HPLC

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO- HPLC
(High Performance Liquid Chromatography)

SẮC KÝ
2
MỤC TIÊU HỌC TẬP
1. Giải thích được nguyên tắc hoạt động của máy HPLC
2. Trình bày được cấu tạo của máy HPLC
3. Mô tả được các kỹ thuật của HPLC: sắc ký phân bố, sắc
ký hấp thụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký trên gel, sắc ký ái
lực và sắc ký huỳnh quang.
4. Vận dụng tính toán các chỉ số trong điều kiện chạy HPLC.
3
SẮC KÝ
Sắc ký được ĐN là pp tách một hỗn hợp các chất

thành các chất riêng.
Kỹ thuật này dựa trên sự khác nhau về tốc độ di
chuyển các chất của hỗn hợp qua pha tĩnh dưới ảnh
hưởng của một số dung môi hoặc khí (pha động).
4
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm
1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ PP sắc ký cột cổ
điển.
 HPLC là một PP chia tách trong đó pha động là chất lỏng và
pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới
dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn,
hay một chất mang đã được biến bằng LKHH với các nhóm
chức HC
5
Carbohydrates
1. fructose
2. Glucose
3. Saccharose
4. Palatinose
5. Trehalulose
6. isomaltose
5
2
3
Zorbax NH2 (4.6 x 250 mm) mAU
4
1
70/30 Acetonitrile/Water
6
1 mL/min Detect=Refractive Index
time
6
Separations
Separation in based upon differential
Injector
migration between the stationary and
mobile phases.
Mixer Stationary Phase - the phase which
remains fixed in the column, e.g. C18,
Silica
Pumps Mobile Phase - carries the sample

through the stationary phase as it
moves through the column.
Column
Detector
Waste
Solvents
High Performance Liquid Chromatograph

7
Separations
Injector Chromatogram
Mixer mAU
Pumps
Start Injection time
Column
Detector
Solvents
High Performance Liquid Chromatograph

8
Separations
Injector
Chromatogram
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
9
Separations
Injector
Chromatogram
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
10
Separations
Injector
Chromatogram
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
11
Separations
Injector
Chromatogram
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
12
Separations
Injector
Chromatogram
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
13
Separations
Injector
Chromatogram
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
14
Separations
Injector
Chromatogram
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
15
Separations
Injector
Chromatogram
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
16
Separations
Injector
Chromatogram
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
17
Separations
Injector
Chromatogram
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
18
Separations
Injector
Chromatogram
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
19
Separations
Injector
Chromatogram
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
20
Separations
Injector
Chromatogram
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
21
Separations
Injector
Chromatogram
Mixer mAU
Pumps
Column
Detector
Solvents
22
Separations
Tiêm
mAU
Bơm
Bắt đầu tiêm mẫu Thời gian
Cột
Detector
Dung môi
23
The Chromatogram
tR
tR
mAU Vùng diện tích (chiều cao)
để định lượng
to
Tiêm Thời gian
24
Tại sao lại dùng HPLC
 Phân tích đồng thời

 Độ phân giải cao
 Độ nhạy cao
 Tính lặp lại tốt
 Điều kiện phân tích trung bình
 Dễ phân đoạn và tinh khiết
 Không độc hại
25
2. PHÂN LOẠI HPLC
Các loại HPLC phụ thuộc vào:
 Trọng lượng phân tử của chất tan

 Độ tan trong nước của chất tan
 Sự phân cực của chất tan
 Tính chất ion hóa, tính chất không ion của chất
tan
26
Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia
HPLC thành các loại:
1. SK phân bố
2. SK trao đổi ion hiệu năng cao.
3. SK lỏng hiệu năng cao trên gel
4. SK hấp phụ (sắc ký lỏng rắn)
5. SK ái lực
6. SK đồng phân quang học
27
28
 Pha tĩnh là yếu tố quan trọng quyết định bản chất quá trình sắc ký.
Pha tĩnh Loại sắc ký

