Baktériumok

antibakteriális
anyagokkal
szembeni
érzékenysége

Baktériumszámlálás.
ANTIBIOTIKUM ÉRZÉKENYSÉGI
VIZSGÁLATOK

 Bakteriosztatikus szer: gátolja a baktériumok szaporodását (nagy cc-ban ez is baktericid)

 Baktericid szer: elöli a baktériumokat

 minimális gátló koncentráció (minimum inhibitory concentration, MIC) :az antibiotikumnak az a legkisebb
mennyisége, amely 1 mL térfogatban gátolja egy bizonyos baktériumtörzs szaporodását (ug/ml), MIC 50, MIC90

 minimális baktericid koncentráció (minimum baktericidal concentration, MBC): az a legkisebb antibiotikum

koncentráció, amely az inokulumban jelenlévő baktériumok 99,9 %-át elpusztítja
 MIC meghatározás (minimális gátló cc)

 leves mikrohígításos módszer: kettes léptékű hígításokat készítünk a vizsgálni kívánt antibiotikumból egy mikrotitráló
lemezben, majd mindegyik hígításhoz azonos mennyiségű baktériumot adunk

 meghatározzuk a MIC értéket, mely az a legkisebb antibiotikum koncentráció, amely szabad szemmel vizsgálva teljes
növekedésgátlást okoz (baktérium szaporodása esetén egyenletes zavarosodást vagy a baktériumok leülepedését figyelhetjük meg)

 leves makrohígítás módszer: annyiban különbözik a mikrodilúciós teszttől, hogy az antibiotikum hígításokat kémcsövekben
végezzük
 MBC meghatározás (minimális baktericid cc)

- MIC makrohígításos meghatározási módszeren alapul

- azzal a különbséggel, hogy mind az inokulumból, mind pedig a szabad szemmel nem látható növekedést mutató csövekből
csíraszámolást végzünk annak megállapítására, hogy a vizsgált antibiotikum milyen koncentrációban pusztítja el az élő
csírák 99,9%-át

- csak abban az esetben végzünk, amikor a terápiában kizárólag baktericid szereket kell alkalmazni (infektív endocarditis,
immunszuppresszív beteg véráram infekciói)
 Korongdiffúziós módszer

- klinikai gyakorlatban leggyakrabban ezt a módszert használjuk

- a vizsgálni kívánt baktérium színtenyészetéből szuszpenziót készítünk 3-5 izolált telep megérintésével steril fiziológiás
sóoldatban

- Mueller-Hinton táptalajra szélesztjük a szuszpenziót

- táptalaj felszínére az antibiotikum meghatározott koncentrációjú oldatával átitatott szűrőpapír-korongokat helyezünk. Az

antibiotikum a táptalajból származó vízben feloldódik, és a diffúzió törvényei szerint a korong környezetében fokozatos
koncentráció gradiens szerint eloszlik

- ahol az antibiotikum kellő koncentrációban van jelen a táptalajban, meggátolja a baktérium növekedését, azaz a korong
körül ún. gátlási zóna alakul ki

- a vizsgált mikroorganizmus érzékenységét a gátlási zóna átmérője (mm) alapján ítéljük meg
(É, M, R)
 E-teszt®

- olyan műanyag csík, amelynek egyik felszínére egy gélszerű hordozó segítségével az antibiotikumot már
meghatározott koncentráció gradiensnek megfelelően vitték fel

- a táptalaj felszínére fektetjük

- a csík az antibiotikumot másodperceken belül leadja, a már egyszer lefektetett csík helyzetén sosem szabad változtatni

- inkubációs idő letelte után a csík környezetében ellipszis (E) alakú gátlási zóna alakul ki

- a tesztcsík és az elliptikus gátlási zóna találkozása a MIC érték

 A BAKTÉRIUMSZÁMLÁLÁS
MÓDSZEREI

Összcsíraszám meghatározása Élőcsíraszám meghatározása

 Számlálás kamrában  Dilúciós módszer folyékony táptalajban
 (Számlálás vörösvértestekkel)  Lemezöntéses módszer
(Wright-féle módszer)  Szélesztéses módszer
 Elektromos sejtszámláló
 Membránfilteres eljárás
 Turbidimetriás eljárás  Turbidimetriás eljárás
 Sejtszámlálás turbiditási
standardokkal
 Nefelometriás módszer
 Összcsíraszám meghatározása
 Számlálás kamrában

- kamrák típusai: Bürker,Petroff-Hauser, Helber, Lewy

- több hígítást kell készíteni, hogy kiválaszthassuk a jól számolható sűrűséget (kristályibolya oldat)

- Bürker kamra használata: a kamra egy vastagabb üveglemezből és egy vékony fedőlemezből áll, ha a fedőlemezt a vastag
lemezre helyezzük, akkor pontosan 0,1 mm vastag rés marad közöttük. A vizsgálandó anyagot ebbe a résbe helyezzük be a
fedőlemez felhelyezése után úgy, hogy a vastag lemezbe vésett H alakú mélyedés szárai között található négyzetnél a fedőlemez
széléhez cseppentjük
A Bürker-kamra magassága 0,1 mm, egy nagy négyzet területe 1/5 mm x 1/5 mm = 1/25 mm2. Néhány négyzetben megszámoljuk a
sejteket, majd átlagot vonunk belőle.

baktériumszám 1 μl-ben = (számolt baktériumok átlaga)/[(számolt terület felszíne, (mm2)) x

kamra magassága (mm) x hígítás foka]
 (Számlálás vörösvértestekkel (Wright-féle módszer))

( - ismert vörösvértest számú, alvadásgátolt vért 1:1 arányban keverünk a megszámolni kívánt baktérium
szuszpenzióval

- vékony kenetet készítünk belőle, fukszinnal, vagy May-Grünwald-Giemsa szerint festjük

- immerziós nagyítással, minél több látótérben megszámoljuk a vörösvértesteket és a baktériumokat

- aránypárral számítjuk ki a ml-enkénti baktérium számot: n×10m baktérium/ml)

Ma már nem használják!

