A DNS szerkezete és replikációja

Az örökítő anyag, - a DNS - szerkezetét és működésmódját

1953-ban írta le James Watson és Francis Crick.

Munkájukat a következő előzményekre alapozhatták:

- Az egyes tulajdonságokat öröklődő részecskék (gének) alakítják ki.

(Mendel)
- A gének fehérjék szerkezetét befolyásolják,egy gén ~ egy enzim.
(Beadle és Tatum).
- A gének kromoszómákon vanak (Bridges).
- A kromoszómák DNS-ből és fehérjékből állnak.
- Az örökítőanyag a DNS.
 A transzformáció felfedezése
Frederick Griffith kísérlete, 1928

R törzs S törzs

A Streptococcus pneumoniae virulens, S törzsével beoltott egerek

tüdőgyulladásban elpusztulnak, az R törzzsel beoltottak túlélnek.
 A transzformáció felfedezése
Griffith kísérlete, 1928

A hővel kezelt S törzs nem pusztítja A hővel elölt S baktériumok és az élő nem-
el az egereket. virulens R baktériumok keverékével beoltott
egerek elpusztulnak.

Az utolsó kísérlet döglött egereiből élő S baktériumok tenyészthetők ki.

Az elölt baktériumok anyagából valami az R baktériumokat S-é alakította át
(transzformálta).
 A genetikai anyag a DNS.
O. Avery, C.M. Mac Leod és M. McCarty kísérlete, 1944

A DNS a transzformáló anyag. Az S sejtekből kivont anyagokból egyedül a

DNS az, amivel az R sejtek S formává alakíthatók.

A DNS transzformáló képessége igazolta először,

hogy a gének DNS-ből állnak.
 A Hershey-Chase kísérlet, 1952

A radioaktivitás a
leváló üres fág fejekben
észlelhető.

jelölt fehérje
elválasztás

A radioaktivitás a
jelölt DNS baktériumokban észlelhető,
elválasztás
majd a következő
fág generációban is
megjelenik.

A Hershey-Chase kísérlet igazolta, hogy a fágok örökítő anyaga a DNS nem pedig a
fehérje. A kísérlet kétféleképpen előkészített T2 fágot használt. Az egyik esetén a
fehérje burkot radioaktív kénnel (35S) jelölték. A kén nem fordul elő a DNS-ben. A
másik esetben radioaktív foszforral (32P) a DNS-t jelölték. A foszfor nem fordul elő a
fehérjében. Csak a 35P injektálódott az E.coli-ba, jelezve, hogy a DNS az a
szükséges anyag, ami az új fágok létrejöttéhez szükséges.
 Mit kell „tudnia” a genetikai anyagnak?

1., Rendelkeznie kell az információ tárolásának képességével.

2., Képesnek kell lennnie ezen információt pontosan megkétszerezni

és továbbadni.

A DNS ismert kémiai szerkezete túlságosan egyszerű felépítésűnek tűnt

ahhoz, hogy a fenti feladatoknak megfelelhessen.
A DNS kémiai összetevői
 A DNS kémiai összetevői

A DNS kémiai felépítésének alapegysége a nukleotid.

A nukleotid foszfátot, deoxiribóz cukrot és négy szerves bázisból
egyet tartalmaz.
A négy bázis az adenin, a guanin, a citozin és a timin.
A cukor és a bázis alkotta egység a nukleozid: deoxiadenozin,
deoxiguanozin, deoxicitidin, deoxitimidin.
A nukleotidok teljes kémiai neve: rövidítése
deoxiadenozin 5’-monofoszfát, dAMP -A
deoxiguanozin 5’-monofoszfát, dGMP -G
deoxicitidin 5’-monofoszfát, dCMP -C
deoxitimidin 5’-monofoszfát, dTMP -T
 A Chargaff szabályok (1955)

Kölönböző élőlényekből kivonható DNS összetételének vizsgálata érdekes

törvényszerűségeket tárt fel. A törvényszerűségeket Erwin Chargaff ismerte
fel:

1. Az élőlényekből származó DNS-ekben a pirimidin nukleotidok (T + C)

mennyisége egyenlő a purin (A + G) nukleotidok mennyiségével.

