TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO SINH HỌC PHÂN TỬ TẾ BÀO

CÁC XÉT NGHIỆM SINH HỌC PHÂN TỬ

Thành viên
Giảng viên hướng dẫn
1. Nguyễn Thị Loan Anh M0521014
PGS.TS Trần Nhân Dũng 2. Nguyễn Khánh Duy M0521015
3. Trần Hữu Hậu M0521016
4. Lê Hiếu Huy M0521017
5. Dương Thế Long M0521018
KỸ THUẬT PCR
I. KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM PCR
• 1 GIỚI THIỆU VỀ PCR
• Là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo
các đoạn DNA với tốc độ nhanh,
có độ chính xác cao, không cần
sự hiện diện của tế bào
• Phản ứng PCR cho phép khuếch
đại một đoạn DNA nằm giữa 2
mồi chuyên biệt nhờ men DNA
polymerase

Một dải gồm 8 ống PCR, mỗi ống chứa hỗn hợp phản ứng 100 μL
I. KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM PCR
• Một phản ứng PCR gồm các thành phần
• H2O tiệt trùng
• Buffer
• dNTP tổng số
• Mồi xuôi
• Mồi ngược
• DNA mẫu
• Tap polymerase
• Cation 2 hóa trị
I. KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM PCR
• THỰC NGHIỆM
I. KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM PCR
• Ưu và nhược điểm của xét nghiệm PCR
ƯU ĐIỂM
• Cho kết quả xét nghiệm nhanh
• Phát hiện được các tác nhân vi sinh vật
gây bệnh
• Xác định được những tác nhân vi sinh
không thể triển khai nuôi cấy được tại
phòng thí nghiệm lâm sàng
• Kết quả định lượng chính xác số bản
copies virus/ 1 ml máu
• Phát hiện các đột biến gen gây ung thư,
gây các bệnh di truyền khác...nhằm có
biện pháp phòng ngừa bệnh.
• Xác định mối quan hệ huyết thống giữa
những cá thể khác nhau.
NHƯỢC ĐIỂM
• Xét nghiệm PCR rất khó thực hiện được
một cách chuẩn mực tại các phòng thí
nghiệm lâm sàng.
• Giá thành của xét nghiệm PCR khá cao.
• Xét nghiệm PCR đòi hỏi trình độ của kỹ
thuật viên, bác sĩ phải là người có trình
độ chuyên môn cao.
• Đòi hỏi trang thiết bị, máy móc kỹ thuật
hiện đại.
 MỘT SỐ KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM PCR
 Phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase thời gian thực (qPCR)

(1) Trong các đầu dò còn nguyên vẹn, huỳnh quang phóng xạ bị dập tắt. (2) Các mẫu dò và sợi
DNA bổ sung được lai với nhau và hiện tượng huỳnh quang phóng xạ vẫn bị dập tắt. (3) Trong quá
trình PCR, đầu dò bị phân hủy bởi Taq polymerase và phóng xạ huỳnh quang được giải phóng.
• Phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase sao chép ngược (RT-PCR)
 I. KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM PCR
Ứng dụng
• Phát hiện các tác nhân không thể nuôi cấy thường quy
• Phát hiện các vi khuẩn lậu
• Phát hiện các tác nhân nuôi cấy thất bại vì có mặt rất ít trong bệnh phẩm, đã bị
điều trị kháng sinh trước đó
• Phát hiện virus Dengue gây bệnh sốt xuất huyết
• Phát hiện mầm mống của bệnh ung thư
• Nghiên cứu về hệ kháng nguyên bạch cầu người
• Phát hiện các chủng vi khuẩn kháng thuốc
• Xác định độc tố của vi sinh vật
• Trong công nghệ sinh học, xét nghiệm sinh học phân tử được sử dụng trong việc
lập bản đồ gen, phát hiện gen, dòng hoá gen, giải mã trình tự ADN...
I. KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM PCR
• Xét nghiệm covid - 19
• Xét nghiệm PCR tìm kiếm sự hiện diện của virus COVID-19 bằng
cách phát hiện vật liệu di truyền (RNA) của nó thông qua một kỹ thuật
gọi là phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (RT-PCR). Các
mẫu bệnh phẩm có thể được lấy cho thử nghiệm này bao gồm:
• Mẫu dịch ngoáy mũi
• Mẫu dịch ngoáy họng
• Mẫu dịch nước bọt
I. KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM PCR
Xét nghiệm covid - 19
• Độ chính xác của xét nghiệm PCR, giống như các xét nghiệm virus
khác, phụ thuộc vào các yếu tố như:
• Kỹ thuật được sử dụng để lấy mẫu bệnh phẩm
• Giai đoạn của bệnh khi mẫu bệnh phẩm được thu thập
• Mẫu bệnh phẩm có được vận chuyển đến phòng xét nghiệm trong các
điều kiện thích hợp hay không
KỸ THUẬT REALTIME
PCR
II. KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM REALTIME PCR
3. Xét nghiệm hội chứng đốm trắng trên tôm (white spot syndrome virus - WSSV)