 Elektromos sejtszámláló

- „Coulter counter” elven mérnek = sejtméretet az elektromos ellenállás alapján számolják ki

- egyes eszközök szenzora közvetlenül a mintába meríthető, és a mért adatokból diagramokat is képes generálni
 Turbidimetriás eljárás

- folyékony tenyészetek optikai zavarosságának mérésén alapul, több baktérium nagyobb optikai
sűrűséget (denzitást) hoz létre

- mivel egy baktériumfajon belül az összefüggés állandó, a mért turbidimetriás értékből következtethetünk a
baktériumok számára. (Például E. coli esetén 1 OD600nm=108 sejt/ml)

- az optikai sűrűséget (optical density, OD) vagy extinkciót olvassuk le, amely a beeső fény intenzitása (I0) és az
áteresztett fény intenzitása (I) hányadosának logaritmusa:
optikai denzitás (OD) = lg(I0/I),

- a meghatározáshoz először kalibrációs görbét kell készíteni, ennek során a vizsgálandó szuszpenzióból hígítási
sort készítünk (felező vagy 10-es léptékű), és minden hígításnak meghatározzuk Bürker-kamrában a csíraszámát és
megmérjük az optikai denzitását

- kalibrációs görbe segítségével ismeretlen csíraszámú szuszpenzió optikai denzitásából a csíraszám

extrapolálható
 Sejtszámlálás turbiditási standardokkal

- McFarland standardok: bárium-szulfát oldatokból álló sorozat az egyenlő turbiditású oldatokban található
baktériumok számának telepszámlálás alapján történő meghatározására

- McFarland standardokat bárium-klorid vizes oldatához adott kénsavval hozzák létre, amely szuszpendálódott bárium-
kénsav precipitátum kialakulását eredményezi.
 Nefelometriás módszer

- turbidimetriával rokon eljárás, a baktérium szuszpenzió által szórt fény intenzitásának mérésén alapszik

- ha a részek nagysága állandó, akkor a szórt fény intenzitása egyenesen arányos a részecskék számával

- meghatározást itt is kalibrációs görbe felhasználásával kell végezni

 Élőcsíraszám meghatározása
 Dilúciós módszer folyékony táptalajban

- 10-es léptékű hígítási sort készítünk folyékony tt-ban

- a hígításokat termosztátba tesszük és inkubálás után megállapítjuk, hogy melyik az a legnagyobb hígítás, ahol a
baktérium még növekedett

- ha 1 ml hígítási össztérfogatot használunk (tehát 0,1 ml baktérium szuszpenziót 0,9 ml táplevesben hígítottunk), akkor ez
azt jelenti, hogy az adott hígítás 1 ml-ébe még legalább egy élő baktérium jutott

- például a 100 000-szeres (10-5) hígításban észleltünk növekedést, akkor elvileg az eredeti szuszpenzió 1 ml-ben legalább
1x105 baktériumnak kellett lenni

Meglehetősen pontatlan eljárás.

 Lemezöntéses módszer

-hígítást nem tápfolyadékban, hanem fiziológiás sóoldatban készítjük

- a hígításokból 0,1-0,1 ml-t steril Petri-csészébe mérünk, majd agar táptalajt öntünk hozzá és hagyjuk megszilárdulni

- inkubálás során a táptalajba jutott baktériumokból telepek képződnek és ezek a megfelelő nagyság elérése után megszámlálhatók

- a hígítás fokának és a bemért mennyiségnek figyelembevételével az eredeti szuszpenzió ml-enkénti élőcsíraszáma

kiszámítható

- akkor is egy telep képződik, ha a növekedés összetapadt baktériumokból indult ki, ezért helyesebb a számolás eredményét nem
baktérium számnak, hanem telepképző egységnek (colony forming unit, cfu) jelölni
 Szélesztéses módszer
-annyiban tér el a lemezöntéses módszertől, hogy a hígításokból kivett 0,1-0,1 ml-t az agar lemezek
felszínére mérjük, és üvegbottal a táptalaj felszínén szétkenjük
 Membránfilteres eljárás

-kevés baktériumot tartalmazó, nagy térfogatú anyagok vizsgálatánál használatos

-ismert térfogatú mintát átszűrűnk membránszűrőn, így a baktériumsejtek fennakadnak a szűrőn, a membránfiltert
helyezzük szilárd táptalajt tartalmazó Petri-csészére

-megfelelő inkubációs idő után a filteren található telepek száma meghatározható

- ezt a módszert alkalmazzák pl. ivóvizek, vagy egyéb, közegészségügyi szempontból fontos vizek baktérium
szennyezettségének vizsgálatához is
 Turbidimetriás eljárás alkalmazása élőcsíraszám meghatározásra

-standardizált körülmények között fiatal tenyészetek élő- és összcsíra számának aránya nem változik
számottevően, bakteriológiai munkákban ezért elsősorban ezt a módszert használják tenyészetek
csíraszámának ellenőrzésére