Ứng dụng của enzyme

pectinase

#
NỘI DUNG

A.Phân loại
B.Cơ chế tác dụng
C.Thu nhận
D.Tinh sạch
E.Ứng dụng #
 Phần 1. GIỚI THIỆU CHUNG

• Enzyme pectinase là enzyme xúc tác thủy

phân liên kết ester hoặc liên kết glucoside có
trong mạch polyme của pectin.
• Enzyme pectinase trong tự nhiên có ở thực
vật, vi sinh vật.
• Ở thực vật, sự thủy phân pectin trong tự
nhiên thường xảy ra khi trái cây chín. Vì vậy
những enzyme này có vai trò rất quan trọng
trong quá trình chín tự nhiên của trái cây
hay trong quá trình bảo quản trái cây và rau
quả.
#
 Phần 2. CƠ CHẤT PECTIN
• Nguồn gốc:
Pectin tồn tại phổ biến trong thực vật, là thành
phần tham gia xây dựng cấu trúc tế bào thực
vật.
• Ở thực vật pectin tồn tại ở các dạng: pectin hòa
tan, pectinic acid, pectic acid và protopectin.

protopectinase

#
#
 TÍNH CHẤT
CẤU TẠO PECTIN CỦA PECTIN:

• Cấu tạo phân tử pectin

là một dẫn xuất của - Tan trong nước, không
acid pectic, acid pectic tan trong ethanol.
là một polymer của acid - Có khả năng tạo gel
D-galacturonic liên kết bền. Khả năng tạo gel
với nhau bằng liên kết phụ thuộc chủ yếu vào
α1,4-glucoside. 2 yếu tố: chiều dài của
chuỗi polymer và mức
• Trọng lượng phân tử từ
độ ester hóa (methoxyl
20.000 - 200.000 đvC. hóa).
#
#
 Methyl esters of
galacturonic acid
D-galacturonic acid
#
 PECTIN
( is a polymer of D-Galacturonic acid with a
variable number of methyl ester groups)

#
 Phần 3:
ENZYME PECTINASE

#
 A. PHÂN LOẠI PECTINASE
Theo Koller và Neukoon (1966), nhóm enzyme này được phân
chia:
1.Nhóm enzyme hydrolase
Polymethylgalacturonase
Polygalacturonase (PMG)
(PG)
EC 3.2.1.15 Endo – PMG

Exo – PMG

Polygalacturonase
(PG)
Pectinesterase Endo – PG
(PE)
EC 3.1.1.11 Exo – PG #
2.Nhóm enzyme transeliminase ( TE )
( EC 4.2.99.8 )

Endo – PTE
Pectin–transeliminase
( PTE)

Exo – PTE

Polygalacturonate –
transeliminase Endo – PGTE
( PGTE)

Exo – PGTE #
 B. CƠ CHẾ TÁC DỤNG

Endo PMG

#
 SẢN XUẤT PECTINASE TỪ VI SINH VẬT

1. Ảnh hưởng của chất cảm ứng và nguồn carbon.

- Chất cảm ứng pectin (bắt buộc).
- Nguồn cacbon: polysaccharide, disaccharide, monosaccharide.
2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ:
Ví dụ:
- Đối với Asp.niger thì sử dụng muối photphat diamon để sinh
tổng hợp enzyme pectinase tốt nhất.
- Đối với Asp.awamori thì nguồn nito thuận lợi nhất là amon
sunphat.
- Khi sử dụng các nguồn nitơ tối ưu này ta nhận thấy dịch canh
trường bị acid hoá đến pH = 2,5-3,0 và có sự tích luỹ enzyme
pectinase tốt hơn.

#
 Lactose 2% + Pectin 2%
Nguồn nito (0.15%
tính theo nito) Khối Hđ P Hđ PE Hđ PMG Hđ PG
lượng sợi đvị/10ml
nấm Đơn vị/g
khô(gam)

(NH4)2HPO4 1,200 1820,7 0,491 0,560 0,885

NaNO3 0,890 880,6 0,197 0,310 0,560
NH4NO3 0,850 810,9 0,163 0,278 9,560
Pepton 1,500 1620,0 0,418 0,410 0,750
Dịch thuỷ phân 1,550 1350,0 0,340 0,450 0,800
casein
Saccharose 2% + pectin 2%
1,150 820,2 0,163 0,420 0,580
(NH4)2HPO4 0,920 590,4 0,083 0,280 0,520
NaNO3 0,890 94,8 Vết 0,060 0,320
NH4NO3 1,300 750,7 0,160 0,340 0,500
Pepton 1,450 7,003 0,120 0,370 #
0,530
Dịch thuỷ phân
 Hoạt độ pectinase đơn vị
Nguồn cacbon ở Khối lượng sợi
trong môi pH cuối nấm khô(g) Trên 100ml môi Trên 100g sợi
trường trường nấm khô

