TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN, ĐHQG – HCM

KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC

VI SINH THÚ Y

CÁC KĨ THUẬT SINH HỌC ĐỂ PHÁT HIỆN/

CHUẨN ĐOÁN VI SINH VẬT
GVHD: ThS. Đinh Thị Lan Anh

Nhóm 1:
Trần Thị Hồ Ngọc Thảo 19150455
Đinh Thị Hoài Thu 19150463
Huỳnh Ngọc Trân 19150483
Nguyễn Tài Trung 19150496
Châu Thị Thúy Vy 19150521
Hoàng Thị Yến 19150534
CÁC KĨ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỂ PHÁT HIỆN/CHUẨN ĐOÁN VI
SINH VẬT

TỔNG QUAN

PHƯƠNG PHÁP VI SINH VẬT

PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH

PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. TỔNG QUAN

Kỹ thuật Các kĩ thuật

chuẩn đoán vi chuẩn đoán vi
sinh vật là gì? sinh vật.
Các kĩ thuật chuẩn đoán vi sinh vật

PHƯƠNG
PHƯƠNG PHƯƠNG
PHÁP MIỄN
PHÁP VI SINH PHÁP SINH
DỊCH ĐÁNH
HỌC HỌC PHÂN TỬ
DẤU

MIỄN DỊCH
Nhuộm HUỲNH PCR
QUANG

Nuôi cấy vi MIỄN DỊCH

RT-PCR
sinh EMZYME

GIẢI
MIỄN DỊCH TRÌNH TỰ
PHÓNG XẠ GENE
WGS

HÓA MÔ
MIỄN DỊCH
I. PHƯƠNG PHÁP VI SINH HỌC
1. Nhuộm Gram: quan sát hình thể và cách bắt màu Gram của
Vi khuẩn

- Thuốc thử: dd tím Gentian, dd Lugol,

cồn 95°, dd đỏ fucshin pha loãng.
- Nguyên tắc:
+ Nhuộm tím Gentian: nhuộm tất cả vi
khuẩn thành màu đen
+ Lugol: nhuộm màu tím cho vi
khuẩn, đạm nhạt tùy loại.
+ Cồn 95°: tẩy màu Lugol ở các vi
khuẩn không bám chặt.
+ Fucshin: Nhuộm đỏ vi khuẩn, không
có tác dụng vi khuẩn đã được nhuộm
Lugol.
I. PHƯƠNG PHÁP VI SINH HỌC

2. Nhuộm kháng acid:

• Hóa chất: Carbonfuchsin,

Xanh Methylen, dd acid alcool
• Nguyên tắc: VK kháng acid có
lớp vỏ sáp bao bọc, không bị tẩy
rửa bằng chất tẩy rửa mạnh.
• Kết quả: chỉ trả lời được có hay
không sự xuất hiện của vi khuẩn
kháng acid.
I. PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH ĐÁNH DẤU
- Định nghĩa: là những kĩ thuật phát hiện/chuẩn
đoán vi sinh vật bằng các phản ứng liên kết
kháng nguyên – kháng thể.
- Nguyên tắc: sự kết hợp giữa kháng nguyên và
kháng thể có gắn chất đánh dấu, tín hiệu được
khuếch đại và được đo khi có sự thay đổi về pH;
qua đó phát hiện những bất thường dù vi sinh vật
có định lượng rất thấp.

Loại phản ứng miễn Ngưỡng phát

dịch hiện
Miễn dịch huỳnh quang 0.1

0.0001
Miễn dịch phóng xạ
0.0001
Miễn dịch enzyme
Hóa mô miễn dịch -
Điểm quyết định kháng nguyên (epitope):
phần trên phân tử kháng nguyên có khả
năng liên kết đặc hiệu vào phần liên kết
với kháng nguyên trên phân tử kháng thể
II. PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH ĐÁNH DẤU
1. Miễn dịch huỳnh quang
- 1944, Coons, Creech và Jones.
- Nguyên tắc: sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng
thể có gắn chất huỳnh quang, tín hiệu huỳnh quang
được khuếch đại và được đo dưới nguồn sáng là tia
cực tím.
Phân loại:
+ Kĩ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp
+ Kĩ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp
II. PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH ĐÁNH DẤU
1. Miễn dịch huỳnh quang
a. Miễn dịch huỳnh quang trực tiếp
- Một kháng nguyên gắn với một kháng
thể huỳnh quang trực tiếp.
- Dùng để phát hiện sự hiện diện của
kháng nguyên, được đánh dấu huỳnh
quang với FITC (fluorescein
isothiocyanate – màu vàng) hoặc
Tetramethyl rhodamine isothiocyanate
(TRITC)
- Phát huỳnh quang: 450 – 520nm; 520 –
800nm.
- Kháng nguyên cần phát hiện có màu
xanh lục.
- Phát hiện vi khuẩn với nồng độ rất thấp.
II. PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH ĐÁNH DẤU
1. Miễn dịch huỳnh quang
a. Miễn dịch huỳnh quang trực tiếp

