Kit test nhanh virus/vi khuẩn:

Xét nghiệm miễn dịch dòng chảy

Group 1

Nguyễn Thị Thân

Đào Thu Hường
Lại Thị Yến
 Giới thiệu chung về kit test nhanh
A.

Ứng dụng kit test nhanh xác định bệnh truyền

nhiễm: Test nhanh covid 19 Abbott – Panbio TM B.
COVID-19 Ag Rapid Test Device
 i ệ u c hu ng
Giới th
i ệ m n h an h
Xét ngh
1.

là xé t
nhanh
Xét nghiệm
n h a n h, dễ
h ẩn đ oán
c
nghiệm h o việc
hợp c
ệ n, p h ù
thực hi ặ c kh ẩ n
ơ bộ h o
t ế s
c y
sàng lọ ác cơ sở
t ro n g c
sử d ụ n g
cấp và h ạ n chế
hân l ự c
n g u ồ n n
y tế có

i n iệ m
Kh á
 Phát hiện nhanh nguồn nhiễm bệnh

COVID–19 (SARS-CoV-
2)

Dengue Hemorrhagic Fever (Dengue

đích ? virus – DENV)

Mục

HIV
(Lentivirus)
.. .
 Xét nghiệm miễn dịch dòng chảy
(lateral flow immunoassay)
Phân loại

Xét nghiệm dòng chảy axit nucleic

(nucleic acid lateral flow assay)

Xét nghiệm miễn dịch dòng chảy axit nucleic

(nucleic acid lateral flow immunoassay)
 Kit test nhanh được thiết kế dựa trên nguyên tắc miễn dịch (LFIA – lateral flow
immunoassay), còn được gọi là phương pháp sắc kí miễn dịch
Cấu tạo gồm các phần:
- Vùng nạp mẫu
- Vùng chứa chất cộng hợp
- Màng nitrocenllulose
- Nơi hấp thụ

u n g c ủ a
u tạo ch
Cấ t n h an h
que te s

Source:
 v ùn g nạp
n g hi ệ m 
ét p mẫ u
Mẫu x ệm n ạ
ộ t c ấ u trúc đ
mẫu –
m
đệ m , protein
d u n g dịch
sẵ n
đã tẩm b ề m ặt.
g
c hấ t hoạt độn
và

k i ể m soát
u ,
p h ố i đề u mẫ chất
i ú p p h ân a d ò n g
g
n đ ộng củ
ớ n g ch uy ể
b ỏ m ột số
ư i
h
e t est, loạ
n g t rên qu
n n h ư tế bào
l ỏ g muố
g m o n
ôn
c hấ t kh
u
hồng cầ
 t c ộ n g hợp:
ng c hứa chấ t h ể đặc
Vù á n g
h ứ a c ác kh
Là nơi
c
tí c h đí c h và
c h ấ t phân
hiêu ch
o
c ó m à u hoặc
v ớ i c á c hạ t
được kế
t
iế n n hất là
a n g – p hổ b
qu dạng
huỳnh v à n g
ầ u l a tex và
các vi
c
h á n g t hể liên
c ù n g với k
keo. M
ẫu
ấ t ph â n tích
k ế t với ch
hợp liê
n
t h e o dải vào
c h u y ể n dọc
i
đích, d
n g p h á t hiện
vù
 àng x ốp: st, chủ
M q ue t e
a n tr ọng của
qu llulose
Yếu tố itro c e
c là m bằ ng n
yếu đượ
↓
d ò n g chảy.
h thàn h
h ìn
ự c m ao d ẫ n
t c ũ ng n hư c ố
Tạo l liên kế
ỗ t r ợ s ự k há ng
ờ i , h v à
Đồng th i n đặ c hiệu
c á c prote
địn h
ê n t h a m gia
ngu y
↓
h á n g nguyên
ạ c h T , các k đơn
i q ua v n g th ể
Kh i đ ở i c ác khá
ợ c bắ t giữ b
sẵ n t ạ i vị trí
sẽ đư ã cố định
đ ặ c h iệ u đ
ch ấ t phát
dòng ê n h ợ p và
á c c h ất li
te s t s ẽ phát
C
này.
h ỗ n h ợp dịch ên –
ó t ro n g n g u y
màu c h ợ p kháng
iệ n c á c phức
h
thể
kháng
Nếu có sự hiện diện của kháng nguyên, các phản ứng sẽ