Pectin 2% 5,9 0,320 385,9 1206

Pectin 4% 6,0 0,510 640,2 1250

Lactose 2% 7,0 0,020 00 00

Lactose 4% 7,0 0,020 00 00

Saccarose 2% 4,2 0,300 65 21

Saccarose 4% 4,5 0,500 20 40

Lactose 2% + 3,0 1,120 1894,2 1600

Pectin 2%

Saccarose 2% + 3,5 1,125 864,3 #

690
Pectin 2%
 NUÔI CẤY VÀ PHÂN LẬP Asp.Niger

• Lấy mẫu từ cơm nguội, bánh mì để khô ít ngày

nghiền mẫu, hòa tan mẫu bằng nước cất vô trùng
pha loãng mẫu.
• Môi trường nuôi cấy:
 1 %.............. Pectin
 0.3 % ………Diammoniumorthophosphate
 0.2 % ………KH2PO4
 0.3 % ………K2HPO4
 0.01 % ……..MgSO4
 2.5 % ………Agar
 pH~4.5
#
• Hấp khử trùng môi trường rồi đổ vào đĩa petri

• Lấy mẫu cho vào đĩa petri  cấy trang đều

lên mặt thạch  tạo khuẩn lạc riêng rẽ  cấy
ria vài lần để tìm ra các chủng thuần chủng 
kiểm tra độ tinh khiết của giống giữ giống
Asp.niger trong môi trường Czapek

#
 C. THU NHẬN ENZYME PECTINASE

Hiện nay người ta thu nhận pectinase chủ yếu

từ VSV. Có 2 phương pháp sản xuất pectinase:

• 1.Thu nhận • 2.Thu nhận

chế phẩm chế phẩm
enzyme enzyme
pectinase pectinase
theo phương theo phương
pháp bề mặt pháp bề sâu

#
 NGUYÊN LIỆU THU NHẬN ENZYME PECTINASE

• Nấm mốc Asp.niger được giữ giống trên môi trường

Czapek.
• Chuẩn bị bột cà rốt: cà rốt xay nhuyễn, sấy ở nhiệt độ
60oC cho đến khi độ ẩm cà rốt đạt 4% (nguồn pectin –
chất cảm ứng)
• Thành phần môi trường nuôi cấy thu nhận enzyme
pectinase gồm:
Cám gạo 65,5%
Trấu 21,5%
Bột cà rốt 11%
(NH4)2SO4 2%
Độ ẩm 55%.
• Khử trùng 121oC trong 30' nuôi cấy theo phương
pháp bề mặt. #
 XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME PECTINASE

Enzyme pectinase thô được xác định hoạt

độ bằng phương pháp đo độ nhớt với nhớt
kế Borosil: hút 2ml dung dịch enzyme thô
5% (w/v) phản ứng với 18ml dung dịch
pectin 1% ở pH 4,5 và nhiệt độ 40oC.

#
 HÀM LƯỢNG PROTEIN CỦA CHẾ PHẨM
ENZYME ĐƯỢC XÁC ĐỊNH BẰNG
PHƯƠNG PHÁP LOWRY
• Dựa vào mức độ hấp thụ quang học của protein
chuẩn, ta có thể xác định được hàm lượng protein
trong mẫu nghiên cứu.

#
 PHÂN TÍCH CHẾ PHẨM ENZYME BẰNG
PHUONG PHÁP LỌC GEL QUA Bio Gel P 30

• Hòa tan chế phẩm enzyme thô trong đệm Mc

Ilvaine pH 4,5 ly tâm bỏ cặn thu được dung dịch
enzyme sau đó hút 0,5ml cho chạy qua cột Bio
Gel P 30 (0,8 x 30cm) (hãng Biorad – Mỹ) được
cân bằng với đệm Mc Ilvaine pH 4,5.
• Tốc độ chảy qua cột lần lượt là 30ml/giờ
và15ml/giờ. Mỗi phân đoạn thu 2ml và 1,5ml.
• Đo độ hấp thu của từng phân đoạn ở bước
sóng280nm. Vẽ đồ thị ghi nhận các peak tạo
thành và xác định hiệu suất thu hồi enzyme và
hoạt độ tính tương ứng.
#
TINH SẠCH ENZYME PECTINASE BẰNG PHƯƠNG
PHÁP LỌC MÀNG (cross flow membrane)

