南方医科大学

生物化学与分子生物学实验教学中心
Expertimental Teaching Center of Biochemistry and Molecular Biology

质粒 DNA 的提取、
定量、酶切与 PCR 鉴定

http://jpkc.fimmu.com/sfzx/
 实验目的

 掌握 PCR 基因扩增的原理和操作方法

 掌握碱裂解法提取质粒的方法

 了解紫外吸收法检测 DNA 浓度与纯度的原理、方法

 学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作
 实验流程
PCR 质粒DNA的提取
上
午
质粒DNA的酶切

下
午
琼脂糖凝胶电泳 质粒DNA的定量
（紫外检测）
 上课安排
简述实验内容流程， PCR 操作步骤
↓
煮菌， PCR（ PCR 程序最后设 4℃ 保温）
↓PCR 仪运行约 2 小时
↓ 学习 PCR 原理、质粒 DNA 提取和酶切原理
质粒DNA提取（约 1 小时）
↓
酶切操作
↓ 保温约 1~2 小时
↓ 学习紫外检测定量原理、琼脂糖电泳原理
紫外检测定量
↓
电泳上样（样品：质粒 DNA ， PCR 产物，酶切产
物， Marker ）
↓ 电泳仪运行约 30 分钟
观察电泳结果、记录、拍照、保存
第一部分 聚合酶链式反应

Polymerase Chain Reaction

 定 义
什么是
PCR ？PCR （ Polymerase Chain Reaction ）即聚
合酶链式反应，是指在 DNA 聚合酶催化下，以
DNA 为模板，特定引物为延伸起点，通过变性、
退火、延伸等步骤，在体外复制 DNA 的过程。
 实验原理
加热使模板 DNA
溶液反应温度 在高温下 90℃-95
升至中温
72℃ ，在
变性 变性，双链解链

Taq 酶作用
下，以 dNTP
95˚C
为原料，引物
为复制起点，
模板 DNA 的一 降低溶液温
条单链在解链 度，使合成
和退火之后延 引物在低温
伸为一条双链 （ 35 －
70℃,

延伸 退火 一般低于模
板 Tm 值的
5℃
72˚C Tm-5˚C 左右），与
模板 DNA 互
补退火形成
部分双链
 原理示意图
Template DNA
5 5 Primer 1
5 5 Primer 2
Cycle 1

5
5
5
5

Cycle 2

5 5
5 5
5 5
5 5
 Cycle 3

5 5
5 5
5 5
5 5

5 5
5 5
5 5
5 5

25 ～ 30 次循环后，模板 DNA 的含量可

以扩大 100 万倍以上。
 实验仪器

PCR 仪 (BioRad MJ mini)

小型台式离心机（ Sigma 1-
14 ）
微量加样枪
灭菌的薄壁离心管
 实验材料
1. 菌液：大肠杆菌 DH5a 菌株 ( 含靶基因 CHD5 片段的
pMD18-T)

目的片段
400bp
 实验材料
2. 引物： 正向： 5’ GTA 　 AAA 　 CGA 　 CGG 　 CCA 　 GT 3’
反向 : 5’ CAG 　 GAA 　 ACA 　 GCT 　 ATG 　 AC 3’

3. 2×Premix Taq ：
Taq 酶： 5U/μl
4×dNTP: 各 10mmol/L
10× 缓冲液（ buffer ） : 500mmol/L KCl ， 100mmol/L Tris-
HCl(PH=8.3 ）， MgCl2: 25mM

4. 灭菌去离子水
 实验方法
1 、菌液煮沸 10min, 冷冻，室温解冻后离心取上清
2 、取 0.2 ml PCR 反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂
( 注意每换一种试剂换一个新吸头 )
灭菌去离子水 4.5 l