Ủ với kháng thể Loại bỏ kháng

Mô gắn lên Quan sát dưới
có dấu huỳnh thể không bắt
phiến kính kính hiển vi
quang cặp
II. PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH ĐÁNH DẤU
1. Miễn dịch huỳnh quang
a. Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp.
- Nguyên lý: kháng thể thứ nhất tác
dụng trực tiếp với kháng nguyên,
sau đó kháng thể thứ hai - kháng
thể globulin có gắn chất huỳnh
quang gắn vào kháng thể 1.
- Chất phát huỳnh quang và bước
sóng đo tương tự với miễn dịch
huỳnh quang trực tiếp.
- Kết quả: kháng thể cần phát hiện
có màu xanh lá cây
II. PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH ĐÁNH DẤU
1. Miễn dịch huỳnh quang
a. Miễn dịch huỳnh quang gián tiếp.

Ủ với huyết
Ủ với kháng
thanh nghi Loại bỏ
thể globulin Quan sát
Mô gắn lên ngờ chứa kháng thể
có gắn chất dưới kính
phiến kính kháng thể không đặc
huỳnh hiển vi
kháng kháng hiệu
quang.
nguyên
II. PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH ĐÁNH DẤU
1. Miễn dịch huỳnh quang
Trực tiếp
Thời gian ngắn hơn vì chúng chỉ cần một
bước ghi nhãn.
Các kháng thể chính kiên hợp thường đắc
hơn các kháng thể không liên hợn nên chi phí
khá cao.
Ít bước hơn, đơn giản hơn.
Tín hiệu thu được yếu hơn vì không xảy ra
khuếch đại tín hiệu do sử dụng các kháng thể
thứ cấp.
Mỗi kháng nguyên cần một kháng thể tương
ứng.
Giảm thiểu khả năng phản ứng chéo bằng
chất huỳnh quang đã được kết hợp với kháng
thể sơ cấp
Gián tiếp
Phải sử dụng một kháng thể liên hợp để phát
hiện kháng thể chính đẫn đến làm nhiều bước
bổ sung, nên thời gian lâu hơn
Kháng thể thứ cấp tương đối rẻ so với kháng thể
chính. Có thể sử dụng cùng một kháng thể thức
cấp liên hợp trong phát hiện các kháng thể sơ
cấp khác nhau để tiết kiệm chi phí.
Nhiều bước hơn và phức tạp hơn
Kháng thể thứ cấp sẽ liên kết với kháng thể sơ
cấp dẫn đến tín hiệu được khuếch đại và rõ ràng
hơn.
Ngăn ngừa phản ứng chéo bằng cách sử dụng
các kháng thể thứ cấp được hấp thụ trước.
II. PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH ĐÁNH DẤU
2. Miễn dịch enzyme - ELISA
- Kháng nguyên – kháng thể - enzyme.
- Engvall và Perlamann – 1971
- Thực hiện trong các đĩa polystyrene 96
giếng hoặc 384 giếng – liên kết thụ
động.
- Các bước quan trọng:
+ Cố định mẫu
+ Bổ sung mẫu
+ Ủ
+ Đo lường tín hiệu.
- Các loại enzyme: horseradish
peroxidase, phosphatase kiềm,
galactosidase, acetylcholinesterase và
catalase
II. PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH ĐÁNH DẤU
2. Miễn dịch enzyme - ELISA

