Professional Documents
Culture Documents
MBKY II 5.ders Protein Saflastirma
MBKY II 5.ders Protein Saflastirma
MBKY II 5.ders Protein Saflastirma
O
Proteinler dışındaki Proteinler çöktürülür.
moleküller karışımdan
uzaklaştırılır:
(TCA-NH4 sülfat-organik
Örneğin, ham özüte çözücüler kullanılarak)
streptomisin sülfat
eklenerek DNA
çöktürülür. Santrifüjlemeyle ayrılıp
ileri saflaştırma işlemleri
uygulanır.
Daha sonra da
santrifüjleme ile
uzaklaştırılır.
PROTEİNLER çoğunlukla
Büyüklük ve şekil,
Toplam yük,
Yüzeyde bulunan hidrofobik gruplar,
Kullanılan durağan faza bağlanma kapasitesi
O
ayrılıp saflaştırılabilir.
Kolon kromatografisi kolon
dolgu maddesi (durağan
faz, matris) ile
doldurulmuş alttan
musluklu basit bir cam
boruda gerçekleştirilebilir.
Protein karışımı uygun bir
elüsyon çözeltisiyle
kolonda sürüklenir.
Durağan fazla etkileşim
(adsorbsiyon) ve kolondan
ayrılma (dezorbsiyon)
özelliği bakımından farklı
proteinler belli zaman
aralıklarında veya
hacimlerde toplanarak
farklı fraksiyonlara ayrılır.
Kolondan çıkan fraksiyonların otomatik olarak belli hacimlerde toplandığı ve
absorbsiyonlarının ölçüldüğü 4 4 de vardır. Böyle bir sistemde elüsyon
çözeltisi rezervuarla kolona gönderilebileceği gibi, 4 ile sürekli
de beslenebilir. Kolondan geçen farklı fraksiyonlar
4
tarafından ayrı kaplarda toplanır ve absorbsiyonları belirlenebilir ya da enzim
aktivitesi ölçülerek izlenebilir.
Kolon kromatografisinin farklı temellere
dayanan çeşitli tipleri vardır:
Elektrik yükü veya hidrofobik grupların dağılımı gibi bazı
yapısal özelliklere dayanan:
4
4
4
Protein ve dolgu maddesi arasındaki yapısal ve işlevsel
uyum ve etkileşim temeline dayanan:
4
4
4
Molekül boyutuna dayanan:
4
4
de denir)
Proteinleri oluşturan amino asitler farklı
yan zincirlere sahiptir. Aspartik ve
glutamik asit pH 7.0 değerinde negatif
yüklü asidik gruplar taşırken; lizin, arjinin
ve histidin pozitif yüklü bazik gruplar
içerir.
aspartik asit glutamik asit
arginin
histidin
lizin
Her protein, bu beş amino asiti farklı
oranlarda içerdiğinden, moleküllerin yükleri
de farklı (pozitif veya negatif) olur. Proteinin
net yükü yapısındaki bu amino asitlerin
miktarına ve protein çözeltisinin pH¶sına
bağlı olarak değişir.
matrisler ANYON
§
§
§ §
DEĞİŞTİRİCİLER,
DEĞİŞTİRİCİLER §
4
C2H4NH§(C2H5)2 CH2COO-
C2H4N§(C2H5)3
Anyon değiştirici mi, katyon
değiştirici mi seçmeliyiz?
DEAE-sefaroz Zayıf CM-sefaroz Zayıf
CL-6B CL-6B
DEAE-sefaroz Zayıf CM-sefaroz Zayıf
(hızlı akışlı) (hızlı akışlı)
Q sefaroz Kuvvetli S sefaroz Kuvvetli
(hızlı akışlı) (hızlı akışlı)
Çünkü bağlama kapasitesi etkilenir
MW10.000-100.000 proteinler için
DEAE-Sephacel veya ±Sepharose;
Daha büyük proteinler için Sephadex
A-25 veya C-25 kullanılır.
İyon değişimi kromatografisinde
.
