ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG – ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Đề tài:

QUY TRÌNH SẢN XUẤT INSULIN

GVHD: TS. Nguyễn Thị Minh Xuân

SVTH: Lê Quốc Huy
Đỗ Ngọc Ân
Đặng Thị Quỳnh
Đặng Thị Mơ
Đặng Thị Thủy Ngân
Lê Thị Cao Nguyên
MỤC LỤC

01
TỔNG QUAN
04
KẾT
LUẬN

02
NGUYÊN TẮC
05
TÀI LIỆU THAM KHẢO

03
QUY TRÌNH
SẢN XUẤT
INSULIN
2
TỔNG QUAN

BỆNH ĐÁI THÁO

ĐƯỜNG

INSULIN

3
TỔNG BỆNH ĐÁI THÁO
QUAN ĐƯỜNG

01
Một bệnh do rối loạn chuyển hóa cacbohydrat khi
hoóc môn insulin của tụy bị thiếu hay giảm tác
động trong cơ thể

02
Biểu hiện bằng mức đường
trong máu luôn cao

TỔNG QUAN
TYPE 1
Nguyên nhân: Dựa vào cơ chế tự
miễn (bẩm sinh)
Triệu chứng: Tiểu nhiều, uống
nhiều, đôi khi ăn nhiều, mờ mắt, dị
cảm và sụt cân, trẻ em chậm phát
triển và dễ bị nhiễm trùng
BỆNH ĐÁI THÁO
ĐƯỜNG
TYPE 2
Nguyên nhân: Do rối loạn chuyển
hóa không đồng nhất có đặc điểm
tăng glucose trong máu khiếm
khuyết về tiết insulin, tác động của
isnsulin hoặc cả hai.
Triệu chứng: Huyết áp cao, lương
glucose trong máu tang cao,
cholesterol cao
5
 TỔNG QUAN
Bác sĩ Frederick Hans Christan Insulin tổng hợp có tên là “Human
Banting và nghiên Hagedorn đã khám insulin” có những đặc tính khác hơn
cứu sinh Charles phá rằng Insulin có với insulin có nguồn gốc từ động
Best đã tiến hành thể kéo dài tác dụng vật. Human insulin có ưu điểm là ít
thử nghiệm trên khi gắn với Insulin người đầu gây dị ứng hơn insulin động vật
tuyến tụy của chó. protamine. tiên được tổng hợp

186 192 192 193 195 196 197 198 199

9 1 2 6 0 3 8 2 6
Paul Langerhans đã Banting và Best tiếp NPH, insulin tác Insulin đã trở thành Ra đời một loạt các
phát hiện ra một tục nghiên cứu và cải dụng trung bình protein người đầu Insulin anologue.
nhóm tế bào đặc biệt thiện kĩ thuật để sản đã được đưa ra thị tiên được sản xuất
ở tuyến tụy và sau xuất insulin và Eli trường bởi công ty bằng công nghệ
này gọi là đảo Lilly trở thành nhà Danish Novo sinh học bởi công ty
Langerhans. sản xuất insulin đầu Nordisk. Genentech.
tiên. 6
 INSUL
TỔNG QUAN IN

Insulin là 1 polypeptide có
51 acid amin gồm 2 chuỗi: A
và B, chuỗi A có 21 acid
amin, chuỗi B có 30 acid
amin được nối với nhau
bằng cầu nối Disulfide.

7
 INSUL
TỔNG QUAN IN

Insulin là hormon duy nhất trong cơ thể các tác dụng

làm hạ đường máu.

Nhằm chuyển glucose trong máu Glucose sẽ được sử dụng để cung

thành glycogen được dự trữ ở cơ Tăng tổng hợp và dự trữ protein ở hầu hết cấp năng lượng, lượng glucose
quan như gan, cơ, mô mở trừ tế các tế bào. không được sử dụng hết sẽ tổng
bào não hợp thành acid béo ở gan và được
vận chuyển đến mô mỡ.

GLUCI PROTEI
LIPID
D N
8
 NGUYÊN TẮC

Chọn lọc gen insulin Cắt và chèn gen Dùng enzyme để Biến nạp plasmid tái
mục tiêu của người insulin vào plasmid nối gen với tổ hợp vào E.coli
và plasmid trên E.coli plasmid

Tinh sạch insulin Thu insulin từ vi khuẩn Lên men Đưa vi khuẩn tái tổ hợp
bằng cách phá vỡ tế bào vào thùng lên men
 Quy
trình sản
xuất
 Tổng hợp Vector
gen mã hóa plasmid từ
Sơ đồ proinsulin E.coli (BL21)

Plasmid tái tổ hợp

Biến nạp

Tạo dòng

Sàng lọc các khuẩn lạc

Khuẩn lạc màu xanh
mang plasmid tái tổ hợp
Khuẩn lạc màu trắng insulin

Lên men

Tiền tinh sạch

1
Hoạt hóa Tinh sạch 1
 Gen mã hóa cho
NGUYÊN LIỆU insulin người nằm
ở nhiễm sắc thể
số 11 từ tế bào
tủy xương người

5’ 3’