ELISA ELISA GIÁN

TRỰC TIẾP TIẾP

ELISA
ELISA
CẠNH
SANdWICH
TRANH
II. PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH ĐÁNH DẤU
2. Miễn dịch enzyme - ELISA
a. ELISA trực tiếp.
1 kháng nguyên – 1 kháng thể
Kháng nguyên được cố định trên đĩa và được phát hiện bằng
kháng thể đặc hiệu có đánh dấu HRP.
Enzyme có vai trò xúc tác cho các phản ứng tạo màu và được đo
bằng máy quang phổ.
II. PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH ĐÁNH DẤU
2. Miễn dịch enzyme - ELISA
b. ELISA gián tiếp.
II. PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH ĐÁNH DẤU
2. Miễn dịch enzyme - ELISA
b. ELISA gián tiếp.
II. PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH ĐÁNH DẤU
2. Miễn dịch enzyme - ELISA
c. ELISA sandwich
- Được sử dụng phổ biến nhất.
- Sử dụng cặp kháng thể phù hợp để phát hiện kháng nguyên, kháng nguyên
nằm ở giữa 2 kháng thể.
- KT1: phủ trên bề mặt các giếng – cố định kháng nguyên
- KT2: tạo điều kiện phát hiện kháng nguyên.
II. PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH ĐÁNH DẤU
2. Miễn dịch enzyme - ELISA
c. ELISA sandwich
II. PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH ĐÁNH DẤU
2. Miễn dịch enzyme - ELISA
c. ELISA cạnh tranh
- Sử dụng cặp kháng nguyên – kháng nguyên mẫu và kháng nguyên được đánh
dấu. Kháng thể không được đánh dấu.
- Kháng nguyên cạnh tranh để liên kết với kháng thể.
II. PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH ĐÁNH DẤU
2. Miễn dịch enzyme - ELISA
c. ELISA cạnh tranh
II. PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH ĐÁNH DẤU
2. Miễn dịch enzyme - ELISA
  Direct elisa Indirect elisa Elisa Elisa cạnh tranh
sandwich
Ưu điểm Đơn giản Độ nhạy cao Độ nhạy cao Độ nhạy cao
Nhanh Tính linh Độ đặc hiệu Tính linh hoạt
chóng hoạt cao cao cao
Ít sai sót Đặc hiệu cao

Nhược điểm Độ nhạy kém Quy trình Có nguy cơ Có nguy cơ phản

Tính linh phức tạp phản ứng ứng chéo giữa
hoạt kém Có nguy cơ chéo giữa 2 các kháng
phản ứng kháng thể nguyên
chéo
II. PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH ĐÁNH DẤU
2. Miễn dịch phóng xạ - RIA.

- 1960, Solomon Berson và

Rosalyn Yalow.
- Sử dụng kháng thể có gắn đồng vị
phóng xạ để định lượng kháng
nguyên.
- Nguyên tắc: gắn kết cạnh tranh.
- Phát hiện kháng nguyên với định
lượng rất nhỏ
- Độ nhạy và tính đặc hiệu cao, có
thể phát hiện kháng
nguyên/kháng thể với định lượng
rất nhỏ (nanogram)
II. PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH ĐÁNH DẤU
2. Miễn dịch phóng xạ - RIA.
I. PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH ĐÁNH DẤU
1. Hóa mô miễn dịch.
- Phát hiện sự có mặt của các kháng nguyên trong tế bào và mô
- Thuờng dùng để phát hiện/chuẩn
đoán bệnh ung thư.
- Kháng nguyên – kháng thể liên kết
đặc hiệu, trong đó, kháng thể có
gắn 1 enzyme có thể xúc tác phản
ứng tạo màu.
- Đa dòng – Đơn dòng.
I. PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH ĐÁNH DẤU
1. Hóa mô miễn dịch.
qPCR là gì?

Là một chuỗi phản ứng chuỗi polymerase tạo

ra các sản phẩm khuếch đại được sản xuất
bằng cách sử dụng ánh sánh huỳnh quang.
Trong quá trình khuếch đại, ánh sáng huỳnh
quang liên kết trực ti ếp hoặc gián ti ếp thông
qua đầu dò được dán nhãn, các phân tử DNA
tí ch lũy và các giá trị huỳnh quang được ghi otor-Gene Q MDx 5Plex HRM
lại trong mỗi chu kỳ của quá trình khuếch
đại.
Giá trị ngưỡng Ct
CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN CỦA qPCR

PHÁT HIỆN
PHÁT HIỆN
DỰA TRÊN
DỰA TRÊN
THUỐC
ĐẦU DÒ
NHUỘM
 PHÁT HIỆN DỰA
TRÊN THUỐC
NHUỘM
Các loại thuốc nhuộm được sử dụng:
không đặc hiệu liên kết với DNA sợi
kép bất kì được tạo ra trong quá
trình khuếch đại này, tạo ra ánh
sáng huỳnh quang tăng cường, cho
phép xác định nồng độ DNA ban đầu
dựa trên mẫu chuẩn
NGUYÊN TẮC
 PHÁT HIỆN DỰA TRÊN ĐẦU DÒ
Các loại đầu dò được sử dụng: như một “kẻ bám đuôi” liên kết với trình tự mục
tiêu,nó có tính đặc hiệu và độ nhạy cảm cao.
NGUYÊN TẮC
https://microbenotes.com/radioimmunoassay-principle-uses-
and-limitations/