Univerzitet u Tuzli

Medicinski fakultet
Odsjek zdravstvenih studija
Studij medicinsko laboratorijske dijagnostike

FLUORESCENTNA IN SITU
HIBRIDIZACIJA
FISH

Profesor: Radile:
doc.dr. Jasminka Mustedanagić Mujanović Kerošević Tina
Krezić Semra
 Fluorescentna in situ hibridizacija – FISH

 FISH se temelji na hibridizaciji komplementarnih sekvenci

nukleinskih kiselina . Podrazumijeva upotrebu
fluorohromom obilježenih DNK proba (sondi) u detekciji
ciljanih komplementarnih, jednolančanih DNK sekvenci na
hromosomu, in situ.
Fluorescencija fluorohroma se posmatra na fluorescentnom
mikroskopu.
 FISH metoda omogućava simultanu molekularnu i
citogenetičku opservaciju metafaznih hromosoma, a može
se primjeniti i na interfaznim ćelijama, u slučaju kada ćelije
nisu proliferaitivno aktivne, kada se ne mogu dobiti
metafazni hromosomi ili je potreban brza dijagnostika.
 FISH metoda je veoma sezitivna, specifična i pouzdana.
Omogućava identifikaciju pojedinih hromosomskih regija,
ovisno o upotrebeljenoj DNK sondi, dok se istovremeno ne
mogu dobiti podaci o ostalim dijelovima genoma.
 Omogućava detekciju numeričkih i strukturnih aberacija,
simultanu detekciju različitih DNK sekvenci od interesa na
istom preparatu (primjenom različitih sondi), a najčešće se
primjenjuje za karakterizaciju rearanžmana, marker
hromosoma, mikrodelecija, duplikacija i strukturnih
rearanžmana koje se ne mogu uočiti na svjetlosnom
mikroskopu.
Tipovi proba za FISH analizu
ALFA SATELITNE PROBE

Postoje četiri glava tipa FISH proba, koje se uobicajeno koriste kliničkim studijama.
Alfa satelitne probe (engl. chromosome enumeration probes - CEP) sadrže repetitivne
DNK sekvence ( ne kodiraju genske produkte i veoma su polimorfne) koje karakterišu
alfa satelitne centromerne regione hromosoma. Alfa satelitna DNK je monomer od 171
pb koji se tandemski ponavlja nekoliko puta. Glavnina alfa satelitne DNK je identicna za
sve humane hromosome , ali variranje od 2-3% omogućava razlikovanje centromera
pojedinih hromosoma i kreiranje proba za pojedine hromosomske parove. Ove probe su
hromosom-specifične, s tim što hromosomi 13 i 21 dijele istu sekvencu kao i hromosomi
14 i 22. Alfa satelitne probe daju jasne signale i posebno su korisne za numeričku analizu
hromosoma u interfaznim jedrima i za identifikaciju maker hromosoma u metafaznim
ćelijama. S obzirom na to da su sekvence između hromosoma veoma slične, hibridizacija
sa srodnim ili sličnim sekvencama može biti problem. Dostupne su i centromerne probe
koje sadrže zajedničku sekvencu alfa satelitnih regiona svih hromosoma, te obilježavaju
centromere svih prisutnih hromosoma. Upotreba ovih proba je korisna u detekciji
eventualno prisutnih hormosoma u mikronukleusima, ekstranuklearnim formacijama
genetičkog materijala.
TELOMERNE PROBE

Telomerne probe sadrže repetitivne DNK sekvence u

subtelomernim regionima hromosoma. Ove probe su
hromosom-specifične, i specifične za p ili q krak
hromosoma.
Telomerne probe se koriste za identifikaciju kriptičnih
telomernih delecija i rearanžmana.
Dostupne su i takve telomerne probe koje sadrze
zajedničke sekvence telomernih regiona svih
hromosoma, sto rezultira fluoresencijom telomera na oba
hromosomska kraka svih hromosoma.
LOKUS-SPECIFIČNE PROBE - (engl. locus-specific - LSI)