2×Premix Taq 12.5 l

引物 1-SO100 (10 mol/L) 1.5 l

引物 2-SO101 (10 mol/L) 1.5 l

菌液 5 l
总体积 25 l

如配好的反应液较多沾到管壁上，可将 PCR 反应管置台式离心机中瞬时离心，

使反应液集中于管底，然后将反应管放到基因扩增仪 (PCR 仪 ) 上 .
 实验方法
① 94℃ 预变性 5 分钟后开始以下循环
② 94℃ 30 秒
55℃ 30 秒 25 循环
72℃ 40 秒
③ 72℃ 4 分钟
④ 4 ℃ 保温

实验过程约 1 小时 30 分钟
 实验方法

1 2 3
高温变性 低温退火 适温延伸 重复 1~3 步
94 25~30 轮
温度

72
形成 2 条单链

目的 DNA 片段
（℃）
DNA 变性

扩增 100 万倍以
55 子链延伸 上
DNA 加倍
DNA 单链
22 与引物复性

DNA 双螺旋
1 2 3 4 5
时间（ min ）
 结果分析

 用 1% 的琼脂糖凝胶电泳鉴定 ;
 加 5μl PCR 产物进行电泳 ;
 预期 PCR 产物大小约 400bp;
第二部分 质粒 DNA 提取与定量
Extraction and Quantitation of Plasmid DNA
 定 义
质粒（Ｐ lasmid ） • 独立于细菌染色体外，能
独立自主复制的闭合环状
DNA 分子；

• 存在于细菌，放线菌，真
菌以及一些动植物细胞中，
在细菌细胞中最多．
 方 法

 碱裂解法 • 选择哪一种方法主要取决以下

 煮沸裂解 几个因素：

 羟基磷灰石柱层析法  质粒的大小
 质粒 DNA 释放法  大肠杆菌菌株

 酸酚法等  裂解后用于纯化的技术和实验要求
 基本步骤

 分离质粒 DNA 的方法都包括 3 个基本步骤：

• 培养细菌使质粒扩增；
• 收集和裂解细菌；
• 分离质粒 DNA 分离质
质粒 粒 DNA
扩增
三步曲
收集
裂解
细菌 分离
质粒
 基本原理
1 、碱裂解
法
基于染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性的差异；

高碱性条件下，染色体 DNA 和质粒 DNA 变性；

当以高盐缓冲液调节其 pH 值至中性时，变性的质粒
DNA 复性并保存在溶液中，染色体 DNA 不能复性而形成缠
连的网状结构，通过离心形成沉沉淀去除；
 基本原理
2 、离心层析
柱
 硅基质膜在高盐、低 pH 值状态下
选择性地结合溶液中的质粒
DNA ，不吸附蛋白质、多糖等物质；
 通过去蛋白液和漂洗液将杂质和
其它细菌成分去除；
 低盐，高 pH 值的洗脱缓冲液将纯
净质粒 DNA 从硅基质膜上洗脱；
☆ 原理示意图
 仪器材料
（一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅
（二）材料：含 pMD18-T 质粒的大肠杆菌 DH5α
（三）试剂：
 LB 培养基（液体、固体）
 AXYGEN 试剂盒质粒提取试剂盒（爱思进，中国）
• 溶液 P1 （ S1)
• 溶液 P2 (S2 ）
• 溶液 P3 （ S3 ）
• 去蛋白液
PE （ W1)
• 漂洗液 WB(W2 ）
• 洗脱液
EB （ Eluent)
 提取质粒 DNA 操作步骤
1. 取 1.5ml 培养物加入 Eppendorf 管中
2. 13000rpm×1min ，弃上清
3. 加入 250μl 溶液 S1 ，吹打，使细菌沉淀分散，彻底悬浮。
4. 加入 250μl 溶液 S2 ，颠倒 4 ～ 6 次混匀（不要剧烈振荡），
直到溶液变得清亮 .
5. 加入 350μl 溶液 S3 ，立即温和混匀 6~8 次。 13000rpm 离心
10min ，小心取上清液（ 700μl ）。
6. 将吸附柱放于收集管中，将上一步所得上清液加入吸附柱中，
13000rpm 离心 3min ，弃滤液。
7. 加入 500μl 去蛋白液 (W1) ， 13000rpm 离心 1min ，弃滤液，
8. 向吸附柱中加入 700μl 漂洗液 W2 ， 13000rpm 离心
1min ，弃滤液。
9. 重复步骤 8 一次。
10.空柱 13000rpm 离心 1min ，然后室温放置 3min ，使残留乙
醇挥发。
11.取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加
50μl 洗脱缓冲液 (Eluent) ，室温放置 1min ， 13000rpm 离心
1min 洗脱质粒 DNA ， 保留备用。
 结果分析