• Tiến hành tủa enzyme từ 500ml dịch chiết thu được bởi
ethanol 96o, nhiệt độ tủa 4oC, thời gian tủa là 1 giờ.
• Sau đó, ly tâm 5000 vòng/phút trong 15 phút thu enzyme
thô. Hòa tan enzyme thô này trong 500ml dung dịch đệm
Mc Ilvaine pH 4,5.
• Tiến hành lọc 500ml dung dịch enzyme vừa hòa tan trên
bằng hệ thống lọc QuixStand Benchtop Systems (hãng
Amersham Biosciences) với bộ lọc màng (membrane) có
khoảng phân đoạn 50kDa.
• Tốc độ bơm mẫu đầu vào lần lượt là 150rpm & 200rpm và
điều chỉnh sao cho áp suất trên bề mặt màng không quá 5
Psi. Thu dịch qua lọc và xác định hiệu suất thu hồi enzyme
và hoạt độ tương ứng.

#
 KẾT QUẢ
• Hoạt độ chung và hoạt độ riêng của chế phẩm pectinase thô (CP E)

• Đồ thị tương quan giữa thời gian nuôi cấy và hoạt độ của enzyme thô

Quá trình sinh tổng hợp pectinase trên môi trường có chất cảm ứng là
pectin của bột cà rốt bởi chủng Aspergillus niger có hoạt độ cao nhất sau
48 giờ (30,01UI/g CP E). #
Đồ thị tương quan giữa thời gian nuôi cấy và
hoạt độ riêng của chế phẩm enzyme thô

#
• Quá trình sinh tổng hợp pectinase trên môi
trường có chất cảm ứng của chủng Asp.niger có
hoạt độ riêng cao nhất sau 72 giờ đạt 8,97.10-2
(UI/mg protein).

• Dựa vào 2 đồ thị ta thấy, hoạt độ chung giữa thời

gian nuôi cấy 48 giờ và 72 giờ chênh lệch nhau
khá nhiều (30,01 & 25,02UI/g CP E). Trong khi
đó, hoạt độ riêng giữa thời gian nuôi cấy 48
giờ và 72 giờ chênh lệch nhau không nhiều
(8,26.10-2 & 8,97.10-2 UI/mg protein).
• Do đó, thu nhận enzyme pectinase sau 48 giờ
nuôi cấy và sau đó đem tiến hành tinh sạch.
#
 Phân tích chế phẩm enzyme pectinase bằng phương pháp lọc gel
Bio Gel P 30
• Dung dịch enzyme xử lý
theo phương pháp lọc gel
Bio Gel P 30 như trên, kết
quả sau khi lọc gel với tốc
độ chảy qua cột 30ml/giờ
thu được 2 peak chính.
• Trong đó, hoạt độ
pectinase tập trung chủ
yếu ở peak I, peak II không
có hoạt độ.
• Hiệu suất thu hồi enzyme
đạt 71,96% và hoạt độ cao
hơn 1,1 lần so với trước
khi lọc gel.
tốc độ: 30ml/giờ

#
• Khi giảm tốc độ chảy
qua cột xuống
15ml/giờ kết quả thu
được 4 peak. Hoạt độ
pectinase tập trung
hầu hết ở peak I.
• Hiệu suất thu nhận
enzyme sau khi giảm
tốc độ lọc đạt
59,02% và hoạt độ
cao hơn trước khi lọc
gel 1,65 lần.

tốc độ: 15ml/giờ

#
 a-tốc độ: 30ml/giờ b-tốc độ: 15ml/giờ

Đồ thị tương quan giữa giá trị OD 280nm

với các phân đoạn của dung dịch enzyme sau khi lọc gel

#
• Khi giảm tốc độ chảy xuống 15ml/h thì các phân
tử protein nằm trong hạt gel bị rửa giải chậm hơn.
Khi đó, các phân tử khác không nằm trong hạt gel
sẽ bị rửa giải ra khỏi cột nhanh hơn và dẫn đến
hàm lượng protein có hoạt độ pectinase tăng.
• Hiệu suất thu hồi enzyme khi lọc với tốc độ
15ml/giờ thấp hơn hiệu suất thu hồi enzyme qua
lọc với tốc độ 30ml/giờ do khả năng tách protein
tạp khi lọc với tốc độ thấp thì tốt hơn.

