CZYSTOŚĆ

MIKROBIOLOGICZNA
LEKÓW
Jakub Kopczyński Wiktor Kotrysiak
Farmacja rok III
Badania nad czystością mikrobiologiczną
Przyczyny zanieczyszczeń produktów leczniczych
Good Manufacturing Practice
 Metody ograniczania liczby drobnoustrojów

● Dezynfekcja
● Aseptyka
● Antyseptyka
● Sterylizacja
Dezynfekcja
Aseptyka
Antyseptyka
 Sterylizacja - wyjaławianie nasyconą parą pod
ciśnieniem

Autoklaw - komora ciśnieniowa do ciągłego wytwarzania pary wodnej.

Wyjaławianie zachodzi pod wpływem wilgotnego powietrza.
Mechanizm opiera się na penetrowaniu wilgoci do komórki, a następnie
denaturacji jej białek i kwasów nukleinowych.
Parametry wyjaławiania: najczęściej 121°C przez 15-20 min.
Co można wyjaławiać Czego w autoklawie
w autoklawie? wyjaławiać nie wolno?
roztwory wodne roztworów
termostabilne, termoniestabilnych,
sączki membranowe i materiałów nietrwałych
ze szkła spiekanego, z tworzyw sztucznych,
odzież ochronna, substancji leczniczych,
gaza, lignina, podłoży maściowych,
szkło, podłoży olejowych.
metal.
 Wyjaławianie suchym powietrzem

Mechanizm: wysuszanie komórki bakteryjnej, utlenienie i degradacja jej

elementów komórkowych.
Parametry:
160°C co najmniej 2h
170°C - 1h
180°C - 0,5h
 Co można Czego wyjaławiać
wyjaławiać? nie wolno?
NaCl, ZnO bibuła
talk gaza
oleje roślinne guma
podłoża maściowe tworzywa sztuczne
szkło sączki z
porcelana nitrocelulozy

metale roztwory wodne

sączki Schotta
 Filtracja sączkami membranowymi

Stosuje się dla wodnych preparatów dających się sączyć,

preparatów alkoholowych, preparatów olejowych lub dla
preparatów mieszających się lub rozpuszczalnych w wodzie lub
rozpuszczalnikach olejowych pod warunkiem, że rozpuszczalniki
te nie wykazują w warunkach badania działania
przeciwdrobnoustrojowego.
Podział leków ze względu na wymagania jałowości
Ogólna liczba drobnoustrojów
tlenowych TAMC (total aerobic
microbial count)

Ogólna liczba pleśni i drożdży TYMC

(total yeast/moulds count)
 Badanie czystości leków jałowych

Metoda z użyciem sączków membranowych

Metoda bezpośredniego posiewu
Metoda oznaczania najbardziej prawdopodobnej
liczby
 Metoda z użyciem sączków membranowych

Należy użyć takiego aparatu, aby możliwe było aseptyczne przeniesienie sączka do
podłoża. W tym wypadku należy użyć 2 sączków, nanieść na nie odpowiednią ilość
badanej próbki i natychmiast sączyć.
● W celu oznaczenia TAMC przenieść sączek na powierzchnię podłoża
agarowego z hydrolizatem kazeiny i soi (inkubować 3-5 dni w temperaturze 30-
35 ºC),
● Natomiast w celu oznaczenia TYMC przenieść drugi sączek na powierzchnię
agaru Sabouraud z dekstrozą (inkubować 5-7 dni w 20-35 ºC).
 Metoda bezpośredniego posiewu

Wyróżniamy dwie metody: płytek lanych oraz posiewu powierzchniowego.

Dla pierwszej z nich przygotowujemy po co najmniej 2 płytki Petriego na każde podłoże i każde
rozcieńczenie. W celu określenia TAMC badaną substancję mieszamy z agarem hydrolizatu kazeiny
i soi, świeżo przygotowanym, wysterylizowanym i schłodzonym (temperatura nie wyższa niż 45 ºC).
Po zastygnięciu przygotowane płytki inkubujemy przez 3-5 dni w temp 30-35 ºC.
TYMC wyznaczamy analogicznie stosując jako pożywkę agar Sabouraud z dekstrozą i inkubujemy
w 20-25 ºC przez 5-7 dni. Wynik uzyskany jest średnią arytmetyczną liczby kolonii dla różnych płytek
o różnym rozcieńczeniu i wyrażany jest w CFU (colony forming units – jednostki tworzące kolonie)
na gram lub mililitr produktu.
Metoda oznaczania najbardziej prawdopodobnej liczby

Jest najmniej precyzyjna i dokładna. Stosuje się ją tylko do określenia

TAMC i jedynie w sytuacjach, gdy nie może być zastosowana inna
metoda.
Przygotowuje się co najmniej 3 serie 10-krotnych rozcieńczeń badanej
próbki. Z każdego poziomu rozcieńczenia przygotowuje się po 3 porcje
(1g lub 1mL), które następnie zaszczepia się w bulionie lub agarze
(schłodzonym do 45 ºC) hydrolizatu kazeiny i soi.
 Metody wykrywania pirogenów

Badanie obecności substancji gorączkotwórczych polega na pomiarze wzrostu

temperatury ciała królików po dożylnym podaniu leków.
1.Pomiar wyjściowej temperatury ciała wyselekcjonowanych królików (wstępnie 3)-
przynajmniej 90 min. przed iniekcją.
2.Wstrzyknięcie dożylne jałowego roztworu substancji badanej.
3.Badanie przyrostu temperatury co 30 min. przez około 3h po iniekcji.
4.Uśrednienie wyników i porównanie z wytycznymi.
Metody wykrywania pirogenów
 Badanie endotoksyn bakteryjnych

Endotoksyny bakterii Gram(-) są najczęstszą przyczyną

reakcji niepożądanych wynikających z zanieczyszczenia
produktów leczniczych pirogenami. Zastąpienie badania
obecności substancji gorączkotwórczych na królikach
badaniem wykorzystującym lizat amebocytów należy
traktować jako metodę alternatywną.
Test obecności endotoksyn bakteryjnych (test LAL)

´Celem tej metody jest wykrycie lub oznaczenie zawartości endotoksyn bakterii Gram-
ujemnych używając przy tym lizatu amebocytów skrzypłocza (Limulus polyphemus lub
Tachypleus tridentatus). Obecność endotoksyn powoduje powstanie skrzepu.
´Wyróżnia się trzy techniki badania :
•żelową (polegającą na utworzeniu żelu),
•turbidymetryczną (wywołanie zmętnienia w skutek rozszczepienia substratu),
•chromogenną (polegającą na wywołaniu zmętnienia w skutek rozszczepienia
syntetycznego kompleksu peptyd-chromogen).
 Wykonanie testu LAL

1. Wzorzec endotoksyny – rozpuszcza się go w wodzie LAL, otrzymując w ten

sposób roztwór macierzysty, z którego sporządza się roztwory do oznaczeń.
2. Lizat amebocytów – przygotowany bezpośrednio przed użyciem.
3. Woda LAL – woda do wstrzykiwań, która daje wynik ujemny w oznaczeniu
endotoksyn, otrzymywana przez 3-krotną destylację.
4. W ciągu kilku sekund- pojawienie się skrzepu.
Bibliografia:
●Farmacja stosowana. Podręcznik dla studentów farmacji

Redakcja: Stanisław Janicki, Adolf Fiebig, Małgorzata Sznitowska

●Portal Przemysł Farmaceutyczyny

●Wikipedia.org

●www.laborant.pl

●www.laboratoria.net
Dziękujemy za uwagę!