KIM622-PROTEOM ANALİZİ

FİNAL ÖDEVİ

DERS SORUMLUSU : PROF. DR. ADİL DENİZLİ

HAZIRLAYAN : ESİN BUZ
 Termofilik bir ökaryotta yapısal proteomik ile protein topluluklarını
yakalama July 25, 2017

Özet:
Proteinlerin kompleksler halinde düzenlenmesi birçok hücresel işlevi görebilmek için
topolojisinin sistematik olarak izole edilmesi gerekmektedir. Burada, ökaryotik bir termofilin
olan Chaetomium thermophilum'un ham hücresel özlerinin, hücresel organizasyonun temel
ilkelerini koruduğunu göstermekteyiz. Yapısal proteomik yaklaşım kullanarak, aynı anda
hücredeki bulunma oranı ve etkileşimlerini göstereceğiz.

Proteinlerin kompleksler halinde gruplandırılmasına ek olarak, hücre içi fonksiyon, çoklu ve

zamansal olarak etkileşime giren makromoleküler kompleksleri veya protein topluluklarını içeren
başka bir organizasyon katmanı gerektirir. Ayrıca bu üst düzey proteom organizasyonunu
kavramak için deneysel yaklaşımlar hala eksiktir.
Hücrenin moleküler makineleri olarak, protein kompleksleri çoğu biyolojik sürecin temel taşlarıdır ve
proteom organizasyonunun en küçük, temel fonksiyonel ve yapısal birimleridir.  Kapsamlı proteom
çapında ki taramalar, protein komplekslerinin kapsamlı repertuarlarını tanımlamış ve moleküler
bileşimleri ve anatomileri hakkında bilgi sağlamıştır.

Buradaki amaç, daha geçici, daha yüksek dereceli ilişkileri yakalamak ve doğal hücresel durumu taklit
eden koşullar altında ökaryotik bir proteomun işlevsel organizasyonunu karakterize etmektir. Bunun için
termofilik mantar C. thermophilum'dan tek aşamalı analitik boyut dışlama kromatografisi ile basit ve
ham hücresel fraksiyonlar (basitleştirilmiş hücre lizatları) elde edilmiştir 

Birlikte yıkanan proteinleri, kompleksleri karakterize etmek için ilk önce bu fraksiyonları biyolojik üç
kopya halinde etiketsiz kantitatif sıvı kromatografi-kütle spektrometrisi (LC-MS/MS) ile analiz edilmiştir.

Kesin olarak spesifik ve yüksek oranda yeniden üretilebilir hücresel fraksiyonlara atanan C.
thermophilum protein topluluklarının bu özeti, yapısal biyologlar için önemli bir kaynağı temsil eder.
( Ek Şekil S10 ). Yalnızca geçici ilişkileri göstermekle kalmaz, aynı zamanda şimdiye kadar anlaşılması
zor olan bilinen komplekslerin alt birimlerini de tanımlar. 
Deneysel tasarımımız, özellikle protein-protein etkileşimlerinin parçalanmasını ve ilgili ayırma koşullarını
en aza indirgemek için termofilik bir organizma seçimimiz, özellikle daha yüksek moleküler ağırlıklı
türlerin tanımlanmasını desteklemektedir.

Bu tür örneklerin karmaşıklığıyla başa çıkmak için elektron mikroskobu(EM) ile kütle spektrometrisi (MS)
ve hesaplamalı modelleme yaklaşımlarını birleştirdik. Çeşitli protein topluluklarını yakalayan bir ağ
hesapladık ve daha fazla analiz için kullanışlı olduğunu gösterdik. Yaklaşımımızı doğrulamak için çapraz
bağ-kütle spektrometrisi (XL-MS) ve EM kullandık. Sonuçta ham hücresel özlerin proteom
organizasyonunun temel ilkelerini koruduğunu göstermiştir. Ayrıca yüksek çözünürlüklü kriyoEM
analizlerine uygundur.

SONUÇ :

Termofillerdeki protein etkileşimleri, mezofilik muadillerine kıyasla daha yüksek stabiliteye sahiptir. Bu
yüzden termofilik ökaryot, Chaetomium thermophilum'u, yapısal olarak gelecek vaat eden bir model
organizma olduğundan ötürü kullandık.
Hücre dizilerinden protein komplekslerini karakterize etmek için kapsamlı, çok boyutlu
fraksiyonlamaya dayalı büyük ölçekli analizler uygulanması, biyokimyasal olarak oldukça kararlı
varlıklar olarak protein komplekslerinin her yerde bulunan bir organizasyon parçası olduğunu
göstermiştir.

Buradaki hedefimiz doğal hücresel durumu taklit eden koşullar altında daha geçici, daha yüksek
düzeydeki çağrışımları yakalamak ve ökaryotik bir proteomun fonksiyonel organizasyonunu
karakterize etmekti.

Kullanılan kromatografik yöntem, yaygın olarak kullanılan jel filtrasyon yöntemleriyle

karşılaştırıldığında nispeten yüksek çözünürlük sağlamıştır. C. thermophilum'un ifade edilen
proteomunun %27.4'ünü oluşturduğu gözlenmiştir.
 MAKALE :

Kastritis, P. L., O’Reilly, F. J., Bock, T., Li, Y., Rogon, M. Z., Buczak,
K., … Gavin, A. (2017). 

Capturing protein communities by structural

proteomics in a thermophilic eukaryote.
Molecular Systems Biology, 13(7), 936. 

doi:10.15252/msb.20167412