TUYỂN CHỌN DÒNG MANG GENE MỤC TIÊU

Hai phương thức chọn lọc dòng mang gen mục tiêu
- Dòng mang gen mục tiêu: dòng tế bào chủ hoặc phage tái tổ hợp
mang đoạn DNA, gen đích cần thu nhận hay phân lập
- Hai phương thức chọn lọc dòng mang gen mục tiêu
+ Chọn lọc trực tiếp: thí nghiệm được thiết kế sao cho chỉ có dòng
mang gen mục tiêu mọc được trên môi trường nuôi cấy
+ Chọn lọc từ ngân hàng gen: tạo ngân hàng gen và chọn lọc dòng
mang gen mục tiêu từ ngân hàng
Chọn lọc trực tiếp: thí nghiệm được thiết kế sao cho chỉ có
dòng mang gen mục tiêu mọc được trên môi trường nuôi
cấy
 Chọn lọc trực tiếp gen kháng thuốc kan
- Ví dụ gen kan ở pR6-5 (KanR, AmpR, StrR, SulR)

Gắn lên vector

Biến nạp vào E. coli

Chọn lọc trên MT
chứa Kan
 Sàng lọc dòng E. coli chứa vector
(thể biến nạp, tranformant) bằng môi
trường sàng lọc chứa Amp/Tet

5
Cần thời gian để gen sàng lọc biểu hiện
trong thể biến nạp

6
 Sàng lọc vector tái tổ hợp bằng phương pháp bất
hoạt chèn
Bất hoạt chèn (insertion
inactivation): sự chèn
DNA mục tiêu vào gen
sàng lọc làm bất hoạt gen
này

Dòng mang vector chứa

DNA mục tiêu có kiểu
hình gen sàng lọc (-)

Dòng mang vector

khôngchứa DNA mục
tiêu có kiểu hình gen
sàng lọc (+)
7
 Bất hoạt chèn gen
kháng kháng sinh
Ở plasmid pBR322:
- Vector không mang DNA mục
tiêu có kiểu hình AmpRTetR
- Vector mang DNA mục tiêu có
kiểu hình AmpRTetS (gen tet bị
bất hoạt chèn)

8
Phương pháp Đĩa sao (replica plate)
để sàng lọc đột biến

9
 Sàng lọc dòng chứa vector tái tổ hợp bằng bất hoạt
chèn gen tet và replica plate để tuyển chọn đột biến

LB/Amp LB/Tet TetS

TetR 10
Sàng lọc dòng chứa
vector tái tổ hợp bằng
replica cấy

11
Bất hoạt chèn gen lacZ
mã hóa b-galactosidase
ở vector pUC

Sử dụng với chủng chủ E. coli

DlacZ

12
Operon Lactose và hoạt tính b-galactosidase

13
X-Gal
 Nguyên tắc bổ trợ
bổ trợ a
(a complementation)

-galactosidase: 4; 1023 aa

E. coli lacZ‘ (aa 1-146) 

Lac- phenotype

E. coli lacZM15 (aa 11-41)

 Lac- phenotype

E. coli lacZ‘ + lacZM15 

Lac+ phenotype

14
15
Bổ trợ a bởi vector pUC ở E. coli đột biến DlacZ

16
Sàng lọc dòng chứa vector tái tổ hợp bất hoạt lacZ
bằng khuẩn lạc trằng/xanh
Khuẩn lạc màu trắng: dòng tái tổ hợp (vector mang gen mục tiêu)
Khuẩn lạc màu xanh: dòng không tái tổ hợp (vector không mang gen
mục tiêu)

17
 Chọn lọc trực tiếp bằng bổ trợ di truyền đột biến
khuyết dưỡng
- Bổ trợ di truyền (genetic complementation): hai phân tử di
truyền bổ trợ nhau về đột biến làm mất chức năng
- Đột biến khuyết dưỡng (auxotrophic mutant):
+ Mất khả năng tự tổng hợp một nhu cầu dinh dưỡng thiết yếu
+ Đột biến làm mất chức năng của một gen có liên quan (gen mục
tiêu)
- Chọn lọc bằng bổ trợ di truyền (complementation selection):
+ Dùng chủng E. coli đột biến khuyết dưỡng gen mục tiêu làm
chủng chủ để biến nạp vector tái tổ hợp
+ Môi trường chọn lọc không chứa chất dinh dưỡng thiết yếu
+ Chỉ có dòng mang gen mục tiêu có thể bổ trợ đột biến và mọc
trên môi trường chọn lọc
Hiện tượng bổ trợ di truyền
Nguyên tắc bổ trợ di truyền

