‫عنوان البحث‪:‬‬

‫المساهمة في الكشف عن بعض طفرات الثاالسيميا في‬

‫ي‬
‫سور ّ‬
‫ساحل ال ّ‬
‫ال ّ‬
‫‪ :‬إعداد الط ّالب‬
‫‪ :‬بإشراف‬
‫الريسا القصيري‬
‫ّ‬ ‫حسن اسماعيل‬
‫عبود‬
‫د‪ .‬ريم ابراهيم أ‪ .‬هبة ّ‬
‫أ‪ .‬سهير خرما د‪ .‬لطيفة علي‬ ‫خضور‬
‫مجد ّ‬ ‫خلدون أبو فخر‬
‫ميسلمان‬
‫ّ‬ ‫ساندي سليمان‬
 ‫المقدمة‬
‫• ينتشر مرض بيتا ثاالسيميا بشكل كبير في حوض البحر األبيض‬
‫المتوسط‪.‬‬

‫‪2‬‬
 ‫• التعريف بالثاالسيميا‪:‬‬
‫• يحتوي الدم في مكوناته على خضاب الدم "الهيموغلوبين" الذي‬
‫يتكون من سلسلتي ألفا وبيتّا ومجموعة الحديد ‪.‬‬
‫• قد يصاب الهيموغلوبين بخلل ما قد يكون طفرة‪.‬‬
‫• الثاالسيميا مرض وراثي يصيب الهيموغلوبين له نوعان ألفا وبيتّا‪:‬‬
‫• ثاالسيميا بيتّا له ثالث أنواع حسب عدد السالسل المصابة‪:‬‬
‫• ثاالسيميا بيتا صغرى‪.‬‬
‫• بيتا ثاالسيميا المتوسطة‪.‬‬
‫• ثاالسيميا بيتا كبرى‪.‬‬

‫‪3‬‬
 ‫• ثانيا ً ‪:‬‬
‫• االنتشار‪ :‬ينتشر في حوض المتوسط وشمالي أفريقيا وجنوب شرق آسيا والخليج العرب ّي‪.‬‬

‫‪4‬‬
 ‫أهميّة البحث‬
‫يع ّد هذا البحث خطوة أوليّة في الكشف عن طفرات بيتّا ثاالسيميا في السّاحل‬
‫أن ال ّدراسات التي تهت ّم بالمرض من النّاحية الجزيئية قليلة‪،‬‬
‫ي‪ ،‬بما ّ‬
‫السّور ّ‬
‫والمساهمة في إعداد خطوة أولى إلنشاء قاعدة بيانات لمرضى بيتا تاالسيميا في‬
‫‪.‬سوريا‬
‫باإلضافة إلى إمكانية مضاعفة القسم األكثر تطفّراً في المورثة باستخدام البادئات‬
‫‪.‬المص َّممة‬
‫‪5‬‬
 ‫األهداف‬
‫• تصنيع البادئات المص َّممة سابقا ً‪.‬‬
‫• جمع عيّنات دم من مرضى بيتّا ثاالسيميا‪.‬‬
‫• استخالص المادة الوراثيّة ‪ DNA‬من العيّنات‪.‬‬
‫• مضاعفة ال‪ DNA‬باستخدام تقنية ال‪ PCR‬والبادئات المصنّعة ‪.‬‬
‫• استخدام تقنيّة الرحالن الكهربائي لبيان فعاليّة البادئات المصنّعة‪.‬‬
‫‪6‬‬
 ‫الدراسات المرجعية‬
the name of )%( the proportion Mutation number
Article
 
kyriacou2000
kyriacou2000
24.1
17
IVS-I-110(G->A)
IVS-I-1(G->A)
1
2
‫الطفرات األكثر‬
kyriacou2000
kyriacou2000
8.5
7.1
Codon 5, -CT
_T->A30 ,
3
4 :‫انتشارا ً في سوريا‬
kyriacou2000 6.4 Codon 39, G->T 5
Multicenter 6 6
Codon 37, C->T
kyriacou2000 4.2 IVS-II-1(G->A) 7
kyriacou2000 4.2 IVS-I-6(T->C) 8
kyriacou2000 3.5 Codon 15, CAG->TAG 9
Multicenter 3 Codon 15, G->A 10
kyriacou2000 2.1 C->T ,88- 11
kyriacou2000 1.4 Codon 37, G->A 12
kyriacou2000 1.4 Codons 8/9, +G 13
kyriacou2000 1.4 IVS-II-745, C->G 14
kyriacou2000 1.4 IVS-I-116, T->G 15
kyriacou2000 0.7 Codon 8, -AA 16
kyriacou2000 0.7 IVS-I-130, G->C 17
Multicenter 0.7 Codon 27, G->T 18
kyriacou2000 0.7 bp deletion 25 19
  5.5 Unknown 20
7
 ‫د‬
‫ّ‬ ‫ا‬ ‫و‬ ‫م‬
‫ئ‬‫ا‬ ‫ر‬ ‫ط‬‫و‬
‫عم‬ ‫ل‬‫ا‬ ‫ق‬
‫ل‬