2. A T mennyisége egyenlő az A-val, és C mennyisége egyenlő G-vel.

Azonban A + T és C + G mennyiségek nem feltétlenül egyenlők, azok aránya

jellemző az élőlényre amiből a DNS származik.
Példák a Chargaff szabályokra
A DNS röntgen diffrakciós képe
(R.Franklin és M.Wilkins, 1953)
 A DNS (B forma) röntgen diffrakciós képe
(R.Franklin és M.Wilkins, 1953)

A röntgen diffrakcióval kapott adatok azt jelezték, hogy

- a molekula fonálszerű,
- a fonál két párhuzamos szerkezetből áll.
- egyenletes átmérőjű,
- spirál alakú.
 A DNS térszerkezetét Watson és Crick oldotta meg
l953-ban.

A modell kidolgozása során merészen összeillesztették a röntgen diffrakciós adatokat, a

Chragaff szabályokat és a DNS és alkotórészeiről felhalmozódott kémiai ismereteket
olymódon, hogy a modell eleget tehessen az örökítőanyag által támasztott
követelményeknek.
 A kettős spirál szalag modellje

A kettős spirál egyszerűsített képe. A pálcák

a bázispárokat képviselik. A szalagok a két
antiparallel lánc cukorfoszfát gerincét
képviselik. A méretek angström-ben (1Å =
0,1 nm) mutatják a távolságokat.

A spirál 10 bázisonként fordul csaknem

pontosan 360o-ot.
 A kettős spirál jellemzői

- A nukleotidok szabályosan ismétlődő távolságokban

egymás felett helyezkednek el.

- A nukleotidok lapos molekuláinak síkja merőleges

a szál hossztengelyére.

- A DNS tér-modell két ellentétes polaritású, u.n.

antiparallel szálból épül.

- A modell egyenletes átmérője a Chargaff szabályok követésével

biztosítható úgy, hogy purin bázissal pirimidin bázis áll
szemben. Ezeket egymáshoz hidrogén hidak rögzítik.
 A kettős spirál kémiai szerkezete

A modellben a víztaszító
bázisok belül, a cukor és
foszfát csoportok kívül
helyezkednek el.

Minden bázispár egy purint,

(A vagy G) és egy pirimidint,
(T vagy C) tartalmaz.

Az A-T párt 2, a G-C párt 3

hidrogénhíd stabilizálja.

Az antiparallel irányultságot a
cukor 5’ 3’ iránya adja.
 Lehetséges bázis párosodás a kettős spirálban

Csak a purin - pirimidin párosodás felel meg a DNS szál röntgennel

meghatározott átmérőjének.
Ugyancsak ez a kombináció felel meg Chargaff első szabályának.
 A bázis párosodás módja
A négy lehetséges purin-pirimidin bázispárból (A-T, A-C, G-C, G-T) csak kettő, az A-T és a
G-C felel meg Chargaff második szabályának.
Watson és Crick kimutatta, hogy csak az A-T és G-C bázispárok képesek hidrogén
hidakkal a modellbe beillő módon összekapcsolódni.

A modell azt jósolja, hogy a nagy G-C tartalmú DNS stabilabb a nagy A-T
tartalmúnál. Ez a jóslat beigazolódott.
 A DNS kettős spirál térkitöltő modellje

A bázisok szoros egymásra fekvése a víz

kiszorítása által erősen stabilizálja a

nagy árok
szerkezetet.