Optimalna veličina probe je oko 5kb, dok probe manje od 1,5 kb

nisu sasvim pouzdane jer ponekad ne daju signal. LSI probe su
posebno korisne u detekciji nekih mikrodelecija kao što su 22q11.2
u DiGeorge sindromu , 7q11.23 u Williams sindromu, 15q11-q13 u
Prader-Willi/Angelman sindromu , kao i za detekciju onkogena.
Probe za detekciju mikrodelecija se kombinuju sa kontrolnom
probom koja je obilježena drugim fluorohromom, sto omogućava
razlikovanje delecije od izostanaka hibridizacije.
Lokus-specifične probe se sve češče upotrebljavaju i za detekciju
kriptičnih rearanžmana u uzorcima pacijenata oboljelih od
leukemije.
Ove probe se koriste i za brzu detekciju trisomija kritičnih regiona u
nekultiviranim amniocitima.
PROBE ZA CIJELE HROMSOME (engl. whole chromosome pait
probe-WCP)

 Probe za cijele hromosome specifično boje kompletan

metafazni hromosom (svaki par drugom bojom)
Koriste se za detekciju kriptičnih translokacija, kao i za
identifikaciju porijekla hromosomskog materijala u
hromosomskim rearanžmanima i marker hromosomima.
Ove probe su bazirane na detekciji hromosom-specifičnih
sekvenci.
Primjeri FISH proba
Osnovni postupci u FISH proceduri
PRIPREMA PREPARATA

 Preparati za FISH se obično pripremaju slično kao i za

rutinsku citogenetičku analizu. Međutim, FISH je moguće
primjeniti i na preparatima formaliziranih tkiva,
razmazima krvi ili koštane srži, i nekultiviranim, fiksiranim
ćelijama. Preparati se najprije tretiraju rastvorom proteaze
kako bi ćelije bile prijemčivije za probu. Ovo se posebno
odnosi na nekultivirane ćelije i/ili ćelije bogate citoplazom.
Utvrđeno je da je hibridizacija efikasnija na starijim
preparatima, ili preparatima koji su tretirani rastvorom
soli natriji citrata na 37 °C u trajanju od 30 minuta.
Dehidratacija preparata se zatim postiže serijom ispiranja u
etanolu.
Denaturacija i i hibridizacija probe i ciljane DNK

 Da bi došlo do hibridizacije, proba i ciljana DNK moraju

biti jednolančane. DNK proba se postavlja na preparat sa
ciljanom DNK i denaturacija se odvija istovremeno,
zagrijavanjem preparata na 95-100°C.
Alternativno, proba i ciljana DNK se odvojeno tretiraju
rastvorima formamida ili soli, što omogućava denaturaciju
na nižoj temperaturi i bolje očuvanje strukture hromosoma.
Komercijalne probe su ponekad jednolančane pa ni ne
zahtjevaju denaturaciju. Nakon denaturacije, proba i ciljana
DNK hibridiziraju obicno na temperaturi od 37°C.
Posthibridizacijsko ispiranje

Tokom hibridizacije proba će se vezati za ciljanu DNK, ali će

se nekoliko kopija probe nespecifično vezati za DNK u uzorku
(fenomen poznat kao pozadinska hibridizacija; engl.
backgroun hybridization), sto bi pri mikroskopskoj opservaciji
rezultiralo uočavanjem velikog broja nesepecifičnih signala
hibridizacije i nemogućnošću uočavanja i razlikovanja
specifičnog signala. Ovaj problem se prevazilazi ispiranjem
preparata nakon hibridizacije, specifičnom otopinom (npr.
natrij citrat) koja razara nespecifične veze DNK probe, dok
specifično vezana DNK proba ostaje intaktna.
Detekecija