Tamponlanmayan çözeltiler,
proteinler yerine, anyon
değiştiricilerin yüzeyinde OH> ve
katyon değiştiricilerin yüzeyinde H§
iyonlarının lokalize olmasına
4 ) yol açar. Bu da
(
olumsuz iyon değişimlerine ve
protein denatürasyonuna neden
olur.
Bu teknikte sabit fazın (matrikse bağlı yan
zincirlerin) proteinlerle oluşturduğu hidrofobik
etkileşimlerden yararlanılır. Bu etkileşimin
derecesine göre farklı proteinler farklı
zamanlarda kolonu terkederler.
Sabit fazdaki hidrofobik ligantlara örnekler
Tiyofilik Adsorpsiyon
Kromatografisi (TAC)dir.
÷
÷
÷ !
"
&
&(
Amino asitler, karbohidratlar, lipidler, nükleik
asitler, proteinler, pigmentler, streoidler ve
diğer biyolojik aktif moleküllerin ayrılmasında
ve tanımlanmasında çok iyi sonuçlar veren
bu teknik temelde otomatik hale getirilmiş
modern bir sıvı kromatografi tekniğidir.
HPLC¶nin klasik sıvı
kromatografilerine göre önemli
üstünlükleri vardır:
1) çözünme (ayrıştırma) ve analiz hızı klasik
yöntemlerden çok yüksektir, 2) kolonları
yeniden doldurulmadan ve yenilenmeksizin
sürekli kullanılabilir, 3) ayırma gücünü etkileyen
değişkenler sıkı şekilde kontrol edilebildiğinden
tekrarlanabilirliği son derece yüksektir, 4) aletin
çalışması ve verilerin analizi kolaylıkla
otomatikleştirilir, 5) büyük boyuttaki (preparatif)
ayırım süreçlerine uygulanabilir.
4 |!
|4
Waters
2795 | $19,900
Waters 2795 Alliance HPLC is an integrated solvent and sample management
platform which combines two traditional high-performance liquid chromatography
(HPLC) components: a solvent management system and a sample management
system. ... more
Kromatografik bir sistemde
hareketli faz gaz, durağan faz
da inert katı partiküller üzerini
kaplayan bir sıvı olduğunda
bu tekniğe 4
4 ya da kısaca
4
denir.
Gaz kromatografisi temelde dağılım olayına
dayanır. Durağan faz, yüksek sıcaklık
derecelerine dayanıklı, paslanmaz çelik veya
camdan bir tüp (kolon) içine doldurulur. İnert bir
gaz (genelde helyum, azot veya argon) (hareketli
faz) yüksek basınç altında kolondan geçirilir.
Çalışılan materyale ait örnek buharlaştırılarak gaz
fazına sokulur ve durağan fazdan geçmesi
sağlanır. Örnekteki bileşenler hareketli faz ile katı
destek üzerindeki durağan sıvı faz arasında
dağılırlar. Durağan faza ilgisi olan moleküllerin
kolondaki hareketleri daha yavaş olur.
Gaz kromatografisi çok küçük moleküllerin son
derece iyi ayrılmasını sağlayan; basit, çok
yönlü, hızlı bir tekniktir ve çok duyarlıdır.
Bununla birlikte, bu kromatografideki en önemli
kısıtlama örneğin uçucu ve yüksek sıcaklık
derecelerine (200-250oC) dayanıklı olması
gerekliliğidir. Bu nedenle, gaz kromatografisi
ancak uçucu ya da uçucu türevi hazırlanabilen
moleküllerin ayırımında kullanılabilir.
"|
Code:#"|$
| $""""
"Hewlett Packard - 5890 Series II Gas Chromatograph with Packed
Inlet, O.I. Corp. PID/ELCD, O.I. Corp. 4560 Purge & Trap
Concentrator with MPM16 Autosampler (other options available),
Pentium IV Computer Data System with ChemStation. Tested
System with Six (6) Month Warranty, Installation and Training
Options are Available."