 用 1% 的琼脂糖凝胶电泳鉴定 ;
 加 5μl 质粒 DNA 进行电泳 ;
 预期质粒 DNA 大小约
3000~5000bp;
 常见问题
问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？
原 1. 请涂布平板培养后，重新挑选
新菌落进行液体培养
因
2. 可减少菌体用量或增加溶液的
1. 菌体老化 用量
2. 碱裂解不充分 3. 不要频繁转接，每次接种时应
对 接种单菌落。检查抗生素使用
3. 菌体中无质粒
策 浓度是否正确。
4. 溶液使用不当
4. 溶液Ⅱ在温度较低时可能出现
浑浊，置于 37℃ 保温片刻直
至溶解为清亮的溶液。
 常见问题
问题二：质粒纯度不高，如何解决？

原因 1. 不要使用过多菌体。重新纯化
DNA ，去除蛋白、多糖、多酚
等杂质
1. 混有蛋白
2. 加入 RNaseA 室温放置一段时
2. 混有 RNA 对 间
3. 混有基因组 DNA 策 3. 加入溶液 II 和 III 后防止剧
烈振荡，可能把基因组 DNA 剪
切成碎片从而混杂在质粒中。
细菌培养时间过长会导致细胞
和 DNA 的降解，培养时间不要
超过 16 小时。
 紫外光吸收法定量检测
原理：
1. 物质在光的照射下会产生对光的吸收效应
2. 物质对光的吸收是具有选择性的
3. 各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱

因此不同波长的单色光通过溶液时其光的能量就会被
不同程度的吸收，光能量被吸收的程度和物质的浓度
有一定的比例关系 .
 计算方法

• 因为组成核酸的碱基 (G,A,T,C ）在 260nm 处具有强吸

收峰，所以通过测定 260nm 的吸收峰即可对 DNA 进行定
量。

dsDNA( 双链 DNA) 1OD260 = 50μg/ml

ssDNA( 单链 DNA) 1OD260 = 33μg/ml
RNA 1OD260 = 40μg/ml
 实验方法
1. 记录 OD260 值，通过计算确定 DNA 浓度，公式如下 :

质粒 DNA(g /ml)=50×(OD260) × 稀释倍数 ( 2 微升

稀释至 100 微升 )

 注意 : 我们接下来要用的 eppendorf 公司生产的紫外分光

光度计 , 会根据样品的稀释倍数自动算出质粒 DNA 的最终
浓度和 Ratio 值 .
 实验方法
2. 根据在 260nm 以及在 280nm 的读数比值估计核酸
的纯度（ Ratio=A260/A280 ）

• Ratio= 1.8 DNA 样品较纯 , 符合实验要求

• Ratio ＞ 1.9 RNA 污染
• Ratio ＜ 1.6 有蛋白质或其它杂质的污染
 实验仪器
核酸蛋白检测仪 (Eppendorf BioPhotometer plus)

比色杯
 数据处理

测量次数 质粒 DNA 浓度 Ratio 值

(μg/ml) (A260/A280)

平均值
定量检测
 第三部分 酶切鉴定

DNA Restriction Enzyme Digestion

 限制性内切酶
 限制性内切酶（ restriction
endonuclease ）是 DNA 操作过
程中所使用的基本工具。
 特异性地结合于一段被称为限
制酶识别序列的特殊 DNA 序列
之内或其附近的特异位点上，
并在此切割双链 DNA 。
 分子克隆中常用的为 II 类限制
酶，其识别位点长度为 4 、 5 或
6 个核苷酸的反向重复序列。
 限制性内切酶
★ 平末端