Indirektna detekcija podrazumjeva vezanje probe sa biotinom ,

digoksigeninom , dinitrofenolom ili nekom drugom molekulom koja ne
fluorescira, a potom se detektuje antitijelima (avidinom ili
streptavidinom ) obilježenim fluorohrom.
Direktan metoda podrazumjeva vezanje probe direktno za fluorohrom te
se , nakon in situ hibridizacije, ona vizualizira bez primjene dodatnih
procedura. U mnogim slučajevima primjena direktnog detekcijskog
sistema daje slabiji intenzitet fluorescentnog signala od indirektnog , te
se u analizi veoma malih proba preferira i indirektno obilježavanje.
Da bi se ustanovila relativna pozicija probe potrebno je hromosome ili
jedra prethodno kontrastno obojiti. Najčešče su u upotrebi plavi DAPI
(diamidino- 2- fenilindol) kontrast i propidium jodid koji je crven.
Upotreba kontrasta zavisi od korištenog fluorohroma za obilježavanje
probe; npr, ako je proba obilježena crvenim fluohromom, onda
propidium jodid nije odgovarajuća kontrastna boja.
Princip direktnog i indirektnog obilježavanja komplementarne
probe
Za vizualizaciju proba koristi se epifluorescentni mikroskop sa filterima za
FISH analizu živinim transformatorom koji obezbjeđuje ultravioletno
svijetlo. Različiti fluorohromi imaju različitu eksitacijsku talasnu dužinu, pa
su potrebni različiti filteri za njihovu opservaciju.
Signal koji emituje fluorohrom je različite talasne dužine u odnosu na onu
koju emituje ekscitirajuća svjetlost, pa je potreban dodatni set filtera koji će
blokirati ekscitirajuću svjetlost i omogućiti posmatranje samosignala koji
potiče fluorohroma.
Uporteba filterskih kompleta omogućava simultanu detekciju više
fluorohroma kada je potrebno posmatrati više proba u detekciji
hromosomskih rearanžmana.
Fluorohromi vremenom i nakon izloženosti svjetlu blijede, zato je potrebno
napraviti trajne digitalne fotografije provedene FISH analize (upotrebom
digitalne kamere povezene sa mikroskopom i primjenom odgovarajućih
računarskih programa).
Analiza

FISH analiza podrazumijeva opservaciju fluorescentni signala na metafaznim

hromosima ili u interfaznim nukleusima. Interpretacija rezultata zavisi od
upotrijebljene probe, prisustva ili odsustva signala, odnosno pozicije prisutnog
signala. S obzirom na to da hibridizacija nije uvijek savršena u svim ćelijama,
ponekad je potrebno posmatrati više ćelija da bi se formulisao konačan zaključak.
Ovo je pposebno, zbog trodimenzionalnog efekta, slučaj sa FISH analizom u
interfaznim jedrima. Osim toga, ponekad se signali više proba mogu detektovati
suviše blizu jedan drugoga kada se to i ne očekuje, ili se čak signali mogu međusobno
prepoklapati pa se uočava jedan signal kada su, ustvari, prisutna dva.
S druge strane, ponekad je prisutno i razdvajanje signala pa se uočavaju dva signala
umjesto jednog.
Prilikom interpretacije rezultata analize i formulisanju konačnog zaključka treba biti
posebno oprezan pri detekciji aneuploidije, dok je teško ili gotovo nemoguće utvrditi
mozaične aneuplodije u interfaznim ćelijama.
Zbog navedenog, neophodno je da svaka laboratorija koja prakticira FISH analizu
definiše normalan raspon observiranih signala za svaku korištenu probu u
normalnim ćelijama, kako bi se mogla uočiti abnormalna hibridizacija.
FISH nomenklatura

Kao i za rutinske citogenetičke analize, utemeljen je

međunarodni sistem opisa rezultata provedene FISH
analize-International System of Human
Chromosome Nomenclature. On podrazumijeva
upotrebu simbola i skraćenica u pružanju informacija
o tipu korištene probe, lokaciju i dobijenim
rezultatima FISH analize. Ove podatke je moguće
kombinovati sa podascima dobijenim
konvencionalnim citogenetičkim metodama, pri
čemu se oni razdvajaju tačkom (.), s tim da se prvo
navedu rezultati konvencionalne citogenetike.
Primjeri nekih najčešće korištenih simbola i skraćenica

- Odsustvo fluorescentnog signala probe;

