Fluorescencija i

spektrofluorimetrija
 Emisija energije pri “povratku” elektrona iz
pobuđenog u osnovno stanje zove se luminiscencija

• Emisija pri “povratku” elektrona iz pobuđenog singlet

stanja u osnovno stanje je fluorescencija.
• Emisija pri “povratku” elektrona iz triplet stanja u
osnovno stanje je fosforescencija.
• Ovisno o vrsti energije koja je dovela do pobuđivanja
postoje:
– Fotoluminiscencija
– Hemiluminiscencija
– Tribuluminiscencija
– Elektroluminiscencija
– Bioluminiscencija
 Dužina trajanja fluorescencije i fosforescencije

• Elektron iz osnovnog u pobuđeno stanje

prelazi za oko 10-15 sekundi. Zbog ovako
kratkog vremena ne dolazi do promjena u
geometriji nukleusa (Franck-Condon-ov
princip).
• Pri fluorescenciji, elektron u pobuđenom
stanju boravi oko 10 ns.
• Fosforescencija može trajati nekoliko
milisekundi do nekoliko sekundi, pa i više.
• Fenomen fluorescencije je
prvi uočio Sir John Friedrich
William Herchel promatrajući
vodenu otopinu kinina.

• Osnovne teorije u
spektrofluorimetriji je dao
Alexander Jablonski.
Jablonski dijagram
• Maksimum emisije je u pravilu na višim valnim
dužinama od maksimuma apsorpcije (Stockesov
pomak).
• Emisioni spektar je obično lik u ogledalu
apsorpcionog spektra.
• Razlike energije u vibracionim nivoima se jasno
vide na emisionom spektru perilena i antracena.
• Bez obzira koja je valna dužina ekscitacije,
emisioni spektar ima isti izgled.
 Izuzeci od pravila
• U ekscitacionom spektru kinina prvi maksimum
potječe od prelaska elektrona na drugo pobuđeno
stanje. Elektron se obično vraća sa drugog na prvo
pobuđeno stanje za 10-12 sekundi.
• Prilikom prelaska u pobuđeno stanje može doći do
promjene u strukturi molekule, kao što je slučaj sa 1-
hidroksipiren-3,6,8-trisulfonatom. U pobuđenom
stanju molekula je kiselija, pKa fenolske skupine je
manji i dolazi do njene disocijacije.
• Vrlo rijetko, elektron može preći sa drugog pobuđenog
stanja u osnovno stanje.
Ekscitacioni i emisioni spektar kinina
• Poliaromatski spojevi u pobuđenom stanju prenose naelektrisanje na
aromatske amine, ukoliko su prisutni, pri čemu nastaju tzv.
ekscipleksi, tj. kompleksi u pobuđenom stanju.
• Neki spojevi u pobuđenom stanju mogu dati dimere koji
se zovu ekscimeri. Prisustvo ekscimera raste s porastom
koncentracije.
Utjecaj strukture molekule na sposobnost
fluorescencije nije posve razjašnjen.
• Slično kromofornim grupama koje su
odgovorne za apsorpciju svjetla, postoje i
fluoroforne grupe odgovorne za fluorescenciju.
• Primjena fluorescencije se ograničava na
spojeve sa  elektronima.
• Auksofluori su obično elektron-donorske
skupine sa o-i p-direkscionim utjecajem (amino,
metil, metoksi, alkilamino, hidroksi..)
• Planarna, rigidna struktura molekule doprinosi pojavi
fluorescencije.
• Kao diminofluori djeluju grupe sa m-direkcionim
utjecajem koje imaju tendenciju lokalizacije  elektrona
(karboksi, nitro, cijano, aldehidna grupa..).
• Povećana brzina unutrašnje konverzije dovodi do
smanjenja fluorescencije.
• Kompleksi sa lantanidima imaju fluorescenciju koja može
trajati nekoliko sekundi.
• Teški atomi, poput joda dovode do perturbacije
molekulskih orbitala i favoriziraju prelazak u triplet stanje.
• Metali se mogu prevesti u fluorescentne komplekse sa
raznim ligandima, np. 8-hidroksikinolinom.
Utjecaj joda na intenzitet fluorescencije
 Gašenje fluorescencije (quenching)
• Koliziono (dinamičko) gašenje nastaje sudarom
molekule u pobuđenom stanju sa drugim
česticama.
• Kolizioni gasioci mogu biti različiti:
– Kisik
– Halogenidi
– Amini
– Molekule siromašne elektronima (np. akrilamid)
• Povećanjem temperature za 1 oC intenzitet
fluorescencije se smanjuje za 1%
Pojednostavljen Jablonski dijagram
kolizionog gašenja
 Rezonantni prenos energije
• Dešava se kad se emisioni spektar fluorofora
(donor) prekriva sa apsorpcionim spektrom
neke druge supstance (akceptor).
• Statičko gašenje fluorescencije nastaje
formiranjem kompleksa između gasioca i
potencijalno fluorescentne molekule u
osnovnom stanju.
 Utjecaj rastvarača
• Mogućnost stvaranja hidrogenovih veza,
dipol-dipol interakcije, prisustvo nečistoća.
• Povećanjem viskoznosti povećava se intenzitet
fluorescencije.
• Rayleigh-evo rasipanje
• Ramanovo rasipanje
 Rayleigh-evo rasipanje
• Rayleigh-evo rasipanje je pojava re-emisije
svjetlosti koju izaziva otapalo.
• Dešava se na istoj valnoj dužini na kojoj se
dešava i ekscitacija.
• Ukoliko se prati emisija na valnoj dužini bliskoj
dužini ekscitacije, moguć je značajan utjecaj
Rayeligh-evog rasipanja.
 Ramanovo rasipanje
• Fizičko porijeklo Ramanovog rasipanja leži u ne-
elastičnom sudaru fotona i molekule.
• U ovom sudaru dolazi do izmjene energije između
molekule i fotona. Obzirom na zakon o očuvanju
energije, istu količinu energije koju izgubi foton
primi molekula i obratno.
• Energija koju molekula primi ne ovisi o energiji
fotona, nego o energetskim razlikama između
vibracionih nivoa. To znači da je energija
Ramanovog rasipanja karakteristična za svaku
supstancu i ne ovisi o energiji zračenja.
Signali u emisionom spektru
Položaji Ramanove trake, računati za valne dužine
živine lampe i neke od najvažnijih otapala
 Odnos između intenziteta
fluorescencije i koncentracije
• U svakoj točki otopine intenzitet fluorescencije je
različit, zbog toga što se dio zračenja ekscitacije
apsorbira prije nego dostigne molekulu, a dio
zračenja emisije se isto apsorbira prije nego
napusti otopinu.
• Ovo je fenomen postojanja prefiltera i
unutrašnjeg filtera.
• Općenito ukupna fluorescencija koja dospije do
detektora je zbir pojedinačnih fluroescencija
malih zapremina otopine uzorka.
 Kvantni prinos fluorescencije 
•  je odnos između broja emitiranih fotona i
broja apsorbiranih fotona.
• Prema Lambert-Beerovom zakonu A=log I0/I
pa je:

Za jako razblažene
otopine vrijedi:
Za apsorbancu manju od 0,01 vrijedi
F = 2,303kI0lC
Ako se svi utjecaji ovisni od eksperimentalnih
uvjeta i vrste supstance predstave kao
konstanta, onda vrijedi:
F = KI0C

U slučaju visokih koncentracija,

intenzitet fluorescencije ne ovisi
više o koncentraciji i jednačina
poprima oblik F = kI0
Konstrukcija instrumenta