A három dimenziós szerkezet jól szemlélteti

az egymással ellentétes oldalon futó kis és a
nagy barázdát.

kis árok
A DNS-kötő fehérjék csak a barázdákban
kapcsolódhatnak a bázisokhoz.
 A DNS többféle formát vehet fel

Az élőlényekben és vizes
oldatban a „B” forma a A B Z
leggyakoribb, ebben a
bázisok síkja majdnem
merőleges a cukor-foszfát
gerincre.
Dehidrált körülmények
között egy tömörebb „A”
forma jön létre, melyben a
bázisok síkja megdől.
Hosszú GCGCGC....
ismétlődések a Z formát
vehetik fel, amely
balmenetes, zegzugos
lefutású és megnyúlt.
 A B forma létra modellje

A „B” forma részletes

térszerkezetén jól látszik, hogy
a bázispárok létrafokként
helyzkednek el a szerkezet
belsejében. A cukor gyűrű
síkja majdnem merőleges a
bázisok síkjára.
 A DNS replikáció jóslata

A DNS kettős spirál szerkezetéből közvetlenül

adódik a megkettőződés mikéntje.

A bázis párosodás szigorú törvényéből az

következik, hogy amennyiben a kettős spirál két
szála zipzárként kettéválik, mindkét szál mintaként
(templátként) szolgálhat egy új szál szintéziséhez,
melynek során az eredeti szállal és egymással
megegyező szerkezetek jönnek létre.

Ezzel magyarázatot nyer a mitózis jelensége, az

örökítőanyag pontos átadása.

A genetikai kódot a nukleotid sorrend adhatja.

A DNS elméletileg lehetséges replikációs módjai.

szemikonzervatív

konzervatív

diszpezív

A régi szál sötét színű, az újonnan szintetizált világos.

 A Meselson-Stahl kísérlet (1958)

A több generáción keresztül 15N táptalajon tartott baktériumokból származó DNS

nehéz sávot ad céziumklorid gradiens centrifugálással. A normál (14N) táptalajon
nevelt baktériumok DNS-e pedig könnyű sávot ad. Ha a 15N-en tartott sejteket
átteszik könnyű táptalajra, az első nemzedékben köztes, a második után könnyű és
köztes sáv figyelhető meg a grádiensben.
 A Meselson-Stahl kísérlet
értelmezése

A Meselson-Stahl kísérletben kapott

eredmények csak a
szemikonzervatív DNS replikációval
értelmezhetők :
Az első nemzedékben egyetlen sáv,
a második nemzedékben egy
köztes és egy könnyű sáv.
 DNS replikáció magasabb rendűekben is szemikonzervatív
Herbert Taylor 1958

Egy sejtgeneráció hosszan

triciált (3H) timidint tartalmazó
tápoldatban tartott sejtek a
DNS-t beépítik az új láncba, amit
a kromoszómák autoradiogramja
is jelez.
Ezután nem-radioaktív timidint
tartalmazó médiumba áttéve egy
újabb replikáció után az
autoradiogramon csak az egyik
testvér kromatida jelölődik.
Minden pont egy radioatív
részecske útját jelzi.

Az események DNS szintű

ábrázolása:
 Harlequin (bohóc) kromoszómák

A BUdR (Bromodeoxyuridin) egy timin

analóg, DNS-be épülése esetén a
kromoszóma bizonyos festékekkel
halványabban festődik.

jól festődő gyengén festődő

hibrid szál BUdR tartalmú szál.
 Harlequin (bohóc) kromoszómák

A nyilak testvér kromatid kicserélődést jeleznek, melynek nincs genetikai következménye.

A DNS replikációja
 A coli DNS replikációja, a replikációs villa (1963)

Replikálódó E.coli
táptalajhoz 3H timidint
adva a DNS-be beépült
radiaktivitás a hibrid
szálak autoradiogramján
kimutatható.

villa
A következő replikációs
ciklus során a képződő új
szál mindkét szála jelölt
lesz.

Theta () szerkezet

A DNS replikáció mechanizmusa
A replikációs villa
 A DNS polimerázok működése

dATP
+
dGTP DNS polimeráz új DNS
templát + primer + + szál
(minta) (indító) dCTP
+
dTTP

A DNS polimerázok az egyes szálú DNS templátra azt kiegészítő

(komplementer) szálat szintetizálnak a rendelkezésre álló nukleotid
trifoszfátokból. A szálat azonban elkezdeni nem tudják, csak
hosszabbítani. A kezdéshez egy rövid kezdő (templát) szakaszra van
szükségük.
A DNS polimeráz lánc hosszabbítása
primer t
strand
e
m
A DNS polimeráz az új nukleotid p
5’ szén atom
 foszfátját a lánc végén lévő l
cukor 3’ OH csoportjához a
kapcsolja. Ezzel az új lánc 3’ szén atom
5’ 3’ irányban t
hosszabbodik. e

s
t
r
a
a lánc hosszabodás iránya
n
d
Mozi 1
 Az E. coli replikációs kezdőpontja (origó).