- Tổ hợp hai đột

biến 1 & 2: có bổ
trợ di truyền
- Tổ hợp hai đột
biến 2 & 3: không
có bổ trợ di
truyền
Tạo dòng gen trpA và chọn lọc bằng bổ trợ di truyền
Tạo dòng gen trpA và chọn lọc bằng bổ trợ di truyền
Phạm vi ứng dụng của phương thức chọn lọc trực tiếp

- Hạn chế:
bằng bổ trợ di truyền
+ Cần có chủng đột biến liên quan đến gen mục tiêu
+ Cần môi trường chọn lọc chỉ cho phép chủng có kiều hình
hoang dại (có bổ trợ di truyền) tăng trưởng
- Phạm vi ứng dụng:
+ Dùng để chọn lọc dòng mang gen mục tiêu liên quan đến các
enzyme xúc tác phản ứng sinh tổng hợp
+ Áp dụng ở các tế bào vi khuẩn, nấm men, nấm mốc...
+ Nhiều trường hợp có thể dùng E. coli làm chủng chủ để chọn
lọc gen có nguồn gốc khác (vi khuẩn khác, nấm men...) nếu có
sự tương đồng đủ về di truyền của gen
Chọn lọc dòng phage tái tổ hợp
Chọn lọc dòng phage bằng kiểu hình vệt tan

25
 Tuyển chọn dòng phage tái tổ hợp
- Một số phương pháp giúp xác định các phage tái tổ hợp
chứa DNA:

+ Dựa trên bất hoạt chèn lacZ: plaque trắng/xanh

+ Dựa trên bất hoạt chèn cI: plaque trong/đục

+ Dựa trên kiểu hình Spi: chỉ phage tái tổ hợp có thể xâm
nhiễm tế bào chủ

+ Dựa trên kích thước bộ gen l: chỉ những l DNA có kích

thước thích hợp mới được packaging thành virion để tạo
plaque
26
Tuyển chọn dòng phage tái tổ hợp
dựa trên bất hoạt lacZ và cI

27
 Tuyển chọn dòng phage tái tổ hợp bằng Spi
- Kiểu hình Spi (sensitive to P2 interference): xâm nhiễm của lbị
ngăn cản khi tế bào chủ có sự hiện diện của prophage P2
- Ứng dụng trong tuyển chọn dòng phage tái tổ hợp“
+ Phage lbình thường có Spi+: không xâm nhiễm được tế bào chủ
+ Phage ltái tổ hợp có Spi-: xâm nhiễm được vào tế bào chủ

28
 Tuyển chọn dòng phage tái tổ hợp dựa trên
kích thước bộ gen l
- Packaging ở l chỉ xảy ra thành công khi bộ gen của l có kích thước
37 – 52kb
- Vector l được thiết kế bằng cách loại bỏ một đoạn gen rất lớn của
bộ gen l không cần cho quá trình xâm nhiễm
- Chỉ các vector tái tổ hợp mang đoạn DNA ngoại lai mới có kích
thước thích hợp cho packaging và có khả năng xâm nhiễm tế bào

29
Chọn lọc từ ngân hàng gen:

Tạo ngân hàng gen và chọn lọc dòng mang gen mục tiêu từ
ngân hàng
 Thiết lập ngân hàng DNA bộ gen
- Ngân hàng DNA bộ gen (genomic DNA library): một tập hợp
chứa số lượng dòng tái tổ hợp đủ để đảm bảo chứa đủ các gen
của bộ gen sinh vật
- Các bước của qui trình:
+ Thu nhận DNA bộ gen từ sinh vật
+ Cắt không hoàn toàn DNA bộ gen (partial restriction digest)
+ Phân đoạn các đoạn DNA bằng điện di trên gel agarose
+ Thu nhận phân đoạn có kích thước tương ứng với vector (l,
cosmid, YAC, BAC, P1)
+ Gắn lên vector
+ Biến nạp vào tế bào chủ (E. coli)
+ Thu nhận ngân hàng và phân tích số lượng dòng của ngân
hàng
Số lượng dòng cần thiết của ngân hàng DNA bộ gen

