DEFINIRANJE RAZREDA I TIPA

MONOKLONSKOG IMUNOGLOBULINA
METODOM IMUNOSUPTRAKCIJE
DRAGANA ŠEGULJA, MAG.MED.BIOCHEM.

KLINIČKI ZAVOD ZA LABORATORIJSKU DIJAGNOSTIKU, KBC ZAGREB, ZAGREB

1999.
 2006.

Imunotipizacija-
postupak
određivanja tipa M-
proteina
 IMUNOFIKSACIJA

• Elektroforeza proteina na agaroznom gelu

• Imunoprecipitacija
• Vizualizacija
 IMUNOSUPTRAKCIJA

• 1977. Aguzzi i Poggi

• 1984. White i Attwood- M-protein
• 1996. dostupni automatizirani sustavi na tržištu

• 2006. NACB/NCCN smjernice uvode pojam imunotipizacija

• 2010. KZLD, KBC Zagreb

 IMUNOSUPTRAKCIJA

• Imunoprecipitacija

• Elektroforeza proteina
kapilarnom zonskom
elektroforezom
• Vizualizacija
 IMUNOSUPTRAKCIJA
Diluent Uzorak

• 26mBar
• 35.5oC
• 7150V Folijom prekriven
IT segment
• 220 sek
• 6 kapilara
• IT segment:
• pufer
• antiserum na gama teški lanac (roza)
• antiserum na alfa teški lanac (tamno plava)
• antiserum na mi teški lanac (žuto-zelena)
• antiserum na kappa (slobodni i vezani) lake lanace (svijetlo zelena)
• antiserum na lambda (slobodni i vezani) lake lanace (svijetlo plava)
 IMUNOPRECIPITACIJA

• kuglice sefaroze (Separation Pharmacia Agarose) obložene antiserumom

ELEKTROFOREZA PROTEINA KAPILARNOM ZONSKOM ELEKTROFOREZOM

VIZUALIZACIJA PROTEINA DIREKTNO FOTOMETRIJSKI NA 200nm

 Negativno nabijena
stijenka kapilare

Stvara se
Elektrostatski
električni
privučeni kationi
dvostruki
sloj

Elektroosmotski tok
prema
katodi

Imuni kompleks
Nakon imunosuptrakcije uzorka s kuglicama sefaroze obloženim antiserumom nestaje
monoklonski pik u elferogramu.

A K A L G K
G K A L A K G K
G K +
G K G K M L G K Anti-KG K
G K G K
M L G K Anti-K G K
M K G L M K G K
G K G L
G K G L G K
G L G K

Kuglice s antiserumom kapa vežu sve kapa lance (SLOBODNE I VEZANE), slobodni
ostaju samo imunoglobulini s lambda lancem.

Antiserum ne reagira isključivo s monoklonskim imunoglobulinom!

 IMUNOSUPTRAKCIJA
POLIKLONSKA SINTEZA IMUNOGLOBULINA

IMUNOGLOBULIN G ≈ 80% IMUNOGLOBULIN A ≈ 15% IMUNOGLOBULIN M ≈ 5%

KAPA ≈ 2/3 LAMBDA ≈ 1/3

NORMALAN NALAZ
MONOKLONSKI
IMUNOGLOBULIN G KAPA
TIPA
MONOKLONSKI POLIKLONSKA
IMUNOGLOBULIN A KAPA HIPERGAMAGLOBULINEMIJA
TIPA
 IMUNOSUPTRAKCIJA
MONOKLONSKI SLOBODNI TEŠKI LANCI

Fig. 2. Capillary zone electrophoresis with immunotyping (Capillarys 2, SEBIA, Paris, France) of serum
sample from the patient with μ-HCD.
V. Maisnar et al. Capillary immunotyping electrophoresis and high resolution two-dimensional
electrophoresis for the detection of μ-heavy chain disease/Clinica Chimica Acta 389 (2008) 171–173
MONOKLONSKI
IMUNOGLOBULIN G
LAMBDA TIPA

MONOKLONSKI
IMUNOGLOBULIN G
KAPA TIPA?
 IMUNOSUPTRAKCIJA
KAKO PREPOZNATI MONOKLONSKI PROTEIN?