Virus hội chứng đốm trắng (WSSV) có kích thước bộ gen gần
300 kb và thuộc chi Whispovirus, họ Nimaviridae.
• Tỷ lệ tử vong cao 80-100%
• Diễn biến bệnh nhanh
• Biểu hiện
Tôm hoạt động kém
Ăn nhiều đột ngột sau đó bỏ ăn
Vỏ tôm có nhiều đốm trắng

Lee et al. 2021

Xét nghiệm và định lượng hội chứng đốm trắng trên tôm
1. Thu mẫu tôm cần xét nghiệm WSSV
• Tôm càng Úc từ Insonesia và tôm hùm nước ngọt từ Trung Quốc được mua
tại chợ hải sản Daedu, Seoul, Busan, Jeollabuk-do và Gyeonggi-do từ 2018
đến 2020, trữ ở -80℃.
• Lượng DNA được phân tích PCR và qPCR là 1 μL, 45ng.
2. Phát hiện WSSV bằng phương pháp PCR
Phản ứng PCR với mồi (WSI3 và WSI4), mối phản ứng 25 μL bao gồm 1 μL
mồi. Sản phẩm PCR có kích thước 941 bp.
3. Định lượng WSSV bằng phương pháp realtime PCR
Phản ứng realtime PCR (qPCR) với đoạn mồi (WSS1011F và
WSS1079R) và đầu dò TaqMan (WSSV-P1). Tổng thành phần phản ứng
với 20 μL (gồm 1 μL DNA, 1 μL mỗi đoạn mồi, 10 μL TaqMan probe)
primer và đầu dò. Sản phẩm PCR trình tự WSSV có kích thước 69 bp.
Bảng 1: Chu kỳ phản ứng PCR và qPCR
Chu kỳ
Giai đoạn
Tên
biến tính Biến tính Bắt cặp Kéo dài Kéo dài
PCR (40 chu kỳ) 94℃ trong 94℃ trong 62℃ trong 72℃ trong 72℃ trong
3 phút 20 giây 20 giây 30 giây 3 phút
qPCR (40 chu kỳ) 95℃ trong 95℃ trong 60℃ trong - -
5 phút 30 giây 35 giây
Kết quả pháp hiện WSSV bằng phản ứng PCR
Bảng 2: Mẫu tôm được xét nghiệm WSSV bằng kỹ thuật PCR
Phát hiện
Mẫu Quốc gia Loài Thời gian Địa điểm
WSSV
20-002 Indonesia Cherax quadricarinatus 2019/03 Daegu +
20-003 Trung Quốc Procambarus clarkii 2018/10 Seoul _
20-005 Indonesia Cherax quadricarinatus 2019/04 Busan _
20-006 Indonesia Cherax quadricarinatus 2019/06 Jeollabuk-do _
20-007 Indonesia Cherax quadricarinatus 2019/02 Jeollabuk-do +
20-008 Indonesia Cherax quadricarinatus 2020/01 Gyeonggi-do +
20-009 Indonesia Cherax quadricarinatus 2019/04 Busan +
20-010 Indonesia Cherax quadricarinatus 2019/04 Busan _
20-012 Trung Quốc Procambarus clarkii 2018/10 Seoul +
20-013 Indonesia Cherax quadricarinatus 2018/12 Daegu +
 Kết quả định lượng WSSV bằng phản ứng realtime PCR
Bảng 3: Định lượng WSSV bằng kỹ thuật realtime PCR
Mẫu Quốc gia Loài Mô Giá trị Ct Bản sau/μL
20-009 Indonesia Cherax quadricarinatus Gan tụy - -
Mang - -
Biểu bì - -
Cơ 32.54 ± 0.16 1.02 × 103 – 1.19 × 103