ISOLATION
Đây là đoạn gen mục
Bổ sung Enzyme tiêu để sử dụng gắn
mARN
ribonuclease vào plasmid
1st cADN 3’ 5’ RT-PCR
2st cADN 5’ 3’

1
2
Plasmid pT2
- Chúng có khả năng tự tái bản trong
E. coli.
- Mang các gen chỉ thị chọn lọc để dễ
dàng phân biệt và tinh sạch vector
của thể tái tổ hợp với các dạng
khác. pT2
- Chúng có các vùng DNA không cần
thiết cho sự sinh sản trong vi khuẩn,
vì thế DNA ngoại lai có thể được
đưa vào trong các vùng này.
- Chúng có thể biến nạp vào tế bào
vật chủ một cách dễ dàng. 1
3
QUY TRÌNH

HindIII

pT2 Ligease
EcoRI

Tạo plasmid
tái tổ hợp 1
4
QUY TRÌNH

Ecoli

Biến nạp 1
5
 TẠO DÒNG

Sử dụng thể truyền là các gene có đánh

dấu có thể dễ dàng nhận biết được sự có
mặt của các DNA tái tổ hợp bằng cách
nhận biết các sản phẩm có đánh dấu.

Phân lập dòng tế bào chứa gene đánh

dấu. Nuôi vi khuẩn
trên môi trường
có chứa
Chỉ có các vi ampicilline
khuẩn chứa
DNA tái tổ hợp
sinh trưởng
được

1
6
 LÊN MEN
t = 23 giờ
T = 370C

Môi trường: Luria – Bertani

1% w/v peptne
Các vi khuẩn chuyển gen sau đó được đưa vào bình lên men. Nuôi chúng trong
0.5% các
w/v điều
cao nấm men
kiện tối ưu. 1% w/v NaCl
0.1% w/v NaOH
Sử dụng các phương pháp nuôi cấy liên tục. Duy trì 200 mg/l ampicilline

1
7
TIỀN TINH SẠCH

Dùng enzym lizozyme phá vỡ màng tế bào, sau

đó dùng hỗn hợp chất tẩy rửa (EDTA +
lysozyme) để tách lớp màng lipit.
Dùng phương pháp ly tâm lọc để tách được
proinsulin.

LY TÂM LỌC

1
8
HOẠT HÓA

Đưa Borat Thêm trypsin Ly tâm 30 phút

(20mM) pH = 8.5 và Ủ trong thu kết tủa
Ủ ở 25oC trong vòng 5 giờ (insulin tinh
vòng 2 giờ khiết)

1
9
 TINH SẠCH

Hỗn hợp được tinh sạch bằng

phương pháp sắc ký trao đổi ion để
chỉ còn insulin tinh khiết

Thiết bị sắc ký ion

21
KẾT LUẬN

• Nhu cầu sản xuất Insulin

Bằng kỹ thuật tái tổ hợp bằng vi sinh vật ngày càng
AND, người ta chuyển tăng
gene mã hoá insulin vào tế
 Sản xuất insulin bằng công
bào vi khuẩn, khi được
nghệ tái tổ hợp DNA giúp giảm
nuôi cấy trong môi trường
chi phí rất nhiều so với phương
thích hợp, vi khuẩn E.coli
sẽ sinh tổng hợp tạo ra loại pháp cũ, đồng thời lại thân thiện
peptide này.  với môi trường, bảo vệ động vật

2
2
 Nghiên cứu tìm ra môi
trường tối ưu cho việc
TIỀM NĂNG hình thành các cầu nối
cần thiết cho việc biểu
Nghiên cứu sâu hơn hiện hoạt tính của
insulin
nhằm cải tiến phương
pháp cổ điển chuyển
các tiền chất của
insulin thành insulin

Tìm ra một hệ thống biểu hiện

insulin cho năng suất, sản luợng
cao, đem lại những lợi ích to
lớn, tạo ra những chế phẩm hỗ
trợ đặc biệt và cải thiện sức
khoẻ con người.

2
3
TÀI LIỆU THAM
KHẢO

• Hae-Gwang Hwang, Kwang-Jin , “Quy trình sản xuất Insulin Glargine tái tổ
hợp sử dụng Escherichia coli”, 2016
• Sulena Polez, Domenico Origi, “Quy trình đơn giản và hiệu quả để sản xuất
Insulin trong Pichia pastoris”, 2016
• Th.S Nguyễn Ngọc Tâm Huyên, “Ứng dụng vi sinh vật trong bệnh đái tháo
đường”, 2011
• T.S Đào Xuân Tân, “Công nghệ sản xuất Insulin”, 2012
2
4
THANKS
YOU

25