NESTED-PCR

PCR TỔ
NHÓM 3

GIẢNG VIÊN: ThS.NGUYỄN KHÁNH LINH

NHÓM 3 NESTED - PCR (PCR TỔ)

THÀNH VIÊN

GIA NHI MINH TÚ HẢI LONG

THANH VY HOÀNG OANH

NHÓM 3 NESTED - PCR (PCR TỔ)

NỘI DUNG CHÍNH

NGUYÊN TẮC,
01 MỤC ĐÍCH 02 PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN
2.1 Các giai đoạn
2.2. Các thiết bị - dụng cụ

03 ỨNG DỤNG 04 TÀI LIỆU THAM KHẢO

NHÓM 3 NESTED - PCR (PCR TỔ)

01.
NGUYÊN TẮC,
MỤC ĐÍCH
NESTED – PCR TỔ
NHÓM 3 NESTED - PCR (PCR TỔ)

NGUYÊN TẮC
Khái niệm:

Nested PCR là PCR cải biên nhằm tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của
phản ứng xét nghiệm. Nó liên quan đến việc sử dụng hai bộ mồi hướng
vào cùng một mục tiêu và hai phản ứng PCR liên tiếp.
NHÓM 3 NESTED - PCR (PCR TỔ)

NGUYÊN TẮC
-- Đoạn
Inner primer/
DNA
Nested-PCR
Outer primer:cónested
này primer:
2 (amplicon)
bộ mồi:
tham gia PCR tham
1 bộđược
mồi
lần bên gia
1,sử PCR
dụng
ngoài
gắn lần
làm
(outer
ngoài 2, phát
khuôn
vùng hiện
DNAtrong
primer) và 1
mục
trình
lần
bộ mồi
tiêu, tựbên
nhân
nhânđích,
bản
trong
bản gắn
thứ bên
hai
(inner
đoạn của
DNA trong
chứaamplicon,
PCR
primer/nested ngay tại vị trí DNA
trìnhprimer)
tự đích
mục tiêu, chỉ nhân bản DNA mục tiêu
NHÓM 3 NESTED - PCR (PCR TỔ)

MỤC ĐÍCH
NHÓM 3 NESTED - PCR (PCR TỔ)

MỤC ĐÍCH

- Tăng độ đặc hiệu của phản ứng PCR bằng cách giảm độ nhiễu
do sự khuếch đại DNA không đặc hiệu
- Tăng độ nhạy. Vì PCR ở bước 2 chỉ nhân bản các trình tự đặc
hiệu (sản phẩm PCR ở bước 1)
- Đánh giá tương đối nồng độ DNA của mục tiêu
NHÓM 3 NESTED - PCR (PCR TỔ)

02.
PHƯƠNG PHÁP
THỰC HIỆN
NESTED – PCR TỔ
NHÓM 3 NESTED - PCR (PCR TỔ)

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH CỦA PCR CƠ BẢN

NHÓM 3 NESTED - PCR (PCR TỔ)

2.1
CÁC GIAI
ĐOẠN
NHÓM 3 NESTED - PCR (PCR T
- Lần PCR thứ hai, mạch khuôn là sản phẩm của lần PCR
- Lần PCR đầu tiên, sản phẩm: trình tự DNA không đặc
đầu tiên. Sản phẩm: trình tự DNA đặc hiệu
hiêu được nhân bản bên cạnh các trình tự DNA đặc hiệu
NHÓM 3 NESTED - PCR (PCR TỔ)

Phản ứng Nested-PCR được hoàn thành trong 2 giai đoạn:

 Giai đoạn 1: PCR lần 1

Thành phần Nồng độ Số lượng

Master mix 1X 12
Đệm phản ứng PCR 1X 5
Outer Forward primer 10pM
Outer Reverse primer 10pM 1
Khuôn DNA 30mg 3
Nước 3
Tổng __________ 25
NHÓM 3 NESTED - PCR (PCR TỔ)

• Sau khi chuẩn bị đặt PCR như sau:

Các bước Biến tính Biến tính Bắt cặp Sự kéo Phần kéo
PCR ban đầu dài dài cuối
Nhiệt độ 90oC-95oC 90oC-95oC 55oC-60oC 72oC 72oC
Thời gian 3 phút 1 phút 50 giây 1 phút 7 phút
______ ______ 25 chu kỳ ______ ______