xảy ra nhằm giải phóng các chất phát màu và chúng ta sẽ

phát hiện vạch màu tại vị trí vạch T

Vạch chứng (vạch C) được cố định với kháng thể đặc hiệu

với các protein trong dung dịch nạp mẫu, để đảm bảo dòng

dung dịch mang mẫu đã di chuyển chính xác cũng như

đảm bảo tính hoạt động của các thành phần chứa trong

dung dịch nạp mẫu

 Tấm hấp phụ:
Nó hoạt động như phần chìm ở cuối que. Nó cũng giúp duy trì tốc
độ dòng chảy của chất lỏng qua màng và ngăn dòng chảy ngược
của mẫu. Khả năng hấp phụ để giữ chất lỏng có thể đóng một vai
trò quan trọng trong kết quả xét nghiệm.

u n g c ủ a
u tạo ch
Cấ t n h an h
que te s
 CácYêu
vậtcầu
liệucủa
nano
vậtđược sử dụng
liệu Nano để phát
khi làm màu trong FLA rất đa dạng:
label:
• •Gold
MứcNanoparticles
độ ổn định keo trong dung dịch ở các điều kiện và
• Latex microspheres
nhiệt độ khác nhau
• •Quantum
Độ nhạyDot
để (QD)
phát hiện trên phạm vi rộng
• •Colloidal
Khả năngcarbon (keo
tái sản carbon)…..
xuất của chất liên hợp (không ảnh hưởng
h át màu
Chấ t p đến tính toàn vẹn và hoạt động hóa học/sinh học
“L ab el” • Thương mại hóa và chi phí thấp
 Gold Nanoparticles (AuNPs)
Hầu hết các que test nhanh đều sử dụng AuNP do ái lực cao đối với protein và phân tử sinh học, độ ổn định cao, khả năng
truyền điện tích cao hơn và độ nhạy quang học tốt. Tính chất quang học của các hạt nano vàng phụ thuộc vào kích thước và
hình dạng của hạt. Hạn chế chính của LFIA dựa trên Au NP là độ nhạy thấp dựa trên phân tích đo màu

Huyền phù của các hạt nano vàng có kích thước khác nhau. Sự khác biệt về kích thước gây ra sự khác biệt về màu
sắc. Màu đỏ rượu vang (<100nm)
Quantum Dot ( vật liệu nano bán dẫn)

• Là một con đường tiềm năng để tạo ra xét nghiệm dòng chảy
có độ nhạy cao do có độ sáng cao, ổn định nhiệt và hóa học,
đồng thời dễ dàng biến đổi bề mặt.
• Kích thước QD : nằm trong khoảng từ 1 đến 10 nm  Phân
tán tốt trong nước và có thể kết hợp với các phân tử sinh hoc.
• Tuy nhiên, LFIA dựa trên QD yêu cầu nguồn sáng UV bổ
sung hoặc đầu đọc huỳnh quang thương mại để đo tín hiệu
Organic-soluble quantum dots
huỳnh quang, đây là gánh nặng đối với các khu vực có điều
kiện y tế kém.