A replikációnak kitüntetett kezdőpontja (origója) van. Az E.coli replikációs origója, az oriC,

245 nukleotidpár hosszú. Közel azonos 13 nukleotid hosszú sorrendek tandem
ismétlődéseit, és négy kötőhelyet tartalmaz a dnaA fehérje számára. A dnaA fehérje kötése
hatására a DNS helikáz a két szálat elkezdi széttekerni.
 Cirkuláris DNS kétirányú replikációja.

széttekeredő
szálak (helikáz)
origó

A széttekeredő szálak mindkét villájában folyamatos a DNS szintézise,

amíg a gyűrű megkettőződése be nem fejeződik.
 A replikáció az origótól mindkét irányban halad.

origó
villa villa

Az origótól két irányba haladó DNS replikáció összesen négy újonnan

szintetizálódó szálat jelent. Ehhez négy kezdő primer szükséges.
 A DNS szintézis kezdése (priming)

A DNS szintézist egy rövid RNS

primer szintézise előzi meg, melyet az
RNS polimeráz (primáz) készít.
A primáz egy fehérje komplex része,
amelyet primoszómának neveznek.

A szintézis iránya az egyik primáz

szálon a villa felé mutat, RNS
a másik szálon a villától primer
távolodik. szintézis
irány

RNS primer
 Vezető szál, elmaradó szál

Az elmaradó szál szintézise:

régi szál régi szál

elmaradó szál 1.,

RNS primer
vezető szál

a villa mozgása 2.,

Okazaki
új DNS
fragment
A vezető szál szintézise folytonos.
Az elmaradó szálon:
1., A primáz RNS templátokat szintetizál. 3.,
2., A DNS polimeráz III DNS-t szintetizál
a primer folytatásaként.
3., A DNS polimeráz I eltávolítja az előtte
lévő RNS darabot és befejezi a láncot.
4., A DNS ligáz összekapcsolja a különálló
4.,
DNS darabokat. ligálás
A replikáció az Okazaki fragmentekkel és a ligázzal

A ligáz működése:

ligáz + ATP
 A polimerázok aktivitása

Az E.coli DNS replikációjában két polimeráz vesz részt:

A DNS polimeráz III (pol III) végzi a replikációs szintézist.
a DNS polimeráz I (pol I vagy Kornberg enzim) elemészti az RNS
primereket és befejezi a lemaradó szál szintézisét.

pol I pol III

5’->3’ polimerizáció + +
3’->5’ exonukleáz (hibajavítás) + +

5’->3’ exonukleáz + -
molekula/sejt 400 10
 A szintézist egyetlen polII dimer végzi.

pol III dimer

vezető
szál
lemaradó
szál

Az elmaradó szál templátjának kihurkolódása lehetővé teszi, hogy a replikációs villához

kapcsolódó pol III holoenzim-dimer mindkét utódszálat a villa irányában
szintetizálhassa.
Mozi 2
 A DNS replikáció enzimei

topoizomeráz

A topoizomeráz a szál kitekerése hatására a villa túloldalán felhalmozódó

torziós feszültséget (csavarodást) csökkenti olymódon, hogy az egyik szálat
elvágja, azt a másik szál körül „kipörgeti”, majd a vágást vissza-ligálja.
 Helikázok és topoizomerázok

A topoizomeráz hatása a replikáció során. Ahogy a replikációs villában

szétválnak a szülői szálak, a villa előtti szakasz pozitív irányban túltekeredik. A
topoizomeráz oldja fel a feszültséget, mint egy forgó-láncszem.
 Helikázok és topoizomerázok

A helikázok ATP felhasználással felbontják a

hidrigén hidakat és széttekerik a DNS-t.