在识别顺序的中心对称轴处切割

5’ G-G-C-C 3’ 5’ G-G -C-C 3’

HaeIII
3’ C-C-G-G 5’ 3’ C-C -G-G 5’
 限制性内切酶
★ 3’ 端粘性末端

在识别顺序的双侧末端切割 DNA 双链，于对称轴的 3’ 末端切割。

5’ G-G-T-A-C-C 3’ G-G-T-A-C 3’ C
Kpn I
3’ C-C-A-T-G-G 5’ C 3’ C-A-T-G-G
 限制性内切酶
★5’ 端粘性末端

在识别顺序的双侧末端切割 DNA 双链，于对称轴的 5’ 末端切割。

5’ G-A-A-T-T-C 3’ EcoRI G 5’ A-A-T-T-C

3’ C-T-T-A-A-G 5’ C-T-T-A-A 5’ G

5’ A-A-G-C-T-T 3’ HindIII A 5’ A-G-C-T-T

3’ T-T-C-G-A-A 5’ T-T-C-G-A 5’ A
 限制性内切酶

双酶切限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切
效率高的限制酶，提前看好各公司的双切酶所用公用的 BUFFER

如果有一种 buffer 能同时使 2 种酶的活力都超过 70% 的话，就

可以用这种 buffer 作为反应 buffer ；

如果两种酶厂家不同无法查时可比较其 buffer 成份，相似的话

可以考虑各取一半中和；
Buffer 的选择查阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在
不同 buffer 中的活力表
 限制性内切酶
酶量的选择任何时候 2 种酶的总量不能超过反应体系的 1/10 体积，
而且最大反应体系最好不要小于 20 ul 。

以 TAKARA 的为例，其对 1 单位酶的定义如下：在 50 μl 反应液中，

30℃ 温度下反应 1 小时，将 1 μg 的 λDNA 完全分解的酶量定义为
1 个活性单位 (U) 。 而该酶浓度约为 15 单位 / 微升，可分解 15μg
的 DNA 。
 限制性内切酶
影响酶切反应的因素

 底物 DNA 的纯度：主要污染 DNA 的某些物质，如酚、氯仿、乙醇

等 均能抑制酶反应 ;
 反应系统：主要是反应缓冲液中的离子强度 , 如 NaCl 和 Mg2+, 合
适离子强度可以激发酶切反应 ;
 反应体积：一般应尽量小，且酶切反应中甘油浓度应低于 5%;
 保温时间与温度：温度改变会使酶识别错误 ;
 实验材料
1. 菌液：大肠杆菌 DH5a 菌株 ( 含靶基因 CHD5 片段的
pMD18-T) 酶切位点

目的片段
酶切片段大小为 ? 酶切位点
400bp
 反应体系
在一个洁净的 1.5mlEP 管中按顺序依次加入下述试剂
试剂名称 体积 (µl)
无菌水 9.0
10×R+BSA 酶切缓冲液 2.0
质粒 DNA 7.0( 约 500ng)
Hind III (15U/ul) 1.0
EcoR I (12U/ul) 1.0
总体积 20.0

 移液枪轻轻混匀 ( 避免产生气泡 ),37℃ 水浴 1.5h

 结果分析

 用 1% 的琼脂糖凝胶电泳鉴定 ;
 加 5μl 酶切产物进行电泳 ;
 预期酶切产物有大小两片段，小片
段约 400bp;
第四部分 琼脂糖凝胶电泳
DNA Agarose Gel Electrophoresis
 实验原理
 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的
滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度

 DNA 分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正
极泳动 .

 DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效
应。不同的 DNA ，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动
率就不同，从而分出不同的区带 ( 迁移速度与分子量的对
数值成反比关系 ).
 影响迁移速率因素

1 、 DNA 的分子大小
2 、 琼脂糖浓度
3 、 DNA 分子的构象
4 、 电源电压
5 、 嵌入染料的存在
6 、 离子强度影响

质粒电泳速度：超螺旋 > 线状 > 开

环
 分离范围
琼脂糖凝胶浓度与 DNA 分子的有效分离范围
线性 DNA 分子大小
胶浓度（％）
（ kb ）
0.3 5 ～ 60
0.6 1 ～ 20
0.7 0.8 ～ 10
0.9 0.5 ～ 7
1.2 0.4 ～ 6
1.5 0.2 ～ 4
2.0 0.1 ～ 3

本次电泳使用 1.0% 琼脂糖凝胶

 实验仪器

琼脂糖水平电泳槽（ DYCP-31BN
型）
电泳仪（ DYY － 6C 型）
凝胶成像系统（ Tanon 1600 ）
 实验材料
1. 琼脂糖
2 ． Gelview ( 核酸染料 )
3 ． TBE
4 ．电泳缓冲液： 0.5×TBE

5 ． 6×loading Buffer( 加样缓冲液）：含电泳指示剂、

比重物质、缓冲液
6 ． DNA Marker 5000
7 ．样品： PCR 产物、质粒 DNA 、酶切产物
 实验材料

常用核酸染料

 溴化乙锭 (EB) :3,8- 二氨基 -5- 乙基 -6 苯基菲啶溴盐 ) ，

可与 DNA 结合 , 在紫外光照射下呈现红橙荧光 , 有致癌性 .

 Gelview: 是一种新型核酸染料 , 可与 DNA 分子形成复合物，

能产生极强的荧光信号，其灵敏度比 EB 高 , 且荧光强度与
DNA 含量成正比荧光 , 在紫外光照射下呈现绿色荧光 .
 实验材料
电泳缓冲液
工作液
1×TAE

0.5×TBE
 实验材料
6×loading buffer
电泳指示剂：
1. 溴酚蓝，电泳中呈现蓝色
条带，位置大约相当于
甘油 300bp 的 DNA 。
二甲苯青 2. 二甲苯青，电泳中呈现绿
溴酚蓝 色条带，它携带的电荷量比
溴酚蓝少，相当于 4000bp
左右大小 DNA 的位置。
 实验材料
DNA Marker
是分子量不同的 DNA 片段，主要用途就是 DNA 分子凝胶电
泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题。

 应选择在目标片段大小
附 近 ladder 较密的
marker ，这样对目标片段大
小的估计较准确。
 实验步骤 电压： 80~120V
时间： 15~30 分钟

凝胶准备 胶床准备 铺胶 静置

拔梳子 胶床置于电泳槽中 加电泳缓冲液 上样

电泳 取出凝胶 凝胶成像系统观察结果
 注意事项

• 倒胶时把握好胶的温度，不要高于 60℃ ，否则温度太高会

使制板变形
• 胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄
坏点样孔
• 电泳前，确认样品孔位于电场负极；
• 点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多
• Geldview 有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱
扔
• 紫外线照射不要太久
 上样
• 每排样品孔预留第一个孔，最后加 DNA Marker5000
• 每组加 3 个样品孔，记住位置

• 第一孔： 5 μl 质粒 DNA + 1μl 6×loading buffer 混匀

后上样
• 第二孔： 5 μl 酶切产物 + 1μl 6×loading buffer 混
匀后上样
• 第三孔： 5 μl PCR 产物直接上样
观察电泳结果
 预期实验结果
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

5000 bp
3000 bp 酶切长片段
2000 bp
1500 bp
1000 bp
750 bp
500 bp 含目的 DNA 片
250 bp
100 bp 段的酶切短片
段

M: DL5000 DNA Marker

1, 4,7,10 为质粒
2, 5,8,11 为 PCR 目的条带
3, 6,9,12 为酶切片段
 思考题

1. 碱法提质粒中溶液 I 、 II 、 III 的作用？

2. 结合实验情况，如何提高限制性酶切的反应效率？

上交实验报告网址：
http://192.168.176.250/rar/