+ Prisustvo fluorescentnog signala probe;
++ Duplikacija specifičnog signala;
: Razdvajanje proba upotrijebljenih na različitim derivat
hromosomima;
ish in situ hibridizaciija primjenjena na metafaznim
hromosomima;
mv signal probe je pomjeren sa originalne lokacije usljed
rearanžmana;
st signal probe je na svojoj originalnoj poziciji
nuc ish interfazna in situhibridizacija;
wcp proba za cijeli hromosom.
Primjeri i objašnjenja standardne nomenklature za FISH

a) Metafazna in situhibridizacija ( ish)

U opisu in situ hibridizacije na metafaznim hromosima pružaju se informacije o
utvrđenom broju hromosama, korištenoj probi i utvrđenom signalu, te tipu
abnormalnosti.
Npr
46, XY.ish del (22) (q11.2q11.2)(D22s75-)
Označava da je konvencionalnom citogenetičkom metodom utvrđen normalan
muški kariotip.
Zatim je provedena fluorescentna in situ hibridizacija na metafaznim hromosima
primjenom lokus-specifične probe (D22s75) za hromosom 22q11.2 i utvrđena
delecija na jednom homologu 22.para.
Prisustvo signala na oba homologna hromosoma bilo bi označeno na slijedeći
način :
46, XY.ish22q11.2(D22s75x2,
dok se duplikacija signala označava ovako :
46, XY.ishdub(22)(q11.2q11.2)(d22s75++).
 b) interfazna / nuklearna in situ hibridizacija (nuc ish)

Informacija o interfaznoj in situ hibridizaciji podrazumijevaju

broj uočenih signala probe i relativno poziciju signala više
korištenih proba.
Nakon oznake za nuklearnu in situ hibridizaciju slijedi
hromosomska pozicija lokusa korištene probe.
Oznaka lokusa i broj uočenih signala, nakon znaka
multiplikacije, pišu se u zagradama.
Hromosomske pozicije različitih korštenih proba se najprije
predstavljaju na spolnim hromosima, a zatim na autosomima
(od 1-22) i to od početka p kraka prema kraju q kraka
hromosoma.
 Na primjer :
nuc ish Xp22.3(KALx2),21 q22(D21S65x2, D
21S64x19).
Za uspiješnu hibridizaciju različitih proba potrebni
su različiti uslovi, pa uz komercionalne probe
proizvođač obezbjeđuje i detaljne protokole.
Svi protokoli uključuju već opisane faze koje su u
pojedinim laboratorijima oprimizirane u skaldu sa
korištenim probama i rutinskim analizama.
PRINS

PRINS (Primed IN-Sito labeling) metodu su prvi put opisali Koch i

saradnici 1989. godine.
Ova metoda objedinjava principe PCR(lančana polimerazna reakcija) i
FISH metod, a to znači mogućnost citološke lokalizaicje specifičnog
segmenta DNK umnoženog pomoću in situ PCR tehnike. Umjesto DNK
sonde koriste se lokus specifični oligonukleotidni prameni koji
hibridiiraju sa denaturisanim komplementarnim sekvencama
analizirane DNK i ammplificiraju se in situ uz pomoć obilježenih
nukleotida i DNK polimeraze.
Realizirana DNK služi kao kalup, a obilježeni nukleotidi kao supstrat za
DNK polimerazu. Rezultati se analiziraju pomoću fluorescentnog
mikroskopa. PRINS metoda ima široku primjenu i omogućuje
identifikaciju centromera, telomera, markerhromosoma, pojedinih
gena, pa čak i malih delecija koje se detektuju na osnovu prisustva ili
odsustva signala.
MikroFISH/Mikrodelicijski FISH

Mogućnost kreiranja proba za određene regione

hromosoma mikrodisekcijom i kloniranjem specifičnog
segmenta je poznata od 1989. godine. Osnovna
procedura podrazumijeva izdvajanje željenog segmenta
hromosoma ili cijelog hromosoma staklenom pipetom
pod kontrolom mikromanipulatora. Dijelovi
hromosoma (obično 5-10 po analizi) se podvrgavaju
nezavisnoj amplifikaciji pri čemu je posljednji PCR
ciklus sa biotinom ili digoksigeninom, te konačni
produkt obilježena proba. Ova proba se potom, koristi
za standardnu FISH proceduru.