Chất hấp phụ SK hấp phụ pha thuận hoặc pha đảo
Chất trao đổi ion SK trao đổi ion
Chất lỏng SK phân bố (SK chiết)
Gel SK gel hoặc rây phân tử
29
 Các loại HPLC:

1. Sắc ký phân bố
2. Sắc ký trao đổi ion
3. Sắc ký lỏng trên gel
4. Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn)
5. Sắc ký ái lực
6. Sắc ký đồng phân quang học
30

2. Sắc ký trao đổi ion.
31
PHÂN LOẠI HPLC
1. Sắc ký phân bố (partition chromatography)
SK phân bố được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích

được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất
rất phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử không quá
lớn (<3000).
32
2.1. Sắc ký phân bố
Pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chất
mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu:
Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp
phụ vật lý → sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid
chromatography).
Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết
33
 Trong quá trình sử dụng, người ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có
nhiều ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng do:
– Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên
dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối
với hợp chất phân tích.
– Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động nên người
ta không thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi.
34
Pha tĩnh
 Hay dùng: dẫn chất siloxan
 Tính chất phân cực phụ thuộc vào các nhóm thế:
- Pha tĩnh ko phân cực: nhóm thế là các gốc hydrocarbon no hoặc
thơm.
- Pha tĩnh phân cực: có các nhóm thế phân cực như amino, nhóm –OH,
nhóm cyano (-CN).
Chú ý: Thường chỉ bên pH từ 2-8. (các pH >8 thì chuyển sang cột
polymer)
35
36
Ảnh hưởng của pha tĩnh
C8
Trung bình
C18 (ODS)
MẪU
Mạnh
C4
MẪU
Yếu
MẪU
37
37
Dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha
động, Sk phân bố được chia 2 loại :
+ Sắc ký pha thường (SK pha thuận): Pha tĩnh phân cực >
Pha động
+ Sắc ký pha đảo: Pha tĩnh phân cực < pha động.
38
 SKPĐ là thuật ngữ để chỉ một loại SK trong đó pha tĩnh ít phân
cực hơn pha động. PP này dùng phân tích các HC từ ko phân
cực đến phân cực.
 Hầu hết các HCHC có mạch carbon dài (ít phân cực) rất thích
hợp cho phân tích bằng SKPĐ. Dung môi sử dụng trong SKPĐ
là các DM phân cực, trong đó nước đóng vai trò quan trọng, rẻ
tiền. Do đó, SKPĐ được ứng dụng nhiều và phổ biến hơn
SKPT.
39
Đặc điểm:
- Sắc ký pha thuận: Chất ít phân cực nhất được rửa giải đầu
tiên  khi tăng độ phân cực của pha động, thời gian lưu
giảm.
- Sắc ký pha đảo: Ngược lại, các chất phân cực được rửa giải
đâu tiên  khi tăng độ phân cực của pha động thì thời gian
lưu tăng lên.
40
Mối quan hệ giữa độ phân cực và thởi gian lưu
41
Nguyên tắc chọn pha tĩnh, pha động
Chọn pha tĩnh và pha động dựa vào độ phân cực

của các thành phần tham gia theo nguyên tắc:
1.Độ p/cực của chất PT hợp với độ p/cực của pha tĩnh,
và khác xa độ p/cực của pha động.
2.Độ p/cực của chất PT hợp với độ p/cực của pha động
và khác nhiều độ p/cực của pha tĩnh.
42
Pha tĩnh của

SK pha đảo
43
Ứng dụng: chủ yếu SK pha đảo
Lĩnh vực Đối tượng phân tích

Dược Kháng sinh, giảm đau, an thần, steroid
Hóa sinh Aminoacid, protein, lipid, carbonhydrat
Thực phẩm Chất làm ngọt, phụ gia, chất chống oxy hóa..
Hóa CN HC thơm, chất màu, chất hđ bề mặt
Môi trường Các chất trừ sâu diệt cỏ, dẫn chất phenol
Hóa pháp lý Các chất độc, thuốc ngủ
Y học lâm sàng Acid mật, các chất chuyển hóa của thuốc
44