‫‪8‬‬
PCR IN SILICO

9
 ‫‪PCR‬‬

‫• خطواته‪:‬‬
‫• متطلباته‪:‬‬
‫• فصل سلسلة الحمض النووي‬
‫المضاعفة‪.‬‬ ‫• قالب الدنا‬
‫• ارتباط البادئة بالجزء المكمل من‬ ‫• البادئات‪‰‬‬
‫الحمض النووي القالبـ‪.‬‬
‫• تشكيل السلسلة المضاعفة‬ ‫• البوليميراز‬
‫اعتبارا ً من مكان ارتباط البادئة‬ ‫• ‪Buffer and MgCl2‬‬
‫بسلسلة الحمض النووي القالب‪.‬‬
‫• ‪dNTPs‬‬
‫‪10‬‬
 ‫البادئات‬
‫• البادئة هي سلسلة نيكلوتيدية قصيرة سابقة لإليجاد والتي يمكن عبرها انتاج سلسلة نيكلوتيدية‬
.polymerase‫جديدة بإضافة إنزيم البوليميراز‬
: ‫• جدول البادئات التي تم تصميمها‬
  THE OLIGONUCLE REVER OLIGONUCLE FORWA
THE USE OF IT PERSO OTIDE SE OTIDE RD
N SEQUENCE PRIME SEQUENCE PRIMER
R
‫يستخدم القتطاع المنطقة الهدف‬ / ‫ سليم‬CCAGGCCATC HMAR ACATTTGCTTC HMAR
‫التي تحتوي معظم الطفرات‬ ‫ مصاب‬ACTAAAGGCA reverse TGACACAACT forward
GT
‫يستخدم الكتشاف الطفرة‬ ‫سليم‬ CCTAAGGGTG IVS-I- ACATTTGCTTC HMAR
)IVS -I-110, G->A( GGAAAATAGA 110 TGACACAACT forward
CC GT
‫يستخدم الكتشاف الطفرة‬ ‫ مصاب‬CAGCCTAAGG IVS-I- ACATTTGCTTC HMAR
IVS -I-116, T->G((
11
GTGGGAAAA 116 TGACACAACT forward
GT
 ‫• جمع العيّنات ‪:‬‬
‫تمت زيارة مشفى تشرين الجامعي وأخذ عينة من مريض بيتّا ثاالسيميا وعيّنة أخرى سليمة‬
‫كشاهد (أخذت من أحد أعضاء المشروع)‬

‫‪12‬‬
 ‫• استخالص ال‪: DNA‬‬
‫‪ .1‬إضافة أنزيم بروتينيز ‪ K‬للعيّنة للتخلص من كل البروتينات عدا ال‪. DNA‬‬

‫‪13‬‬
‫‪ .2‬إضافة محلول ‪ AL‬للعينة وذلك لفصل المواد العضوية عن الالعضوية‪:‬‬

‫‪14‬‬
‫• ‪ .3‬إضافة محلولي ‪ AW1‬و ‪ AW2‬وذلك من أجل تنقية العيّنة من الشوائب‪.‬‬

‫‪15‬‬
‫• ‪ .4‬إضافة محلول ‪ AE‬للعيّنة وذلك لحل ال ‪ DNA‬من جزيئات عمود التنظيف الذي نتجت‬
‫من عملية اإلضافات السابقة‪.‬‬

‫‪16‬‬
‫• التأكد من نقاوة العيّنة ‪ :‬باستخدام جهاز‪Eppendorf-biophotometer- ‰‬‬
‫‪، plus‬عن طريق امتصاصية ال‪ DNA‬للطول الموجي ‪280-260‬‬

‫‪17‬‬
 ‫• ال ّرحالن الكهربائ ّي‪:‬‬
‫‪‬التعريف بالرّ حالن الكهربائي وآليّة عمله‪:‬‬

‫• يعرف الرحالن الكهربائي بأنه حركة األيونات والجزيئات العمالقة المشحونة خالل وسط معين الحادثة عند‬
‫تسليط تيار كهربائي‪.‬‬

‫• تحمل جزيئات الـ ‪ DNA‬والـ ‪ RNA‬شحنة سالبة أصيلة بسبب هيكلها المحتوي على الفوسفات‪.‬‬