#
 D. TINH SẠCH CHẾ PHẨM ENZYME
PECTINASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP LỌC MÀNG
• Sử dụng bộ lọc membrane có kích thước phân đoạn
rộng 50kDa cho kết quả như sau:

• Sau khi lọc dung dịch enzyme, kết quả thu được khi
lọc với tốc độ bơm 150rpm thu dịch qua lọc. Kết quả
thu được:
 hiệu suất thu hồi enzyme 27,87%
 hoạt độ đạt 87,98%
 độ tinh sạch tăng 3,1 lần
• Khi tăng tốc độ bơm lên 200rpm:
 hiệu suất thu hồi enzyme 33,33%
 hoạt độ đạt 73,65%
 độ tinh sạch chỉ tăng 2,2 lần
#
 Nguyên nhân:
 Khi tăng tốc độ bơm 200 rmp thì áp suất đầu vào
tăng (5,2Psi) làm cho dòng chảy trong bộ lọc chuyển
động rối, các phân tử sẽ va đập mạnh vào nhau và
đẩy chúng vào thành bộ lọc kết quả hình thành một
màng mỏng xung quanh thành bộ lọc (hay còn gọi là
lớp trở lực).

 Mặt khác dưới tác dụng của lực ly tâm trong dòng
chảy sẽ đẩy một số phân tử trong màng mỏng theo
dịch qua lọc ra phía ngoài. Vì thế, chúng tôi nhận
thấy với tốc độ bơm đầu vào 150rpm sẽ thực hiện
quá trình tinh sạch tốt hơn.

#
So sánh hoạt độ riêng của dung dịch enzyme
trước và sau khi lọc màng

#
 KẾT LUẬN
• Chế phẩm enzyme pectinase được sản xuất từ
chủng nấm mốc Asp.niger trên môi trường có
chứa chất cảm ứng là pectin-bột cà rốt bằng
phương pháp nuôi cấy bề mặt sau 48h đạt
hoạt độ chung cao nhất 30,01(UI/g).

#
• Phân tích chế phẩm enzyme bằng phương pháp
lọc gel sử dụng cột Bio Gel P 30 (0,8 x 30cm) thu
được một phân đoạn có hoạt độ enzyme pectinase
và với tốc độ chảy qua cột15ml/giờ tách tạp chất
tốt hơn ở 30 ml/giờ.
• Phương pháp lọc màng với tốc độ bơm
150rpm có thể ứng dụng tinh sạch enzyme
pectinase thu nhận từ Asp. niger nói riêng và
enzyme nói chung với kỹ thuật đơn giản và hiệu
quả.
#
 E. ỨNG DỤNG PECTINASE

1. Trong sản xuất nước quả ép và sản xuất

rượu vang nho.
2. Xử lý tế bào thực vật để tạo tế bào trần.

#
 TRONG SẢN XUẤT NƯỚC QUẢ ÉP VÀ SẢN
XUẤT RƯỢU VANG NHO.

 Tác dụng của pectinase là:

- Làm tăng hiệu suất chiết rút dịch quả.
- Làm trong dịch quả, làm giảm độ nhớt của
dịch quả giúp quá trình lọc được tốt hơn.

#
 SO SÁNH BỔ SUNG PECTINASE VÀ KHÔNG BỔ SUNG
PECTINASE TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT NƯỚC QUẢ ÉP

Bổ sung pectinase Không bổ sung pectinase

 Hiệu suất thu dịch ép  Hiệu suất thấp hơn.

cao hơn ( tăng 14-30%).
 Độ nhớt của dịch quả  Độ nhớt dịch quả cao.
giảm mạnh.
 Quá trình lọc tốt và  Quá trình lọc kém và lâu
nhanh hơn. hơn.
 Tăng nhanh quá trình  Quá trình làm trong dịch
làm trong dịch quả. quả mất nhiều thời gian.
#
 QUY TRÌNH SẢN XUẤT
NƯỚC NHO ĐỎ
Làm
Rửa Gia nhiệt
Nho lạnh
sạch ( 85- 90 0 C) nhanh

Bổ sung
pectinase
0,03 %
Thanh
trùng
Ép và lọc

Đóng Bổ sung
Lọc pectinase Dịch
chai lọc#
0,03%
 CHÚ THÍCH QUY TRÌNH

• Nho, chọn loại nho có độ chín thích hợp.

