có độ nhạy cao để
thực hiện chẩn đoán trước sinh không xâm lấn. 
 Kỹ thuật PCR vi giọt (ddPCR) phù hợp
 Quy trình xét nghiệm

- Ở người các thể lệch bội phổ biến nhất là thể tam nhiễm
( trismies) đó là
trisomies 21,18,13….

- Quy trình xét nghiệm không xâm lấn của ddPCR ( ở đây thiết
kế hai bộ mồi và đầu dò để định lượng cfDNA từ các nhiễm sắc
tố 21 và 18 và sau đó xác nhận tình trạng bệnh của một
mẫu )
- Khảo nghiệm với 60 mẫu huyết tương lâm sàng

Hệ thống ddPCR sử dụng cho

việc phát hiện là hệ thống
Raindrop ddPCR
Quy trình xét nghiệm

- cfDNA được chiết xuất từ huyết tương của mẹ (trong đó có cả

cfDNA mẹ và thai nhi), và được trộn lẫn với thuốc thử phản ứng
ddPCR. Có hai bộ mồi và đầu dò (có chứa 20 cặp mồi và một
đầu dò phổ dụng cho mỗi bộ) để nhắm mục tiêu các phân tử
DNA từ chr21 và chr18
- các giọt dạng nhũ tương được tạo ra bởi hệ thống tạo giọt
- sự khuếch đại PCR trong đó mỗi giọt là một phản ứng độc
lập. Các phân tử DNA mục tiêu từ chr21 và chr18 được khuếch
đại, dẫn đến sự phát ra các tín hiệu huỳnh quang từ các đầu dò
-các cường độ huỳnh quang FAM và VIC mỗi giọt được đọc và
phân tích để xác định số lượng các thành phần DNA mục tiêu
Quy trình xét nghiệm

-Một hỗn hợp ddPCR 30µl được chuẩn bị gồm

+ 15µl TaqMan Universal Master Mix
+ 0,75 μL, 40 mmol/L Deoxynucleotide (dNTP)
+ 1,2 μL giọt ổn định
+ Mồi 1µM/mẫu
+ Đầu dò FAM (λex 494 nm / λem 522 nm) , VIC (λex 528
nm / λem 554 nm) 0,05 μM/mẫu ( Các đầu dò phổ dụng cụ thể
cho chr21 và chr18 )
-Các mẫu được nạp vào công cụ nguồn RainDrop tạo thành giọt
nhũ tương
-Sau đó các mẫu được khuếch đại trong điều kiện:
+ 25 ° c trong 10 phút, 95 ° c trong 10 phút, 40 chu kỳ 94 ° c
cho 20 giây và 60 ° c cho 60 giây, 72 ° c trong 5 phút, 98 ° c
trong 10 phút, và cuối cùng giữ ở 12 ° c.
 Kết quả

-Mẫu mẫu sau khi phóng đại được chuyển đến bộ

phận cảm biến của thiết bị, sau đó sang máy đọc kết
quả
- Cuối cùng, dữ liệu từ các lô cụm được phân tích
bằng cách sử dụng phần mềm lưu dữ liệu của
RainDrop Analysis để điều tra số lượng, tính toàn
vẹn và các tín hiệu huỳnh quang của các giọt. Mỗi
mẫu 30 μL được nhũ hóa thành khoảng 4-5 triệu
giọt, trong đó có ít nhất 98% các giọt nguyên vẹn.
Dữ liệu từ các mẫu không đáp các tiêu chuẩn này
được coi là không hợp lệ và bị loại trừ khỏi phân
tích.
 Kết quả

-Cuối cùng hệ số R21:18 ( 21:18 là hệ số ở dưới nhá chỉnh bằng

đt nên k viết đc ) ( đây là tỷ lệ tổng số bản sao của NST 21 và
tổng số bản sao của NST 18)
Kết quả
-Theo lý thuyết R 21:18 = 1 đối với bào thai bình thường
- R 21:18 = 1,05 ( >1) khi huyết tương của mẹ chứa 10%
cffDNA từ thai nhi T21 ( trisomies 21 - thể tam nhiễm có 3 NST
thứ 21)
-( Vì ở đây số lượng các mẫu lâm sàn là tương đối nhỏ và không
có mẫu T18, nên người ta hướng tới việc mở rộng kích thước
mẫu, tăng số lượng cặp mồi....)