45
2.2. Sắc ký trao đổi ion
 Dựa vào lực hút của ion chất tan và vị trí mang điện tích trên pha
tĩnh.
 Chất trao đổi anion có nhóm mang điện tích (+) trên pha tĩnh hút
anion chất tan.
 Chất trao đổi cation có nhóm mang điện tích (-) trên pha tĩnh hút
cation chất tan.
 Chất trao đổi ion là polymer không tan trong nước mang các nhóm
trao đổi ion.
46
47
48
Có 2 loại nhựa trao đổi ion:

-Nhựa trao đổi cation: loại acid mạnh mang nhóm acid
sulfonic, loại yếu mang nhóm acid carboxylic.
-Nhựa trao đổi anion: có nhóm base amin liên kết với
phân tử polymer. Chất trao đổi base mạnh có nhóm amin
bậc 4, dạng base yếu có nhóm amin bậc 2 hoặc bậc 3.
49
copolymer styren - divinyl benzen
50
Một số nhóm hoạt động của nhựa trao đổi ion
Loại Viết tắt Tên Cấu tạo
1. Trao đổi P Sulfopropyl -O(CH2)3- SO3H

cation SE Sulfoethyl -O(CH2)2-SO3H
- Acid mạnh
- Acid trung P Phosphat -OPO3H
bình
- Acid yếu CM Carboxymethyl -OCH2-COOH
2. Trao đổi
anion Trimethylaminpethyl -O(CH2)N+(CH2CH3)3
-Base mạnh TEAE Diethyl (2- -O(CH2)2N+(CH2CH3)2
QAE hydroxypropylquartern CH2CH(OH)-CH3
aryamino
Base trung bình DEAE Diethylaminoethyl -O(CH2)2N(CH2CH3)2
-Base yếu PAB P-amino benzyl
-O-CH2-C6H4-NH2
51
Ứng dụng:
52
Ứng dụng:
- Dùng cân bằng trao đổi ion để tinh chế nguyên liệu
loại tạp chất. Ví dụ các ion kim loại M2+ và anion X-
để điều chế nước tinh khiết (nước khử ion)
-Dùng nhựa trao đổi ion để tăng nồng độ của các thành
phần vi lượng trong dung dịch đủ cho phân tích.
- Áp dụng cho sắc ký
53

54
2.3. Sắc ký lỏng trên gel
 Nguyên lý: Tách riêng các chất dựa vào KT phân tử.
 Ko có liên kết hoặc tương tác hấp phụ với pha tĩnh.
 Các gel có vai trò như các sàng phân tử các chất có KTPT khác nhau
được tách riêng ra. Có các loại:
- SK thấm gel: dùng gel để tách các polymer hòa tan/dung môi. Pha
động kỵ nước.
- Sắc ký lọc gel: dùng gel để tách các polymer sinh học. Pha động ưa
nước
55
56
57
58
59
Pha tĩnh (có các lỗ xốp):

Các loại gel mềm hay dùng: cellulose, dextran,
agarose hoặc poly acrylamid.
Các gel cứng bán cứng: polystyren, alkyl dextran
trong môi trường không chứa nước.
60
61
62

63
2.4. Sắc ký hấp phụ (sắc ký lỏng rắn)
 Nguyên tắc tách là sự hấp phụ của chất phân tích

trên bề mặt pha rắn.
 Pha tĩnh là chất rắn phân cực. Chất phân tích tranh
chấp với pha động ở các vị trí hấp phụ trên bề mặt
pha tĩnh.
64
Sự khác nhau giữa SK phân bố và SK hấp phụ
65
Mobile Phase
1
2
Tương tác yếu