20-012 Trung Quốc Procambarus clarkii Gan tụy 23.61 ± 0.47 4.93 × 105 – 7.93 × 105

Mang 20.52 ± 0.38 4.65 × 106 – 6.80 × 106

Biểu bì 20.00 ± 0.07 7.80 × 106 – 8.36 × 106

Cơ 20.73 ± 0.30 4.16 × 106 – 5.61 × 106

20-013 Indonesia Cherax quadricarinatus Gan tụy 32.28 ± 0.66 9.46 × 102 – 1.83 × 103

      Mang 34.44 ± 0.45 2.28 × 102 – 3.58 × 102

      Biểu bì - -
      Cơ - -
KỸ THUẬT MICRO
ARRAY
 III. KỸ THUẬT MICRO ARRAY
- ADN microarray (thông thường được biết đến
với tên gọi ADN chip hay chip sinh học) là một
tập hợp các điểm ADN siêu nhỏ được gắn trên
một giá thể rắn.

- Mỗi điểm ADN chứa hàng picomoles của một

trình tự gen đặc hiệu, được biết đến như các
mẫu dò (probes hoặc reporters hay oligos).

- Sự lai mẫu dò – đích thường được phát hiện và

định lượng bởi các chất đánh dấu huỳnh quang
(fluorophore-labeled), bạc (silver-labeled) hoặc
sự phát quang bằng phản ứng hóa học
(chemiluminescence-labeled) để xác định mức
độ lặp lại của các trình tự acid nucleic trong
đích.
 III. KỸ THUẬT MICRO ARRAY
NGUYÊN LÝ
1. Nguyên lý chung
- Sự lai giữa hai chuỗi DNA
- Chỉ có những chuỗi bắt cặp mạnh mẽ sẽ
được giữ lại sau khi rửa
- Các trình tự đích được đánh dấu huỳnh
quang gắn với đầu dò cho tín hiệu phụ thuộc
vào điều kiện lai và điều kiện rửa sau lai

2. Nguyên lý xét nghiệm microarray trong

y học
- Các đoạn dò (probe) đặc hiệu cho các ổ gen
hoặc các vùng gen (locus) muốn khảo sát
nằm trên 24 loại nhiễm sắc thể (NST), gồm
số 1 đến 22, X và Y, được in lên lam kính
đặc biệt tạo nên một array.
 III. KỸ THUẬT MICRO ARRAY
PHÂN LOẠI MICROARRAY
Micro-array được phân thành 3 nhóm chính tùy theo loại probe được in trên lam kính.

 Micro-array để khảo sát biểu hiện gen trong ung thư, chuyển gen: sử dụng probe RNA
thông tin (mRNA).

 Micro-array để phân tích đặc tính đa hình SNP, đột biến điểm: thường sử dụng probe
gDNA.

 Micro-array để khảo sát sự thêm hoặc bớt một đoạn NST (DNA)
 III. KỸ THUẬT MICRO ARRAY

Xét nghiệm Micro-array được ưu tiên chỉ định trong các trường hợp sau:
 Thai dị tật bẩm sinh, chậm tăng trưởng trong tử cung
 Thai bị chết lưu hoặc sẩy chưa rõ nguyên nhân
 Trẻ em hoặc người lớn bị thiểu năng trí tuệ, chậm phát triển về tâm thần vận động, dị tật
bẩm sinh, nghi ngờ bất thường di truyền do microdeletion/microduplication NST
 Các cặp đôi bị sẩy thai liên tiếp chưa rõ nguyên nhân
 III. KỸ THUẬT MICRO ARRAY

ỨNG DỤNG MICROARRAY TRONG XÉT NGHIỆM Y HỌC -

KỸ THUẬT ARRAY CGH
- Kỹ thuật CGH (Comparative Genomic Hybridization) bắt đầu được phát triển từ những năm 1990
cho phép đánh giá trên toàn bộ genome tình trạng mất cân bằng của NST.