‫‪18‬‬
 ‫‪‬العوامل التي تتحكم بحركة جزيئات ال‪ DNA‬في الهالم‪:‬‬
‫‪ .1‬الشحنة‪.‬‬
‫‪ .2‬حجمها أو وز‪‰‬نها الجز‪‰‬يئي ‪. formula weight‬‬
‫‪ .3‬حجم الثقوب ‪.pore size‬‬
‫‪ .4‬شدة التيار الكهر‪‰‬بائي ‪. the strength of the electrical field‬‬

‫‪19‬‬
 ‫‪‬الرحالن الكهربائي لعيّنة ‪: DNA‬‬
‫عندما نضع الحمض النووي ‪ DNA‬في مجال كهربائي فإنه سيهاجر (يرحل) للقطب‬
‫الموجب (المصعد)‪ .‬أما جل األغاروز فيستعمل لفصل وتحرك جزيئات ال ‪ DNA‬اعتمادا‬
‫على حجم ال ‪.DNA‬‬
‫خطوات الرحالن الكهربائي‪:‬‬
‫‪ .1‬نجلب عينة من الخاليا التي سنكتسب ال ‪ DNA‬منها ونغمرها في محلول مغذي على‬
‫الطبق وتترك لتنمو وتتضاعف‪.‬‬
‫‪ .2‬الخاليا الناتجة تجمد لالستعمال المستقبلي‪.‬‬

‫‪20‬‬
‫• ‪ .3‬أجزاء جهاز الرحالن الكهربائي تكون مجزأة وهي‪ :‬مصدر للطاقة ‪ -‬حوض الرحالن ‪-‬‬
‫طبق الرحالن ‪ -‬الغطاء ‪ -‬األمشاط ‪ -‬أسالك كهربائية‪ .‬ويكون تركيبها على مراحل‪.‬‬

‫أجزاء جهاز الرحالن الكهربائي‬

‫‪21‬‬
‫‪ .4‬نحضر طبق الرحالن من خالل لف حواف الطبق بالصق ثم وضع األمشاط‪ ،‬بعد ذلك نضع‬
‫الطبق على سطح مستوي مع مراعاة عدم لمس األمشاط لسطح طبق الرحالن‪.‬‬

‫طبق الرحالن بعد وضع األمشاط‬ ‫‪22‬‬

‫‪ .5‬نصب جل األغاروز في الطبق حتى يغمر األمشاط جزئيا ً ثم ننتظر حتى يبرد ويصبح جل‬
‫مرن شفاف ثم ننزع األمشاط والالصق‪.‬‬
‫‪ .6‬نضع الجل مع الطبق داخل حوض الرحالن الكهربائي‪.‬‬

‫وضع الطبق داخل حوض الرحالن‬ ‫‪23‬‬

‫‪ .7‬نصب المحلول الدارئ في حوض الرحالن الكهربائي حتى نغطي سطح الجل ونتأكد أن المحلول قد تخلل‬
‫جميع الفتحات‬
‫‪.8‬تخلط عينة ال‪ DNA‬مع صبغة ملونة مشعة حتى ترى تحت ال ‪( UV‬األشعة فوق البنفسجية) ثم ننزل‬
‫العينة بحرص شديد داخل اآلبار باستخدام ماصة إلكترونية‪.‬‬

‫‪24‬‬
‫وضع العينة داخل اآلبار‬
‫‪ .9‬نغطي حوض الرحالن بالغطاء الخاص بالجهاز مع مراعاة أن يكون كل قطب في محله ثم‬
‫نوصل التيار الكهربائي فيرحل ال ‪ DNA‬إلى القطب الموجب أو المصعد (بما أن شحنته‬
‫سالبة)‪.‬‬

‫‪25‬‬
‫صورة باألشعة فوق البنفسجية لرحالن العينة من القطب السالب للقطب الموجب‬
 ‫ئ‬‫ا‬ ‫ت‬‫ن‬‫ل‬ ‫ا‬
‫ج‬

‫‪26‬‬
‫• بعد القيام بإدخال البادئتين المصممتين على تقنية ال ‪،PCR in silico‬‬
‫توصلنا إلى أن البادئتين لهما موقع ارتباط واحد في جينوم اإلنسان‪.‬‬

‫‪27‬‬
28
 ‫• بعد عملية االستخالص تم التأكد من نقاوة العينة إذ أن ال‪ DNA‬المضاعف‬
‫يمتص طول الموجة ‪ 260‬والبر‪‰‬وتينات تمتص الطول الموجي ‪ ،280‬بقسمة‬
‫نسبتي االمتصاص على بعضهما أعطت النتيجة‪ ،1.8‬وهذا يعني أن العينة نقية‪.‬‬