Tương tác
mạnh
Pha tĩnh
66
 Pha tĩnh:
- Slica: hay dùng/ SK pha thuận. Bề mặt có nhiều nhóm
silanol dạng tự do. Hấp phụ mạnh, pH ổn định 2-8.
- Alumina: pH ổn định 2-12. Tách các base hữu cơ.
- Titan oxyd và zirconi oxyd: pH ổn định rộng.
* Pha động: Sử dụng các dung môi hữu cơ thông dụng
67
68
69
70
 Ứng dụng:
- Thường tách các chất phân tích có M dưới 5000, ít
tan /nước hoặc trong hh nước-dmhc không thích hợp với
SK pha đảo.
- Tách các đồng phân vị trí các HCHC.
- Phân tích các chế phẩm dầu mỏ, thực phẩm, dược phẩm.
71

72
2.5. Sắc ký ái lực (affinity chromography)
Dùng TT liên kết đặc biệt để làm sạch hoặc phân

tích các thành phần trong hỗn hợp. Lưu giữ chất phân
tích là do tương tác thuận nghịch và chọn lọc các cặp
có trong cơ thể sống như: Kháng nguyên – kháng thể,
enzym –cơ chất, hormon – receptor…
73
2.5. Sắc ký ái lực
74
75
 Cố định một thành phần của cặp trên một chất mang rắn làm pha
tĩnh đưa vào cột. Mẫu phân tích có thành phần thứ 2 đưa vào cột
nhờ pha động (y/cầu pH, dd đệm). Khi mẫu phân tích qua cột, các
thành phần khác khuếch tán dễ dàng nên được rửa giải vào pic các
chất ko lưu giữ.
 Tương tác đặc hiệu giữa phần chọn lọc và phối tử ái lực trong cột.
 Nhờ dd đệm rửa giải phá vỡ liên kết và đưa thành phần chọn lọc ra
cột.
76
2.5. Sắc ký ái lực
77
78
79
 Phối tử ái lực: yêu cầu đặc hiệu cao. Một số phối tử hay dùng:
Phối tử Chất liên kết

1. Phối tử nguồn gốc sinh học
- Kháng thể - Kháng nguyên
- Chất ức chế, cơ chất, coenzyme - Enzym
- Protein A/ Protein G - Đường, glucoprotein, glucolipid
- Kháng thể
2. Phối tử hóa học
-Boronat - Đường, glucoprotein, các hc diol
-Chất màu triazin - Protein có liên kết nucleosid, các
enzym
-Phức càng cua kim loại - Acid amin, peptid, protein
80
 Các loại hình sắc ký ái lực:

- SK ái lực sinh học: chủ yếu tinh chế enzym
- SK ái lực miễn dịch: Phối tử là kháng nguyên hoặc kháng
thể, chủ yếu tinh chế và PT các chất có nguồn gốc sinh học.
- SKAL phối tử phẩm màu: dùng triazin hoặc
triphenylmethan làm phối tử ái lực để tinh chế enzym, hoặc
các PT sinh học khác.
81
82

83
2.6. Sắc ký đồng phân quang học
 Mục đích: Tách các đồng phân quang học.

 Pha tĩnh thường dùng là slica có gắn cyclodextrin có
khả năng liên kết với các đồng phân đối quang ở các
mức năng lượng khác nhau.
84
85
86
87
88
Tóm lại: Cơ chế của các loại HPLC
SK hấp phụ
SK trao đổi ion SK trên gel
SK phân bố
SK đồng phân quang học SK ái lực 89

3. HỆ THỐNG MÁY HPLC
90
 Bao gồm các bộ phận:

- Hệ thống cấp pha động
- Bơm sắc ký lỏng
- Bộ phận tiêm mẫu
- Cột và pha tĩnh
- Detector
- Hệ thu nhận và xử lý dữ liệu
91
Reservior Tray
System Controller
Auto sampler
Column Oven
UV detector
Degassing Unit
Pump Unit
Low pressure
gradient device
92

- Hệ thống bơm
- Detector
93
3.1. Hệ thống cấp pha động
Pha động thường là 2 dung môi hòa tan vào nhau

để tách với độ phân giải phù hợp. Có 2 cách dùng pha
động rửa giải:
Đẳng dòng: thành phần ko thay đổi/ qt sắc ký
Gradient: Tỷ lệ dung môi thay đổi theo chương trình
đã định.
94
MeOH / H2O = 6 / 4
Long Time Analysis Đẳng dòng
Bad Separation MeOH / H2O = 8 / 2
Đẳng dòng
MeOH%
Gradient
Time
( Column : ODS ) 95
95
Isocratic System
Column
Detector
Injector
Pump Oven
Mobile Phase
Data
processor
Simple system with one pump and one solvent reservoir.