Kết hợp các vật liệu Nano để tăng tín hiệu huỳnh quang, từ đó tăng độ nhạy của phản ứng phát hiện
mầm bệnh
Sử dụng phương pháp hấp thụ tĩnh điện qua trung gian polyetylenimine (PEI), các hạt nano QD bao gồm các lớp AuNP
Chế độ kép dựa trên các hạt nano QD để tăng độ nhạy phát hiện virus
(≈4 nm) và CdSe/ZnS-MPA QD bên ngoài lõi của các hạt nano SiO 2 (≈200 nm )

Sử dụng phương pháp hấp

thụ tĩnh điện qua trung gian
polyetylenimine (PEI), các
hạt nano QD bao gồm các
lớp AuNP (≈4 nm) và
CdSe/ZnS-MPA QD bên
ngoài lõi của các hạt nano
SiO2 (≈200 nm)

 Sự kết hợp này, giúp

que test đạt độ nhạy 99%,
độ đặc hiệu đạt 100% so
với que test dựa trên axit
nucleic
Sử dụng phương pháp hấp thụ tĩnh điện qua trung gian polyetylenimine (PEI), các hạt nano QD bao gồm các lớp AuNP
Quy trình chế tạo nhãn huỳnh quang SiO2 @ Au@QD chế độ kép
(≈4 nm) và CdSe/ZnS-MPA QD bên ngoài lõi của các hạt nano SiO 2 (≈200 nm )

Chế tạo SiO2 @ Au@QD chế độ kép huỳnh quang theo phương pháp hấp thụ tĩnh điện qua trung gian PEI

Hấp phụ các NP Au

Chế tạo các NP Hấp phụ nhiều QĐ
Tự lắp ráp một lớp tích điện âm dày
SiO2 200 nm như Tự lắp ráp lớp PEI carboxyl hóa trên
PEI tích điện đặc (∼ 4 nm) trên
chất hỗ trợ đơn thứ hai trên bề lớp PEI thứ hai để
dương trên bề mặt bề mặt SiO 2 @PEI
phân tán và ổn mặt SiO 2 @Au cung cấp tín hiệu
SiO2 để sản xuất tín huỳnh quang cao.
định cao
hiệu đo màu mạnh
 2. P hâ n l o ại

Phươ ng p h á p
ệ m n h a n h
Xé t nghi
 Cơ chế xét nghiệm
Kiểu cạnh tranh:
Thiết kế cho kháng nguyên có 1
epitope. Cường độ tín hiệu tỷ lệ
nghịch với nồng độ chất phân tích

Kiểu kẹp “sandwich”:

sử dụng kháng nguyên để phân tích.
KN có 2 epitope để liên kết với 2 kháng
thể riêng biệt. KN mắc kẹt giữa hai
kháng thể đó Cường độ tín hiệu tỷ
lệ thuận với chất phân tích Mô hình cạnh tranh và kẹp sandwich của FLIA
Theo đối tượng xét nghiệm

Xét nghiệm phát Xét nghiệm phát

hiện kháng nguyên hiện kháng thể
 What is it?

Xét nghiệm
Mechanism

phát hiện
kháng nguyên

COVID–19 Rapid Antigen

Test
2.1.

What is it?

Mechanism
 What is it?

Xét nghiệm
phát hiện
kháng thể

Hsiao et al. (2021)

Mức độ KN/KT ở các
giai đoạn khác nhau
Test nhanh phát hiện kháng nguyên:
Phụ thuộc vào nồng độ virus trong mẫu dịch đường hô hấp
trên bằng cách phát hiện các protein trên bề mặt của virus.
Vậy tải lượng virus giảm dần theo thời gian Độ chính xác
của test giảm
Phát hiện kháng thể:

- Vài ngày đầu: Nồng độ kháng thể thấp

 Âm tính giả

- [IgM] tăng cao sau 2 tuần và giảm dần

từ tuần thứ 3 trở đi

- Ngược lại với IgM, [IgG] tăng mạnh sau 2

tuần có triệu chứng, giảm và ổn định từ

tuần 6 trở đi

 Sử dụng que test kháng thể phải dùng từ

14 ngày sau khi có triệu chứng mới chính xác

3. Ưu nhược điểm

Ưu điểm Độ nhạy kém hơn PCR

Thể tích mẫu nhỏ làm giảm độ
Dễ dàng sử dụng
chính xác
Nhanh chóng
Mẫu xét nghiệm cần được xử lý
Bảo quản lâu dài
nếu không ở dạng dịch
Làm tại chỗ; không cần
Phụ thuộc đánh giá chủ quan của
máy móc, thiết bị
người đọc kết quả