• Sau khi hoàn thành quá trình nhân bản lần 1 lấy các ống
PCR ra và chuẩn bị cho quá trình nhân bản thứ hai.
NHÓM 3 NESTED - PCR (PCR TỔ)

 Giai đoạn 2: PCR lần 2

Thành phần Nồng độ Số lượng

Master mix 1X 12
Đệm phản ứng PCR 1X 5
Inner Forward 10pM
primer
Inner Reverse 10pM 1
primer
Amplicon từ PCR _______________ 3
lần 1
(khuôn DNA)
Nước 3
Tổng _______________ 25
NHÓM 3 NESTED - PCR (PCR TỔ)

 Đặt trở lại vào máy PCR

Các bước Biến tính Sự kéo Phần kéo

Biến tính Bắt cặp
PCR ban đầu dài dài cuối
Nhiệt độ 90oC-95oC 90oC-95oC 55oC-60oC 72oC 72oC
Thời gian 3 phút 1 phút 50 giây 1 phút 7 phút
______ ______ 35 chu kỳ ______ ______

 Sự nhân bản sẽ được tăng cao hơn ở lần PCR thứ hai. Có thể nhân
bản thêm lượng gene mà mình quan tâm.
NHÓM 3

Giai đoạn của

phản ứng Nested-
PCR
 NHÓM 3 NESTED - PCR (PCR TỔ)

 Giai đoạn 3: Điện di ngang trên gel agarose

- Chạy điện di ngang để quan sát trình tự DNA sau khi chạy PCR

1/ Chuẩn bị gel agarose

2/ Chạy điện di trên gel agarose

3/ Quan sát DNA sau khi điện di

NHÓM 3
NHÓM 3 NESTED - PCR (PCR TỔ)

ƯU ĐIỂM
NHƯỢC ĐIỂM
NHÓM 3 NESTED - PCR (PCR TỔ)

 Ưu điểm
• Tăng độ nhạy, độ đặc hiệu và độ chính xác
• Đánh giá tương đối nồng độ của DNA mục tiêu
• Có lợi cho nghiên cứu như phân tích phát sinh loài và đa hình di truyền

 Nhược điểm
• Nguy cơ ô nhiễm cao ( mở nắp ở lần PCR1)
• Tốn nhiều thời gian
• Khá tốn kém, phải thêm bước agarose gel electrophoresis
(điện di ngang)
NHÓM 3 NESTED - PCR (PCR TỔ)

2.2
THIẾT BỊ
DỤNG CỤ
 NHÓM 3 NESTED - PCR (PCR TỔ)

2.2 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ

Ống eppendorf

Pipet Máy luân nhiệt Buồng điện di

Đầu côn có màng lọc

NHÓM 3 NESTED - PCR (PCR TỔ)

03.
ỨNG DỤNG
NHÓM 3 NESTED - PCR (PCR TỔ)

3. ỨNG DỤNG
 Phát hiện tác nhân gây bệnh thường có rất ít trong mẫu bệnh phẩm (trong
máu, CFS, mẫu mô)

1. Phát hiện Rickettsia (bệnh sốt mò), Bartonella (bệnh ho gà) và các tác nhân gây
bệnh tương tự trong nhiễm trùng máu

2. Phát hiện Herpesvirus(mụn rộp) và Enterovirus (bệnh tay chân miệng)

3. Phát hiện Mycobacterium tuberculosis(vi khuẩn lao) trong mẫu đàm

NHÓM 3 NESTED - PCR (PCR TỔ)

3. ỨNG DỤNG
NHÓM 3 NESTED - PCR (PCR TỔ)

NGUỒN TÀI LIỆU THAM KHẢO

 Nested Polymerase Chain Reaction - an
overview | ScienceDirect Topics, n.d)

 Koneman’s Color Atlas and Textbook of

Diagnostic Microbiology

 Tankeshwar, A., 2019. Nested PCR: Principle

and Applications – Microbe Online

 Nested PCR: Principle and Applications

Microbe Online
mart.vn/
 Nested Polymerase Chain Reaction - an
overview | ScienceDirect Topics, n.d
NHÓM 3 NESTED - PCR (PCR TỔ)

CẢM ƠN
CÁC BẠN CÓ CÂU HỎI GÌ KHÔNG?