If more than one solvent is used, solvents should be premixed.
96
96
High-pressure Gradient System
pump
B
Mixer
Column Detector
pump Injector
Oven
Data
processor
C
pump • Excellent gradient accuracy.

• 2-3 pumps required - one pump per solvent used.
97
 Một vài loại khí tan /DMHC, khi áp suất cao được bơm,
sự hình thành bong bóng khí tăng làm ảnh hưởng đến qt
tách, giảm hiệu lực cột, nhiễu đường nền và hình dạng của
đỉnh.
 Do đó việc loại khí là rất quan trọng và nó có thể được
thực hiện bằng nhiều cách khác nhau: chạy siêu âm, sục
khí trơ heli…
98
 Lọc chân không: không phải là luôn luôn đáng tin

cậy và đầy đủ.
 Đưa khí Heli: cho khi heli vào dung môi, rất hiệu
quả nhưng Heli rất đắt.
 Siêu âm: sử dụng siêu âm làm chuyển đổi tần số cực
cao thành rung động cơ học
99

- Hệ thống bơm
- Detector
100
3.2. Hệ thống bơm
101
 Tạo áp suất khoảng 5000 psi trở lên

 Các vật liệu trong bơm chịu được tác động của các dmôi (ko
bị ăn mòn). Bơm, van mẫu, cột… được chế từ kim loại titan
(tránh ảnh hưởng đến mẫu sinh học)
 Đảm bảo tốc độ dòng chảy dao động từ 0,01 -10 ml / phút
 Bơm phải có khả năng lấy dmôi từ một bình chứa hoặc nhiều
bình chứa có chứa dmôi khác nhau cùng một lúc.
102
103
Bơm đẩy một pistong
 Nhược điểm: dòng chảy xuất hiện xung dòng, gây

nhiễu detector, giảm độ nhạy.
104
out
pump head check valve

motor and cam
5 - 50µL
plunger
check valve
plunger seal
in
Mobile phase 105
105
out
pump head check valve

motor and cam
5 - 50µL
plunger
check valve
plunger seal
in
Mobile phase 106106
106
 Dung môi được bơm qua lại
bằng một động cơ piston
 Hai van kiểm tra mở và đóng
kiểm soát lưu lượng
 Piston tiếp xúc trực tiếp với
dung môi
 Thể tích nội bộ nhỏ 35-400μL
 Áp suất ra cao đến 10.000 psi
 Khả năng thích ứng tạo hệ
dung môi gradient và tốc độ
dòng chảy liên tục
107
Bơm làm đầy nhanh
Hay dùng
Rẻ
108
Bơm kéo đẩy kéo
Kết nối hai bơm

một pistong
109

- Hệ thống bơm
- Detector
110
3.3. Hệ tiêm mẫu
111
3.3. Hệ tiêm mẫu
 Dung dịch được tiêm thẳng vào pha động cao áp ngay
ở đầu cột mà ko cần dừng dòng bằng một van tiêm có
vòng chứa mẫu.
 Van tiêm tự động hóa, máy tính điều khiển, kiểm soát
hệ bơm mẫu tự động
112

- Hệ thống bơm
- Detector
113
3.4. Cột và pha tĩnh
114
Đầu vào
Cột bảo vệ
Vỏ bảo vệ
bằng nhôm
Cột chính
Đầu ra
115
Cột chế tạo bằng thép không gỉ, thủy tinh, chất dẻo
-Dài 10-30cm, đường kính trong 4-10 mm.
-Cột nhồi có cỡ hạt 5-10micromet
-Chất nhồi cột: silic dioxyd, các hạt gel, nhôm oxyd,
polymer xốp, nhựa trao đổi ion… tùy thuộc vào sắc
ký.
116
Cột bảo vệ (guard column)
 Đặt trước cột sắc ký