‫‪29‬‬
 ‫• المساهمة في إنشاء بيانات قاعدة لطفرات بيتا ثاالسيميا في الساحل السوري‪.‬‬
‫• الخطة المستقبلية‪ :‬معرفة التسلسل النيكليوتيدي للعينات المدروسة‪ ،‬وتحليل النتائج‬
‫ومقارنتها مع الطفرات األكثر‪ ‰‬انتشاراً للساحل السوري‪ ،‬وجعل البادئة المصممة‬
‫معيار لتشخيص هذه الطفرات‪.‬‬

‫‪30‬‬
 ‫المناقشة‬
‫• بمقارنة بحثنا مع غيره من البحوث التي تهتم بالموضوع ذاته‪ ،‬فقد سجل العلماء ‪ 22‬طفرة‬
‫منتشرة في حوض البحر األبيض المتوسط‪ ،‬وتم في بحثنا تصميم وتصنيع بادئة جديدة فعالة‬
‫في مضاعفة قطعة ال‪ DNA‬التي تحوي على أكثر الطفرات المنتشرة في الساحل السوري‪.‬‬
‫• كما يعد هذا البحث خطوة أولية في الكشف عن طفرات بيتا ثاالسيميا في الساحل السوري ‪ ،‬بما‬
‫أن الدراسات التي تهتم بالمرض من الناحية الجزيئية قليلة‪.‬‬
‫• باإلضافة إلى قلة األبحاث التي تتحدث عن ثاالسيميا بيتا على المستوى الجزيئي‪ ،‬حيث يبلغ‬
‫عدد الدراسات السورية فقط مقالتين تقريبا ً التي تتناول الطفرات المسببة لثاالسيميا بيتا في‬
‫الساحل السوري‪.‬‬
‫• باإلضافة إلى إمكانية مضاعفة القسم األكثر تطفراً في المورثة باستخدام البادئات المصممة‪.‬‬
‫‪31‬‬
 ‫المقترحات والتوصيات‬

‫• إجراء التسلسل النكليوتيدي للعيّنات‪.‬‬

‫• استخدام هذه التقنيّة في التشخيص المب ّكر للمرض‬
‫• توسيع دراسة مرض البيتا ثاالسيميا في سوريا‪.‬‬

‫‪32‬‬
 ‫المراجع‬
J.A.M.A. Tan • E. George • K.L. Tan • T. Chow • P.C. Tan • J. Hassan • P. Chia • R. Subramanium R. Chandran • S.F. Yap Molecular defects in the β-globin gene identified in different ethnic groups/populations •
.during prenatal diagnosis for β-thalassemia: a Malaysian experience

.Bias-corrected diagnostic performance of the naked eye single tube red cell osmotic fragility test (NESTROFT): An effective screening tool for βthalassemia •

Manju Mamtani, Anil Jawahirani, Kishor Das, Vinky Rughwani & Hemant Kulkarni •

.Rapid Screening of Multiple •

Globin Gene Mutations by Real-Time PCR on the LightCycler: Application to Carrier Screening and Prenatal Diagnosis of Thalassemia Syndromes Christina Vrettou,1,2 Joanne Traeger-Synodinos,1 Maria - •
.Tzetis,1 George Malamis,1 and Emmanuel Kanavakis1

*.Understanding Beta-Thalassemia with Focus on the Indian Subcontinent and the Middle East P. Lahiry§, S.A. Al-Attar§ and R.A. Hegele •

..2007 .‫ عالقة بعض العوامل على االصابة بمرض الثالسيما في العراق‬,.‫م‬.‫ص‬.‫ ع‬,‫] مخلص‬1[ •

.2009 .‫دليل المريض‬, )‫ فقر دم البحر األبيض المتوسط (الثاالسيميا‬,.‫أ‬.‫غ‬.‫ د‬,‫] الشامات‬2[ •

Old, J.M., et al., A multi-center study in order to further define the molecular basis of β-thalassemia in Thailand, Pakistan, Sri Lanka, Mauritius, Syria, and India, and to develop a simple molecular ]3[ •
.diagnostic strategy by amplification refractory mutation system-polymerase chain reaction. Hemoglobin, 2001. 25(4): p. 397-407

sample and assay technology 2016 ]4[ •

.Rittner, D. and T.L. McCabe. Encyclopedia of biology. 2008 ]7[ •

Department of Anatomy, Rural Medical College, Pravara Institute of Medical Sciences, Loni, Maharashtra, India . POLYMERASE CHAIN REACTION: METHODS, PRINCIPLES AND APPLICATION. ]8[ •
.Dr.Mohini Joshi1*, Dr.Deshpande J.D2

Institute of Poultry Diseases Free University Berlin . Polymerase chain reaction (PCR) . D. Lüschow andH. M. Hafez ]9[ •

  • 33
:‫المواقع االلكترونية‬ •

https://gear.embl.de/silica/ •
 ‫شكراً‬
‫لحسن‬
‫استماعكم‬