Loài Bộ gen Số lượng dòng

(bp) DNA 17kb DNA 35kb

E. coli 4,6 x 106 820 410

S. cerevisiae 1,8 x 107 4.225 1.500
D. melanogaster 1,2 x 108 21.500 10.000
Rice 5,7 x 108 100.000 49.000
Human 3,2 x 109 564.000 274.000
Frog 2,3 x 1010 4.053.000 1.969.000
Thiết lập ngân
hàng DNA bộ
gen bằng
cosmid vector
 Thiết lập ngân hàng cDNA của eukaryote
- Ngân hàng cDNA (complementary DNA library): một tập hợp
chứa số lượng dòng tái tổ hợp của gen được biểu hiện ở mô, cơ
quan
- Các bước của qui trình:
+ Thu nhận mRNA từ tế bào, mô, cơ quan mà gen được biểu
hiện
+ Tạo cDNA mạch kép bằng phản ứng RT-PCR
+ Gắn lên vector
+ Biến nạp vào tế bào chủ (E. coli)
+ Thu nhận ngân hàng
Tạo cDNA
từ mRMA
Thiết lập ngân hàng cDNA
 Chọn lọc dòng mục tiêu từ
ngân hàng gen
- Gen ngoại lai không biểu hiện trong tế bào chủ: dùng
phương pháp lai phân tử nucleic acid
+ Gen mục tiêu được lai và phát hiện với mẫu dò DNA
đánh dấu
+ Lai khuẩn lạc (colony hybridization): vector là
plasmid
+ Lai vệt tan (plaquae hybridization): vector là phage

- Gen ngoại lai biểu hiện trong tế bào chủ: dùng phương
pháp lai miễn dịch giữa protein mục tiêu (kháng nguyên)
với kháng thể (immune hybridization, immunoblot,
Western blot)
Lai giữa các
sợi nucleic
acid
 Lai khuẩn lạc (colony hybridization)
- Chuyển khuẩn lạc lên màng lai (colony blotting), phá vỡ màng,
biến tính DNA
 Lai khuẩn lạc (colony hybridization)
- Lai với mẫu dò đánh dấu và phát hiện khuẩn lạc lai bằng
phim nhạy quang
Nguyên tắc đánh dấu mẫu dò bằng biotin-
dUTP và phát hiện sản phẩm lai
Nguyên tắc đánh dấu trực tiếp mẫu dò bằng
HR peroxidase và phát hiện sản phẩm lai
 Tổng hợp mẫu dò (probe)
- Đoạn DNA được sử dụng làm mẫu dò phải có trình tự chuyên
biệt với gen mục tiêu
- Mẫu dò được chọn lọc và tổng hợp dựa vào một số thông tin
sau đây:
+ Đặc điểm biểu hiện mạnh của gen mục tiêu ở tế bào dùng
làm
nguyên liệu để thu mRNA và tạo ngân hàng cDNA
+ Trình tự amino acid của sản phẩm protein
+ Trình tự của gen cùng họ
Chọn mẫu dò dựa
vào sự biểu hiện
mạnh của gen
- Chọn ngẫu nhiên vài
dòng mang vector tái
tổ hợp
- Thu nhận gen, đánh
dấu, dùng làm mẫu
dò để chọn lọc
- Xác định mẫu dò cho
kết quả lai với nhiều
dòng trong ngân
hàng cDNA
- Kiểm chứng mẫu dò
và gen bằng giải
trình tự hoặc bằng
sản phẩm protein tái
tổ hợp
 Tổng hợp mẫu dò gen mã hóa cytochrome c
của nấm men dựa vào trình tự amino acid

- Chọn đoạn peptid Trp-Asp-Glu-Asn-Asn-Met để tổng hợp mẫu dò

- Trình tự của 16 mẫu dò: TGG-GAT(C)-GAA(G)-AAT(C)-
AAT(C)-ATG
Lai kiểm chứng kép bằng mẫu dò nucleotide từ
trình tự amino acid để chọn lọc dòng
Tạo mẫu dò dựa vào sự tương đồng về trình tự
của các gen cùng họ ở cùng hoặc khác loài
- Các gen ở các loài khác nhau đều có trình tự bảo tồn; biết
được thông tin trình tự bảo tồn có thể thiết kế mồi cho phản
ứng PCR để khuếch đại đoạn gen mục tiêu giữa hai mồi. Sản
phẩm khuếch đại có thể được dùng làm mẫu dò
- Dùng gen của một loài khác làm mẫu dò để tìm dòng chứa gen
mục tiêu ở loài đang quan tâm
- Dùng gen đã biết làm mẫu dò để tìm các gen cùng họ (có trình
tự bảo tồn) trong cùng một loài
Tạo mẫu dò dựa vào sự tương đồng về trình tự
của các gen cùng họ ở cùng hoặc khác loài
 Chọn lọc dòng mục tiêu dựa vào sản phẩm
biểu hiện của gen: lai miễn dịch

Lai miễn dịch: phản ứng lai

dựa trên sự gắn chuyên biệt
giữa protein mục tiêu (kháng
nguyên) với kháng thể
(immune hybridization,
immunoblot, Western blot)
Lai miễn dịch sử dụng kháng thể sơ cấp
hoặc kháng thể thứ cấp đánh dấu