• Gubitak ili pad M-pika u elferogramu nakon reakcije s

antiserumom
• Promjena simetričnosti krivulja prije i nakon imunosuptrakcije

• > 10 g/L – imunosuptrakcija

• < 5 g/L - imunofiksacija
 Method Performance Characteristics for the Detection of Monoclonal Immunoglobulins Compared With
Immunofixation Electrophoresis as the “Gold Standard”*

   
Electrophoresis Method

Agarose Gel Capillary Immunotyping

Sensitivity† 90.9 (86.2-95.6) 91.5 (85.9-97.1) 84.9 (81.7-88.1)

Specificity‡ 81.0 (71.7-90.4) 73.7 (60.1-87.3) 93.8 (91.0-96.6)
Positive predictive 89.4 (84.4-94.3) 87.4 (80.8-93.9) 95.9 (94.2-97.7)
value
Negative predictive 84.1 (78.8-89.3) 84.3 (78.8-89.8) 78.2 (74.4-82.1)
*
valueData
§ are given as mean (95% confidence interval).
91 specimens with monoclonal immunoglobulins.
2.

3. 55 specimens without monoclonal immunoglobulins. § Disease prevalence was 62%.

Christopher R. McCudden, Stephanie P. Mathews, Shirley A. Hainsworth, John F. Chapman, Catherine A. Hammett-Stabler, Monte S. Willis, David G. Grenache.
Performance Comparison of Capillary and Agarose Gel Electrophoresis for the Identification and Characterization of Monoclonal Immunoglobulins. Am J Clin
Pathol 2008;129:451-458
Imunosuptrakcija često ne povećava osjetljivost kapilarne zonske
elektroforeze za detekciju M-proteina
(kod imunofiksacije se ispiru svi proteini koji nisu od interesa, dok se kod imunosuptrakcije
uklanja samo protein od interesa)

TIPIZIRATI/POTVRDITI METODOM IMUNOFIKSACIJE

•Hipogamaglobulinemiju
•Biklonalne gamapatije
•Monoklonske slobodne lake lanace
 ZAKLJUČAK

Imunotipizacija

Metoda Imunofiksacija Imunosuptrakcija

Elektroforeza Gel elektroforeza Kapilarna elektroforeza

Nosač elektroforeze Agaroza Otopina

Mogućnost detekcije M-proteina IgA, IgG, IgM, IgD, IgE IgA, IgG, IgM,MSLL

Automatizacija Poluatomatizirana Potpuno automatizirana

Trajanje 2h 10min

Tehnička izvedba Potrebna vještina -

Interpretacija rezultata Potrebno iskustvo Potrebno iskustvo

0,25g/L, varira ovisno o položaju M-

Granica detekcije 0,2-0,25g/L M-proteina proteina i poliklonske pozadine u
gama i beta zonama
 KVANTITATIVNO ODREĐIVANJE
M-PROTEINA
•denzitometrijski

•imunokemijski
Kvantitativno određivanje M-proteina

denzitometrijski

imunokemijski
• Vezno mjesto antitijela –
jedinstveni epitop između
konstantne regije teškog i lakog
lanca imunoglobulina;
omogućuje razlikovanje lakih
lanaca uz isti teški lanac

• 4 epitopa po jednoj molekuli Ig –

osigurava dovoljnu osjetljivost za
nefelometrijsko i turbidimetrijsko
određivanje

• Granica detekcije 0,01-0,04 g/L

• Granica kvantifikacije 0,02-0,08 g/L

• 20 bolesnika
1. IgG, IgA, IgM
IgIIhs
imunoturbidimetrijski

2. elektroforeza proteina (CZE)

• Vezno mjesto antitijela – jedinstveni

epitop između konstantne regije teškog
tipiziranje monoklonskog proteina
3. (imunofiksacija, imunosubtrakcija,
(CH1) i lakog lanca (CL) imunoglobulina;
omogućuje razlikovanje lakih lanaca uz
immunodisplacement)
isti teški lanac

određivanje koncentracije monoklonskog

4. proteina - imunonefelometrija

• Moguće kvantitativno odrediti: IgG

kapa, IgG lambda, IgA kapa, IgA
lambda, IgM kapa, IgM lambda
• Svi numerički rezultati nisu se mogli međusobno usporediti

• Standardizacija

• Omjer Ig (AGM) kapa/lambda - dobar pokazatelj klonalnosti

• Kvantitativno (imunonefelometrijsko) određivanje monoklonskog

proteina – obećavajući test u praćenju bolesnika sa M-proteinom
dsegulja@kbc-zagreb.hr