A topoizomerázok a kettős szálú DNS

csavarodottságát befolyásolják.

A replikációnál működő DNS topoizomeráz neve

giráz, amely negatív irányban csavarja a DNS-t. A
pozitív irányban megcsavarodott DNS így
kilazulhat.
A giráz a laza DNS-t ATP felhasználásával képes
negatív irányban tovább is csavarni.
 A pontosság biztosítása, szerkesztés

szintézis iránya 5’ 3’ kivágás iránya 3’ 5’

A pol III α–ε (alfa-epszilon) komplex szerkesztés ellenőrzése. A pol III ε

alegysége végzi annak ellenőrzését, hogy nem történt-e hiba a szintézis
során. A hibásan beépített (rosszul párosodó) nukleotidokat azonnal
kivágja.
 Miért nem lehet a szintézis iránya 3’->5’ ?

Ha a relikáció iránya 3'-5' lenne, akkor a

szintézis során a lánc végén mindig az
utolsó nukleotid szabad trifoszfátját
találnánk. Mindig ehhez kapcsolódna a
következő nukleotid 3' OH csoportja.
elképzelt
Ebben az esetben azonban egy láncvégi hibajavító
(5' végi) hibajavító hasítás egy szabad 5’ hasítás
végi OH csoportot eredményezne
monofoszfáttal. Ehhez a következő
nukleotid – trifoszfát hiányában -
képtelen lenne kapcsolódni, ami
megszakítaná a lánc növekedését, és elképzelt
pusztuláshoz vezetne. 3’ 5’
szintézis
irány
 Az eukarióta kromoszóma sok replikációs origót tartalmaz

Egy diploid sejt 3H timidin beépülésének képe a szintézis fázis elején.

Drosophila politén kromoszóma 3H timidin beépülésének képe a szintézis fázis

elején. A radioaktív jelek replikációs origókat jelölnek.
Mozi 3
 A gének a DNS darabjainak felelnek meg

Először fágban sikerült

igazolni, hogy a genetikai
térkép azzal megegyező
sorrendű DNS daraboknak
felel meg.
A λ DNS lineáris a fágban,
de ha a gazda sejtbe jut, a
replikáció vagy a beépülés
előtt körkörössé válik.
A cirkularizáció az egyszálú
komplementer (ragadós =
cos) végek
összekapcsolódásával
történik.
 A λ DNS fele a fág genetikai térkép egyik felének
információját tartalmazza.

A középen kettétört λ DNS darabjainak különbözik az A-T, G-C aránya, ezért azok fajsúly
alapján ketté választhatók. Az elválasztott karok azután marker-menekítési kísérletben
használhatók. A λ genetikai térkép egyik oldalán elhelyezkedő mutáns gének csak az
egyik karral menekíthetők, míg a másik oldaiak a csak másik karral menekíthetők.
(A DNS-t kompetens sejtbe transzformálják, majd a sejteket mutáns fágokkal fertőzik.)
 A λ cos végei affinitás kromatográfiára használhatók.

A fág DNS molekula egyik ragadós vége felhasználható a másik ragadós vég és
az ahhoz kapcsolódó gének „kihalászásához”. A λ DNS egyik karját
kromatográfiás hordozóhoz kapcsolják úgy, hogy a ragadós végek
hozzáférhetőek maradjanak. Minden komplementer véget tartalmazó DNS
hozzákapcsolódik a hordozóhoz a kromatográfia során. Később a kihalászott
DNS darabok hő-denaturálással leoldhatók az oszlopról.
 A gének sorrendje a DNS-en = a gének sorrendje a
géntérképen.

Rögzített ragadós végekkel egyre kisebbre aprított λ DNS darabokat halászva, a

marker menekítési kísérletben a gének a genetikai térképnek megfelelő
sorrendben tünnek el. A legkisebb darabok már csak a genetikai térkép legvégén
lévő géneket tartalmazzák.