 Bảo vệ và kéo dài tuổi thọ của cột tách.
 Ngắn hơn cột sắc ký, được nhồi hạt cùng loại nhưng
có kích thước hạt lớn hơn
117
Điều nhiệt cột
 Để có được sắc ký đồ tốt hơn và có thể lặp lại được,

cần duy trì nhiệt độ cột ổn định.
 Thường trong sắc ký lỏng, vận hành ở RT ko cần
điều nhiệt cột (sắc ký khí phải có). Các máy HPLC
hiện đại thường có thêm hệ thống điều nhiệt cột có
thể lên đến 150oC
118

- Hệ thống bơm
- Detector
119
3.4. Detector
 Phát hiện các chất phân tích có thể dựa vào:

 Đáp ứng chọn lọc với chất phân tích khi detector hấp
thụ bức xạ UV hoặc huỳnh quang.
 Tính chất chung của chất phân tích trong pha động,
như detector chỉ số khúc xạ, độ dẫn điện
120
3.4. Detector
Hiện nay có nhiều loại detector, thường dùng 6 loại

thuộc 2 nhóm quang học và điện hóa:
1.Detector hấp thụ UV-VIS
2.Detector huỳnh quang
3.Detector chỉ số khúc xạ
4.Detector tán xạ bay hơi
5.Detector đo dòng
6.Detector hấp thụ UV-VIS
121
3.4. Detector
 Detector hấp thụ UV-VIS

- Phổ biến nhất, dựa trên sự hấp thụ bức xạ UV-VIS
Ba cấu hình của detector hấp thụ UV-VIS:
+ Detector có bước sóng cố định
+ Detector đo ở bước sóng thay đổi: có bộ thay đổi bước sóng
+ Detector mảng diod
122
123
Spectra
Chromatogram
Absorbanc
gt
e
len
h ave
W
124
125
3.4. Detector
 Detector chỉ số khúc xạ
Photodiode
Reference
Refraction
W Lamp
Sample
126
127
3.4. Detector
 Detector huỳnh quang: Rất nhạy, chọn lọc. Dùng trong

phân tích vết.
128
128
 Ưu điểm:
- Độ nhạy cao hơn máy dò UV-Vis
- Tính chọn lọc cao vì ít chất có huỳnh quang
 Nhược điểm:
- Khó đoán được huỳnh quang
- Bị ảnh hưởng lớn bởi môi trường: Dung môi, pH, nhiệt độ,
độ nhớt, cường độ ion, khí tan
129
129
3.4. Detector
Detector tán xạ bay

hơi:
Là detector vạn năng
đ/ứng với bất kỳ
chất ptích nào kém
bay hơi hơn so với
pha động của sk
lỏng
130
3.4. Detector
Detector điện hóa: Phát hiện chất ptích dựa vào độ dẫn điện của
pha động có mặt các chất ptích ion hoặc dòng điện tạo thành do
p/ứ oxy hóa khử ở điện thế xác định
Có 2 loại:
- Detector độ dẫn: Thích hợp sk ion, chất phân tích là ion mang
điện.
- Detector đo dòng: Loại này nhạy nhất, điện cực dễ bị nhiễm bẩn
131
4. CÁC ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG
4.1. Hằng số cân bằng K

Là tỉ lệ phân bố giữa 2 pha được tính như sau:
Với CS: nồng độ cấu tử trong pha tĩnh.
CM: nồng độ cấu tử trong pha động.