• Rửa nho nhiều lần bằng nuớc sạch, nhằm loại bỏ
vsv, tạp chất...
• Cho nho vào thùng và gia nhiệt, nhiệt độ được
tăng lên 85- 90 0C trong thiết bị gia nhiệt và thời
gian từ 5 đến 20 phút tuỳ thuộc vào độ chín của
nho.
• Sau đó nho được làm lạnh nhanh và giữ ở nhiệt
độ 45- 500C trong 3-4h trong thùng kín.
• Bổ sung pectinase với liều lượng 0,03%, mục đích
để thuỷ phân các liên kết pectin trong tế bào để
có thể thu được dịch chiết nhiều hơn, làm tăng
dịch chiết lên 15 – 30%. #
• Sau đó ta tiến hành ép rồi thu dịch lọc, dịch lọc
được bổ sung thêm 0,03 % pectinase.( mục đích
để phân cắt các phân tử pectin, làm giảm độ
nhớt của dung dịch và giúp cho quá trình lọc tốt
hơn).
• Thời gian làm trong dịch quả có thể từ 4 – 6h.
• Nếu thời gian xử lý enzyme lâu quá thì nuớc
nho sẽ trở thành nuớc nho trắng và không còn
độ đục.
• Sau đó nước quả được lọc và rót vào chai đem
thanh trùng.
#
 QUY TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU VANG
Bổ sung
Dịch ép pectinase
Nho Rửa 0,03 %
sạch
Dịch
̣ tự
chảy

Thu dịch

Kết tủa ở Điều

t0 lạnh Lên chỉnh pH
(100C) men và nồng
đô ̣ đường. #
 NHỮNG YÊU CẦU ĐỐI VỚI CHẾ PHẨM PECTINASE
DÙNG TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG

• Chế phẩm không được làm giảm chất lượng

của vang, không được ảnh hưởng xấu đến
hương vị và màu sắc -> phải tinh sạch
pectinase
• Trong sản xuất vang nho, giữa hàm lượng
enzyme Cx và endo PMG phải có tương
quan nhất định.

#
• Khi chế phẩm có hoạt độ endo PMG là
28,2x102 đơn vị /mg protein và hoạt độ của
enzyme Cx là 28,7 đơn vị/mg protein thì quá
trình làm trong xảy ra nhanh hơn khi hoạt độ
endo-PMG là 25,4x102 đơn vị /mg protein và
hoạt độ của enzyme Cx là 55,0 đơn vị/mg
protein
• Chế phẩm pectinase cũng phải tăng độ ổn
định của vang nghĩa là phải chứa proteinase
với hoạt độ không thấp hơn 120 đơn vị/g theo
globulin và 140 đơn vị/g theo anbumin.
#
• Hoạt độ các enzyme oxy hóa trong chế
phẩm không quá 0,1 đơn vị/mg acid
ascocbic/1 phút/ 1g chế phẩm -> tránh tổn
thất các chất màu của vang đỏ và tránh xuất
hiện màu tối trong vang trắng

#
• Chế phẩm pectinase phải bảo toàn hoạt độ
trong điều kiện có chứa rượu( 10-12%) và
phải tác dụng có hiệu quả trong điệu kiện
pH nhất định.
• Vd: trong sản xuất vang nho khi sử dụng
chế phẩm pectawamorin BM10x, người ta có
thể tăng hiệu suất dịch tự chảy lên 32%

#
Baûng 11:Toác ñoä eùp cuûa baõ nghieàn nho khi söû duïng pectinol

Theå tích dòch thu ñöôïc

Thôøi gian eùp Khi coù xöû lyù
Khoâng xöû lyù
baèng enzym
400 675
30 giaây ñaàu
100 225
30 giaây thöù 2
90 215
Phuùt thöù 2
90 205
Phuùt thöù 3
80 110
Phuùt thöù 4
60 110
Phuùt thöù 5
50 110
Phuùt thöù 6
50 110
Phuùt thöù 7
50 100
Phuùt thöù 8
50 100
Phuùt thöù 9
40 90
Phuùt thöù 10
1060 2050 #
 TRONG XỬ LÝ TẾ BÀO TẠO TẾ BÀO TRẦN

 Mục đích dùng enzyme trong xử lý tế bào tạo tế bào trần, đó là

bảo toàn hoạt tính sinh học của tế bào và nâng cao hiệu xuất
thu được tế bào trần.
 Ưu điểm: cách thực hiện đơn giản, tế bào không bị mất hoạt
tính khi xử lý bằng enzyme.
 Nếu tạo tế bào trần bằng phương pháp cơ học và hoá học thì
hiệu suất thu được tế bào thấp, các thành phần trong tế bào dễ
bị ảnh hưởng bởi lực cơ học và hoá học và dẫn đến mất hoạt
tính sinh học.

#
Quy trình tạo tế bào trần từ dịch huyền
phù tế bào

Huyền phù tb Ly tâm Thu cặn

( 5ml ) (100 vòng/p)

Tế bào trần Rửa cặn trong

môi trường
MS
Lắc( 75
vòng/ph)

Bổ sung 5ml hỗ hợp

ủ pectinase(0,5- 2%) và
Ly tâm lại
Thu cặn
2 – 6h cellulose( 14%) #
#