KỸ THUẬT THAO TÁC TRÊN GEN

1. Giới thiệu chung

Ý nghĩa của thao tác trên gen
1. Giới thiệu chung

Các thuật ngữ tương tự

 Kỹ thuật thao tác trên gen (Gene manipulating techniques)
 Kỹ thuật tái tổ hợp DNA, gen (DNA-, Gene recombinant
techniques)
 Kỹ thuật gen, kỹ thuật di truyền (Gene technology)
 Công nghệ gen, công nghệ di truyền (Genetic engineering)
 Tạo dòng gen (Gene cloning)
 Tạo dòng phân tử (Molecular cloning)
1. Giới thiệu chung

Mục đích các thí nghiệm thao tác trên gen

 Thu nhận một đoạn DNA mục tiêu hoặc một gen mục tiêu với khối
lượng đủ lớn cho thí nghiệm
 Tạo phân tử DNA lai (DNA tái tổ hợp)
 Nghiên cứu cấu trúc của DNA, gen
 Nghiên cứu chức năng của DNA, gen
 Nghiên cứu sự điều hòa biểu hiện của gen
 Thu nhận sản phẩm biểu hiện của gen và ứng dụng
 Tạo giống sinh vật mới có tính năng ưu việt
 Liệu pháp gen
 Thu nhận đoạn gen mục tiêu

Caùc phöông phaùp thu nhaän DNA vaø gen

 Taùch chieát DNA, RNA töø teá baøo, moâ

 Toång hôïp gen in vitro baèng PCR (polymerase chain reaction)
 Toång hôïp hoùa hoïc

 Taïodoøng (cloning):
+ Doøng hoùa gen qua ngaân haøng DNA boä gen (prokaryote)
+ Doøng hoùa gen qua ngaân haøng cDNA (eukaryote)
Các phương pháp thu nhận
đoạn gen mục tiêu

Tạo dòng một gen từ

DNA bộ gen
Gen mục tiêu
cần tạo dòng

Chọn lọc dòng mang

gen mục tiêu
Các phương pháp thu nhận
đoạn gen mục tiêu

Nhân bản đoạn DNA

In vivo
 Các bước cơ bản trong
tạo dòng một đoạn
DNA
1. Tạo phân tử DNA tái tổ
hợp
2. Chuyển vào trong tế bào
chủ
3. Nhân bản phân tử DNA
tái tổ hợp
4. Tế bào chủ phân chia
5. Mỗi tế bào ban đầu hình
thành quần thể: dòng
Các phương pháp thu nhận
đoạn gen mục tiêu

Nhân bản đoạn

DNA mục tiêu
In vitro bằng kỹ
thuật PCR
Tạo phân tử DNA lai (DNA tái tổ hợp)

Tạo phân tử DNA lai (DNA tái tổ hợp)

- Là phân tử DNA nhân tạo do sự lắp ghép từ các đoạn trình tự

nucleotide khác nhau bằng kỹ thuật thao tác trên gen
- Là bước căn bản cần thiết để:
+ Nghiên cứu cấu trúc, chức năng của DNA, gen
+ Nghiên cứu sự điều hòa biểu hiện của gen
+ Thu nhận sản phẩm biểu hiện của gen và ứng dụng
+ Lai tạo giống sinh vật mới có tính năng ưu việt
 Taïo doøng gen
- Taïo doøng gen duøng kyõ thuaät di
truyeàn phaân laäp vaø laøm thuaàn
moät gen:
+ Taùch vaø phaân ñoaïn DNA nguoàn
+ Gaén caùc ñoaïn DNA bò caét vaøo
vector doøng hoùa
+ Bieán naïp vaø giöõ DNA taùi toå
hôïp trong teá baøo chuû: ngaân
haøng DNA (DNA library, DNA
bank)
+ Phaùt hieän vaø laøm thuaàn doøng
muïc tieâu
+ Nuoâi caáy doøng muïc tieâu ñeå ly
trích vaø nghieân cöùu DNA taùi toå
hôïp
Thao taùc taùi toå hôïp gen baèng kyõ thuaät di truyeàn
- Caét DNA baèng enzyme caét
giôùi haïn nhaát ñònh

- Noái caùc ñoaïn caét baèng

ligase

- Gaén DNA taùi toå hôïp vaøo

vector (ñaõ ñöôïc caét bôûi
enzyme thích hôïp) baèng ligase

- Löu tröõ vaø nhaân baûn vector

vaø DNA taùi toå hôïp trong teá
baøo chuû

- Taùch chieát vector töø teá baøo

chuû vaø thu nhaän DNA taùi toå
hôïp khi caàn thieát
 Nghiên cứu cấu trúc, chức năng và điều hòa biểu hiện
gene

 Nghiên cứu cấu trúc của gen:

+ Trình tự nucleotide
+ Vùng trình tự mã hóa thông tin di truyền
+ Các trình tự chuyên biệt (promoter, terminater, trình tự điều hòa…)

 Nghiên cứu chức năng của gen:

+ Gen mã hóa RNA? Gen mã hóa protein?
+ Chức năng của RNA, protein

 Phân loại promoter

 Đặc điểm, chức năng của các trình tự điều hòa
 Cơ chế điều hòa sự biểu hiện của gen
Thu nhận sản phẩm của gen và ứng dụng

 Sản xuất protein tái tổ hợp (recombinant protein): protein được tạo ra dựa
trên kỹ thuật tái tổ hợp gen hoặc kỹ thuật gen

+ Sử dụng một tế bào chủ (host cell) thích hợp, dễ nuôi cấy

+ Khai thác chức năng nhà máy tổng hợp sinh hóa của tế bào

+ Kiểm soát để sinh tổng hợp vượt mức protein tái tổ hợp
 Ứng dụng protein tái tổ hợp:

+ Dùng làm vắc xin (vắc xin thế hệ hai)

+ Dùng làm thuốc điều trị các bệnh do sự mất chức năng của một protein,
bệnh tim mạch, ung thư…

+ Dùng để sản xuất kháng thể dùng trong chẩn đoán tác nhân gây bệnh
Tạo giống sinh vật mới có tính năng ưu việt

 Tạo chủng vi sinh vật mới

 Tạo giống cây mới
 Tạo giống động vật, thủy sản mới
1. Giới thiệu chung

Các phương pháp, công cụ của kỹ thuật thao tác trên gen

 Phương pháp cắt, nối DNA tạo DNA tái tổ hợp

 Phương pháp phân tích DNA: điện di, enzyme cắt giới hạn,
PCR phân tích, giải trình tự, lai phân tử…
 Phương pháp chọn dòng mang DNA, gen mục tiêu
 Các enzyme: enzyme cắt giới hạn, enzyme nối, các enzyme
biến đổi…
 Thể mang gen: vector
 Tế bào chủ
1. Giới thiệu chung
Phaân tích DNA
- Phaân ñoaïn DNA theo kích thöôùc baèng ñieän di treân gel agarose
(agarose gel electrophoresis, )
- Phaùt hieän DNA baèng phaåm nhuoäm huyønh quang ethidium bromide
döôùi ñeøn UV
- Phaân tích
DNA baèng
ñoä haáp thu
aùnh saùng
cöïc ñaïi
ôû 260nm
- Giaûi trình
töï
 Ñieän di treân gel
agarose vaø xem vaïch
DNA
AÛnh keát quaû
phaân tích DNA
baèng ñieän di treân
gel
agarose
Giaûi trình töï DNA

- Duøng phöông phaùp Sanger vôùi

ideoxyribonucleotide (ddNTP)
ñaùnh daáu
- Trình töï DNA ñöôïc ñoïc döïa
treân toång hôïp caùc sôïi boå sung
baèng DNA polymerase bò giaùn
ñoaïn bôûi moät ddNTP nhaát ñònh
ñöôïc ñaùnh daáu
- Taùch caùc ñoaïn DNA baèng
ñieän di
- Ñoïc trình töï
Nguyeân taéc
giaûi trình töï
DNA theo pp
Sanger söû
duïng ddNTP
Các Enzyme trong thao tác trên gene
 Theå mang gen: vector
- Vector: phaân töû DNA kích thöôùc nhoû duøng ñeå mang gen,
sao cheùp, thao taùc treân gen
- Vector taïo doøng vaø vector bieåu hieän
- Vector taïo doøng: chuyeån vaø löu tröõ gen taùi toå hôïp trong teá
baøo chuû, nhaân baûn, thao taùc, phaân tích sau ñoù treân DNA
taùi toå hôïp seõ deã daøng hôn
- Vector bieåu hieän: taïo saûn phaåm cuûa gen taùi toå hôïp ôû
möùc phieân maõ, dòch maõ, phaân tích trình töï ñieàu hoøa söï
bieåu hieän cuûa gen
 Teá baøo chuû
- E. coli
+ Teá baøo chuû phoå bieán nhaát
+ Vi sinh vaät gaây beänh cô hoäi
+ Khoâng tieát enzyme
- Bacillus subtilis
+ Khoâng gaây beänh, khoâng taïo noäi ñoäc toá, tieát protein
+ Pasmid khoâng oån ñònh trong teá baøo chuû
- Saccharomyces cerevisiae
+ Teá baøo eukaryote ñöôïc nghieân cöùu di truyeàn kyõ nhaát
+ Söû duïng ñeå bieåu hieän gen eukaryote
- Virus ñoäng vaät (SV40, retrovirus…)
+ Duøng ñeå doøng hoùa gen vaøo teá baøo höõu nhuõ, cô cheá tieàm tan