- Với array CGH những bất thường trên NST xảy ra ở dưới mức phát hiện của kính hiển vi
(submicroscopic) dưới dạng vi mất đoạn (microdeletion) hoặc vi nhân đoạn (microduplication) có
thể được phát hiện một cách dễ dàng.
QUY TRÌNH THỰC HIỆN
III. KỸ THUẬT MICRO ARRAY

Để đánh giá trình trạng bình thường, thừa hoặc mất đoạn
của ADN cần phân tích so với ADN chứng ứng tại mỗi vị trí
của đoạn dò, log2 tỷ số của cường độ bắt màu huỳnh quang
giữa (mẫu bệnh / mẫu đối chứng) được sử dụng để tính toán:
 Log2 giữ vai trò trung tâm, với giá trị bằng 0
 Trường hợp mất đoạn bán hợp tử (hemizygote deletion)
của mẫu bệnh: log2 (bệnh/chứng) = log2 (1/2) = -1
 Trường hợp nhân đoạn (duplication) của mẫu bệnh:
log2 (bệnh/chứng) = log2 (3/2) = 0,59
 Trường hợp nhân đoạn đồng hợp tử (homozygous
duplication): log2 (bệnh/chứng) = log2 (4/2) = 1
ƯU ĐIỂM CỦA KỸ THUẬT CGH
HẠN CHẾ CỦA KỸ THUẬT CGH
KỸ THUẬT ELISA
 IV. KỸ THUẬT ELISA
I. GIỚI THIỆU
• Xét nghiệm sinh học phân tử (Molecular diagnosis) là một trong
những phương pháp kỹ thuật xét nghiệm tân tiến đang được sử dụng
phổ biến rộng rãi trong ngành y học ngày nay.

• Xét nghiệm sinh học phân tử là một thuật ngữ dùng để nói về các
xét nghiệm nhằm phát hiện các chỉ thị sinh học ở mức độ phân tử Hình 2: Đĩa ELISA 96 giếng
như các đoạn acid nucleic, các gen hoàn chỉnh

• Kỹ thuật này ra đời vào cuối thế kỷ XX dựa trên phương pháp
khuếch đại chuỗi PCR tạo ra các phản ứng PCR để từ đó giúp nhận
diện và định lượng các yếu tố nguyên nhân gây nên bệnh.

• Kỹ thuật này nhằm giúp việc xác định nguyên nhân gây bệnh được
nhanh chóng và chính xác hơn để phục vụ cho quá trình điều trị
được hiệu quả hơn.
Hình 4: Máy xét nghiệm ELISA

Hình 3: Pipet ELISA

 IV. KỸ THUẬT ELISA
1. Kĩ Thuật ELISA (Kháng nguyên –
Kháng Thể)
• Xét nghiệm miễn dịch hấp thụ liên kết với Enzyme
(ELISA) là một kỹ thuật sinh học phân tử được ứng
dụng tính đặc hiệu của kháng thể, cũng như độ nhạy
của các xét nghiệm enzyme, để phát hiện và định
lượng các phân tử như hormone, peptide, kháng thể
và protein.
• ELISA được sử dụng như một công cụ chẩn đoán
trong y học và bệnh lý học thực vật, cũng như kiểm
tra kiểm soát chất lượng trong các ngành công
nghiệp khác nhau.
Hình 1: Kĩ thuật xét nghiệm ELISA
 IV. KỸ THUẬT ELISA
A. Cơ chế:
• Để thực hiện một phản ứng ELISA bao gồm ít nhất một kháng thể bắt cặp đặc hiệu với
kháng nguyên cụ thể.
• Các mẫu có số lượng kháng nguyên chưa biết được cố định trên một bề mặt vững chắc- giá
thể rắn (thường là một tấm polystyrene vi chuẩn).
• Sau khi kháng nguyên được cố định, các kháng thể phát hiện được thêm vào, tạo thành một
phức hợp với các kháng nguyên.
• Các kháng thể phát hiện có thể liên kết với một loại enzyme, hay chính nó có thể được phát
hiện bởi một kháng thể thứ cấp liên kết với một loại enzyme thông qua liên kết cộng hóa trị
giữa các phân tử sinh học.
• Giữa mỗi bước sẽ là bước rửa, Sau bước rửa cuối cùng, cơ chất của enzyme được thêm
vào để tạo ra tín hiệu có thể nhìn thấy, giúp chỉ ra số lượng kháng nguyên trong mẫu.
 IV. KỸ THUẬT ELISA

B. Các loại ELISA:

Hình 5: Phân tích ELISA trực tiếp Hình 6: Phân tích ELISA gián tiếp Hình 7: Phân tích ELISA Sandwich
 IV. KỸ THUẬT ELISA
C. Xét nghiệm Elisa trong chẩn đoán HIV:
• Xét nghiệm ELISA thường là xét nghiệm đầu
tiên được thực hiện trong trường hợp nghi
nhiễm HIV.