Hệ số K tùy thuộc vào bản chất pha tĩnh, pha động và chất phân tích.
132
4.2. Thời gian lưu

tR : thời gian lưu của một cấu tử từ khi vào cột đến
detector.
tO : thời gian để cho chất nào đó không có ái lực
với pha tĩnh đi qua cột; cũng là thời gian pha động
đi từ đầu cột đến cuối cột (còn gọi là thời gian lưu
chết).
tR' : thời gian lưu thật của một cấu tử.
133
4.3. Hệ số dung lương k’

Với VS : thể tích pha tĩnh
VM : thể tích pha động
Nếu k’~ 0, tR~ tM: chất ra rất nhanh, cột không có khả năng
giữ chất lại.
Nếu k’ càng lớn (tR càng lớn): chất ở trong cột càng lâu, thời
gian phân tích càng lâu, mũi có khả năng bị tù.
Khoảng k’ lý tưởng là 2-5, nhưng khi phân tích một hỗn hợp
phức tạp, k’ có thể chấp nhận từ 1-20. 134
4.4. Số đĩa lý thuyết N

đặc trưng cho khả năng tách mũi
sắc ký của các cấu tử trên cột.
N càng lớn, hiệu năng tách càng cao.
Với:
W1/2 là chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí ½ chiều cao mũi
W: chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí đáy mũi

135
4.5. Độ chọn lọc

Đặc trưng cho khả năng tách hai chất của cột.
Thông thường, α dao động 1,05-2 là tốt. Nếu α càng lớn

thì thời gian chạy sắc ký sẽ kéo dài.
136
4.6. Độ phân giải

Là đại lượng biểu thị rõ cả ba khả năng của cột sắc
ký: sự giải hấp phụ, sự chọn lọc và hiệu quả tách. Nó
được xác định qua phương trình sau:
137
Bài 1. Khi chạy sắc ký một hỗn hợp 2 chất A và B thu được thời
gian lưu lần lượt là 10,8 phút và 11,7 phút, chiều dài của cột là 40
cm. Một chất không lưu giữ qua cột ở 1,7 phút. Chiều rộng đáy
pic của A và B tương ứng là 1,51 phút và 1,65 phút. Tính:
a. Tính số đĩa trung bình?
b. Hệ số chọn lọc cho A và B?
c. Độ phân giải?
138

HPLC

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

You might also like

HPLC

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

HPLC

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO- HPLC

(High Performance Liquid Chromatography)

Sắc ký được ĐN là pp tách một hỗn hợp các chất

Pumps Mobile Phase - carries the sample

High Performance Liquid Chromatograph

Start Injection time

High Performance Liquid Chromatograph

Start Injection time

Start Injection time

Start Injection time

Start Injection time

Start Injection time

Start Injection time

Start Injection time

Start Injection time

Start Injection time

Start Injection time

Start Injection time

Start Injection time

Start Injection time

Start Injection time

Bắt đầu tiêm mẫu Thời gian

Tiêm Thời gian

 Phân tích đồng thời

Các loại HPLC phụ thuộc vào:

 Trọng lượng phân tử của chất tan

Pha tĩnh Loại sắc ký

 Các loại HPLC:

 Các loại HPLC:

1. Sắc ký phân bố (partition chromatography)

SK phân bố được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích

Chọn pha tĩnh và pha động dựa vào độ phân cực

Pha tĩnh của

Lĩnh vực Đối tượng phân tích

 Các loại HPLC:

Có 2 loại nhựa trao đổi ion:

copolymer styren - divinyl benzen

Loại Viết tắt Tên Cấu tạo

1. Trao đổi P Sulfopropyl -O(CH2)3- SO3H

 Các loại HPLC:

Pha tĩnh (có các lỗ xốp):

 Các loại HPLC:

 Nguyên tắc tách là sự hấp phụ của chất phân tích

Tương tác yếu

 Các loại HPLC:

Dùng TT liên kết đặc biệt để làm sạch hoặc phân

Phối tử Chất liên kết

 Các loại hình sắc ký ái lực:

 Các loại HPLC:

 Mục đích: Tách các đồng phân quang học.

SK trao đổi ion SK trên gel

SK đồng phân quang học SK ái lực 89

 Bao gồm các bộ phận:

 Bao gồm các bộ phận:

3.1. Hệ thống cấp pha động

Pha động thường là 2 dung môi hòa tan vào nhau

Bad Separation MeOH / H2O = 8 / 2

Simple system with one pump and one solvent reservoir.