Nhược điểm
 B: Ứng dụng kit test nhanh xác định
bệnh truyền nhiễm: Test nhanh covid
19 Abbott – Panbio TM COVID-19 Ag
Rapid Test Device
Thiết kế và sản xuất thiết bị
• RDT kháng nguyên SARS-CoV-2 áp dụng công nghệ xét nghiệm miễn dịch
dòng chảy.
• Mỗi que xét nghiệm bao gồm một miếng nhựa, vùng nạp mẫu, vùng liên
hợp với các hạt phát hiện, màng nitrocellulose với các kháng thể cố định
và vùng thấm.

Thiết kế dải xét nghiệm dòng chảy và nguyên tắc xét nghiệm
 Công nghệ khuếch đại bạc được áp dụng trong xét nghiệm
kháng nguyên nhanh này:

Kết hợp keo vàng (Au), chất khử và ion bạc bắt đầu phản ứng
giữa ion bạc và chất khử quanh keo vàng, tạo điều kiện tạo ra bạc
kim loại (Ag) (phản ứng khuếch đại bạc)
• Bước 1: Các kháng nguyên được liên kết với các kháng thể có nhãn
vàng dạng keo được bắt giữ bằng các kháng thể bắt giữ được phủ
trên vạch phát hiện.
• Bước 2: Bằng cách kiểm soát phản ứng khuếch đại bạc nói trên kim
loại bạc chỉ được tạo ra ở nhưng vị trí có nhãn keo vàng, tạo thành
kim loại bạc lớn
Câu 1: Nếu mẫu là chất rắn thì có áp dụng được không?

Nếu mẫu là chất rắn, ta phải có một bước ly giải mẫu hoặc tách chiết để mẫu chuyển sang
dạng lỏng rồi bắt đầu tiến hành kiểm tra với que test nhanh
Câu 2: Trên que test thường có vạch chứng và vạch test, có phương pháp nào giúp chỉ có
1 vạch mà phát hiện được không?

Chúng ta sẽ tiến hành ghép kênh, sử dụng các dầu dò kết hợp với “label” đánh dấu màu
khác nhau giúp chúng ta phát hiện được đồng thời que test có hoạt động bình thường
không và kiểm tra mẫu xét nghiệm. Nếu không đánh dấu cùng một màu, ta cũng phân
biệt được mẫu có nhiễm virus hay không nhờ mức độ tín hiệu huỳnh quang. Ngoài ra, vật
liệu Nano có màu phát xạ khác nhau khi mật độ phân tử/ kích thước phân tử khác nhau
 Giúp ta phân biệt được chỉ khi có 1 đường kẻ duy nhất. Như Nano keo vàng kích
thước hạt <100nm có màu đỏ rượu vang nhưng kích thược hạt >100nm lại có màu xanh
tím.

Ví dụ, Định dạng phát hiện ghép kênh của LFA để phát hiện đồng thời các genotyping của
HPV ( ảnh bên)
Câu 3: Ứng dụng của Nano trong que test nhanh là gì giúp tăng độ nhạy
của phản ứng?

- Dựa vào tính chất quang học của vật liệu nano. Mỗi kích thước của vật liệu Nano hấp thụ bước sóng khác

nhau và phát xạ ra màu huỳnh quang khác nhau, nhờ công dụng đó giúp chúng ta thay vì dùng các chất màu

huỳnh quang mà lợi dụng luôn vật liệu nano, chỉ cần thay đổi kích thước/mật độ phân tử giúp ta phát hiện

được phát hiện được.

- Ngoài ra, việc kết hợp các vật liệu nano với nhau  Tăng độ nhạy của phản ứng phát hiện mầm bệnh
Cảm ơn Thầy và các bạn đã
lắng nghe!