• Nếu như xét nghiệm này cho kết quả dương

tính thì cần tiếp tục thực hiện phương pháp
Western blot để xác nhận chẩn đoán.

• Xét nghiệm ELISA cho kết quả dương tính thì

sẽ thực hiện phương pháp xét nghiệm tìm
Hình 8: HIV 1,2 KIT TEST
kháng thể HIV 1/2 để xác nhận nhiễm HIV.
 IV. KỸ THUẬT ELISA
1. Đối tượng cần làm xét nghiệm HIV:
• Người tiêm chích ma túy
• Người thường xuyên quan hệ tình dục không an
toàn, đặc biệt là với người bị nhiễm HIV hoặc
nghi ngờ nhiễm HIV
• Người có nhiều bạn tình
• Những người đã mắc một bệnh lây truyền qua
đường tình dục khác
• Người làm việc trong môi trường dễ bị lây
nhiễm, ví dụ như bệnh viện

Hình 9: Hình thái virus HIV

 IV. KỸ THUẬT ELISA

2. Quy trình thực hiện:

Lấy mẫu máu: Quy trình lấy mẫu máu, gồm có các bước
như sau:
• Buộc dây garo hoặc dây thun quanh cánh tay để làm cho
các tĩnh mạch phồng lên và có thể xác định được dễ dàng
hơn.
• Sau khi xác định được tĩnh mạch thì sát trùng vị trí lấy
máu
• Đưa kim tiêm vào tĩnh mạch và hút lượng máu cần thiết
• Sau khi lấy đủ máu thì tháo dây garo, ấn bông lên vị trí
lấy máu và nhanh chóng rút kim ra Hình 10: ELISA: Xét nghiệm máu chuẩn
đoán HIV
 IV. KỸ THUẬT ELISA

• Làm xét nghiệm: Đối với xét nghiệm ELISA, mẫu máu sẽ được gửi đến phòng thí nghiệm
để phân tích. Kỹ thuật viên phòng thí nghiệm sẽ đưa mẫu máu vào một thiết bị có chứa
kháng nguyên HIV và kháng thể kháng HIV.
• Một loại enzyme sẽ được thêm vào mẫu bệnh phẩm. Enzyme này giúp tăng tốc độ phản
ứng hóa học.
• Nếu máu có chứa kháng thể kháng HIV hoặc kháng nguyên HIV thì sẽ liên kết với kháng
nguyên hoặc kháng thể trong thiết bị.

Nếu điều này xảy ra thì người đó có thể đã bị nhiễm HIV.

 IV. KỸ THUẬT ELISA
4. Kết quả xét nghiệm:
• Nếu kết quả xét nghiệm ELISA dương tính thì có thể người đó đã bị nhiễm
HIV.
• Tuy nhiên, xét nghiệm này có thể cho kết quả dương tính giả, có nghĩa là
dương tính dù người đó không hề bị nhiễm virus
• Ví dụ, khi mắc một số bệnh như bệnh Lyme, giang mai hoặc lupus ban đỏ và
làm xét nghiệm ELISA thì có thể sẽ nhận được kết quả dương tính giả với
HIV.
• Vì lý do này nên sau khi có kết quả xét nghiệm ELISA dương tính thì sẽ cần
thực hiện tiếp các xét nghiệm phức tạp hơn để xác nhận chính xác.
 IV. KỸ THUẬT ELISA
• Đôi khi, xét nghiệm ELISA không phát hiện
được HIV dù người bệnh đã thực sự bị nhiễm
virus.
• Điều này có thể xảy ra nếu tiến hành xét
nghiệm quá sớm và cơ thể chưa sản sinh đủ
kháng thể (để phản ứng với virus).
• Giai đoạn đầu khi mới nhiễm HIV được gọi là
“thời kỳ cửa sổ”, trong đó một người đã bị
nhiễm HIV nhưng xét nghiệm lại cho kết quả
âm tính.
CẢM ƠN THẦY VÀ CÁC
ANH CHỊ ĐÃ CHÚ Ý
LẮNG NGHE