ODREĐIVANJE PROTEINA U SERUMU BIURET

METODOM NA SPEKTROFTOMETRU
Proteini su gradivne materije čovjekovog tjela. Sastavljene su od aminokiselina međusobno
povezanim peptidnim vezama.Sastoje se od ugljenika, vodika, kisika, dušika,kad kad sumpora,
fosfora i raznih metala.
Za proteine je karakteristično da sadrže dušik,i to u prilično konstantnom omjeru od 16 %
cjelokupnih proteina.Prema sastavu ,proteini se djele na jednostavne proteine i složene proteine
ili proteide.Jednostavni proteini su izgrađeni samo od aminoliselina,dok proteidi sadrže, osim
svoje proteinske strukture, imaju tzv.neproteinsku ili prostetičnu grupu.Prema prostetičnoj grupi
imaju i proteidi i svoje nazive, nap.lipoproteini koji sadrže lipide,glukoproteini koji sadrže
ugljikohidrate, hemoproteini koji sadrže hem, ili metalo proteini koji sadrže metal kao
prostetičku grupu.
Proteini se u organizam unose hranom, gdje ih razgrađuje nekoliko proteolitičkih
enzima(proteaza).
Razgradnja proteina započinje u želcu,u kojem na njih djeluje pepsin. Razgradnja se nastavlja u
tankom crijevu djelovanjem tripsina i himotripsina,a nastali peptidi razgrađuju se dalje
djelovanjem karboksipeptidaza, aminopeptidaza i konačno dipeptidaza do aminokiselina.
Oslobođene aminokiseline apsorbiraju se iz interstinalnog trakta i prelaze krvotokom u jetru i
ostala tkiva,gdje se iz njih sintetiziraju specifični peptidi i proteini pojedinih organa i tkiva.
Sinteza proteina u organizmu je složen, i genetski uvjetovan proces.U tom procesu značajna je
uloga nukleinski kiselina, deoksiribonukleinske kiseline(DNA) i ribonukleinske (RNA)kiseline.
Razgradnjom proteina nastaju aminokiseline. Aminokiseline nastale razgradnjom tjelesnih
proteina kao i aminokiseline apsorbirane iz intrstinalnog trakta, koje nisu bile korištene za
biosintez proteina, metaboliziraju se procesima transaminacije, oksidativne deaminacije i
dekarboksilacije te u reakcijama dijela molekula uz zadržavanje a-aminokarbonske kiselinske
grupe.
Dušik nastao deaminacijom aminokiselina prelazi u amonijak, spoj vrlo toksičan za organizam a
naročito štetnim djelovanjem za mozak.
Zbog toga se on efikasno uklanja preko Krebs-Henseleitovog ciklusa sinteze ureje u obilku ureje
iz organizma. Prema tome,ureja je konačan produkt metabolizma proteina.
Proteini u krvnoj plazmi imaju razne funkcije:

 Imaju zaštitnu ulogu od infekcija ( protutijela)

 Utiču na koloido-osmotski pritisak i time na raspodjelu vode između vaskularnog i
međustaničnog prostora ( prije svega albumini);
 Djeluju kao puferi,zbog čega su važni za održavanje acidobazne ravnoteže
 Imaju transportnu funkciju, jer se razni lijekovi, neki hormoni, vitamini, oligoelementi i
elektroliti u cirkulaciji vežu za pojedine proteine ( albuminei, transferini i dr.);
 Pojedini proteini imaju specifične funkcije, npr. enzimi, hormoni, inhibitori enzima,
komplement, faktori koagulacije, hemoglobin itd.
 Plazma sadrži albumine, globuline i fibrinogen, dok serum ne sadrži fibrinogen.Ti se proteini
sintetiziraju iz aminokiselina.Albumini i fibrinogen stvaraju se isključivo u jetri, gdje se stvara i
manji dio globulina (a iß globulini), do se veći dio globulina (γ-globulina) stvara u plazma-
stanicama i stanicama retikuloendotelnog sistema (RES).
 Ukupni proteini, albumini i globulini određuju se u krvnom serumu.Serum zdravog čovjeka
sadrži 65 do 80 g/L ukupnih proteina, od čega na albumine otpada 35 do 55g/L, a na globuline
15 do 32g/L. Koncentracija proteina ovisi o prehrani; obično je malo viša u muškaraca nego u
žena, a i vša je u mlađih osoba nego u starijih.
Povećana koncentracija ukupnih proteina (hiperproteinemija) javlja se kod:

 Dehidratacija
 Paraproteinemije i mijeloma
 Ciroza jetre,sarkomi,kroničnim upalama i autoimunim bolestima
Smanjene koncentracije ukupnih proteina (hipoproteinemije) javljaju se kod:

 Prekomjernoj hidrataciji
 Gubitkom proteina iz organizma, smanjenoj sintezi proteina ili pojačano katabolizmu proteina,
npr. hipertireozi ili dijabetesu melitusu
 Teškom nefritisu, a naročito nefrozi proteini se gube putem urina
 Kod opekotina
 Kod enteritisa sa teškim proljevima putem crijeva
 Nedostatkom proteina u hrani, malsorpciji,tuberkulozi, i malignim bolestima
 Jetrene bolesti
Promjene koncentracije albumina
Promjene koncentracije albumina su klinički važne kad je njihova koncentracija u serumu
smanjena (hipoalbuminemija). Kako na albumine otpada 50-60% ukupni proteina, to
hipoalbuminemija obično rezultira hipoproteinemijom pa su joj uzroci isti kao u
hipoproteinemiji.
Hipoalbuminemija je osobito izražena kod nefrotskog sindroma zbog jake proteinurije. Kako
albumini imaju relativno malu molekulsku masu, oko 70000, prvenstveno se gube preko
bubrega, isto tako i pri teškim opekotinama kad prelaze u eksudat ili kod enteritisa kad se
izlučuju kroz oštećenu sluznicu u crijevo.Postoje i dvije urođene greške metabolizma albumina.
Jedna je bisalbuminemija kad se u serumu pojavljuju dvije albuminske frakcije, što međutim
neprate nikakvi patološki simptomi.Druga abnormalnost je analbunemija,kad se albumini uopće
ne sintetiziraju. Kako albumin imaju ulogu u održavanju onkotskog pritiska, u ovom slučaju zbog
nižeg pritiska dolazi do pojave edema.Koncentracije albumina su snižene kod normalne
trudnoće.
 Promjene koncentracije globulina

Povećane koncentracije globulina hiperglobuminemije javljaju se kod:

Hroničnim ifektivnim bolestima , sifilis, geumatskoj groznici,artritisu, bakteriskom endokarditisu,

tuberkulozi, kala-azaru, sarkoidozi, multiplom mijelomu, linfatičnoj leukemiji
 Ciroza jetre
METODE DOKAZIVANJE UKUPNIH PROTEINA

Jedna od najčešće korištenih metoda za utvrđivanje koncentracije serumskih proteina je

zasnovana na principu BIURET reakcije.
U ovoj reakciji bakarni jon reagira sa peptidnim vezana proteina u osnovnom rastvoru gradeći
ljubičasto obojene komplekse koji pokazuju apsorpcioni maksimum na 540 nm.
Reakcija koristi jedan vrlo stabilan reagens i usljed toga je naišla nasvoju široku primjenu u
automatizaciji.
Najčešće korišteni reagensi mogu se podjeliti u dvije grupe.
 Jedna grupa ima koncentraciju natrijum hidroksida (NaOH)od 0.1 do 0.2 mol/L i koncentraciju
bakar sulfata (Cu₂SO₄)na razini 10-30 mmol/L.
 Druga grupa ima koncentraciju natrijum hidroksida 0.5-0.8mol/L, a koncentracija bakar sulfata
od 4-6 mmol/L.
 Princip Biuret reakcije

Spojevi koji u svojoj strukturi posjeduju dvije ili više peptidnih veza daju karakterističnu
ljubičastu boju kada se tretiraju sa razređenim otopinama bakar sulfata pri alkalnim vrednostima
Ph.
Nastanak boje se objašnjava posredstvom stvaranja kompleksa bakar ( II ) jona sa četri atoma
nitrogena, i to po dva od svakog od peptidnih lanaca.