Chương IV.

Các phương pháp tinh

sạch sản phẩm
4.1 Các phương pháp sắc ký
4.1.1 Sắc ký trao đổi ion
4.1.2 Sắc kí ái lực
4.1.3 Sắc kí lọc gel
4.1.4 Sắc kí đảo pha
4.1.5. Sắc kí tương tác kỵ nước
4.2 Phương pháp kết tinh

1
 Sắc ký trao đổi ion.

• Sự phân tách xảy ra do ái lực khác nhau của

các ion trong dung dịch đối với các trung tâm
trao đổi ion (nhóm chứa ion) trên chất rắn là
pha tĩnh. Pha tĩnh là nhựa trao đổi ion.
• Dung môi là nước hoặc hỗn hợp nước- dung
môi hữu cơ trong môi trường có độ điện môi
tương đối lớn để các ion có thể tồn tại tự do
và bền.

2
Phương pháp SK trao đổi ion

Nguồn protein Enzyme thô

Tách chiết Kết tủa

Tinh sạch
Lọc gel Trao đổi ion

3
 Phương pháp trao đổi ion
1. Nguyên tắc của phương pháp
2. Các dạng sắc ký trao đổi ion
3. Nhựa trao đổi ion
- Tính chất của nhựa
- Cách lựa chọn nhựa
4. Thao tác thực hiện quá trình.
- lựa chọn dung dịch đệm

4
 1. Nguyên tắc trao đổi ion
• Protein là phân tử tích điện. Có thể ở dạng
điện tích dương hoặc điện tích âm, cũng có
thể trung hòa về điện

Cation pH=pI Anion

pH tăng
5
 2. Các dạng sắc ký trao đổi ion
• Có 2 dạng tích điện (+) và (-) của phân
tử protein
• Liên kết với các nhóm chức tích điện
trái dấu

- Dạng sắc ký trao đổi anion (anion exchange

chromatography)
- Dạng sắc ký trao đổi cation (cation exchange
chromatography)
6
 3. Nhựa trao đổi anion

- -
+ Anion exchanger tích điện
+ - dương bao quanh

- + -

7
8
9
10
11
 Carboxymethyl Sephadex®, CM
Sephadex®
Properties
•bead size: 40-125 μm (dry)
•pore size
~200,000 Da exclusion limit
•operating pH: 6 - 10
•compatibility
mode of use weak cation exchange chromatography

12
 Khả năng và dung lượng trao đổi ion

• Khả năng xác định bởi nhóm chức, trao đổi

mạnh hay yếu tùy theo khả năng ion hóa khi
thay đổi pH
• khả năng mạnh: ion hóa trong dải pH rộng
Ví dụ DEAE:- trao đổi ion yếu
SP: trao đổi ion mạnh
Định lượng khả năng trao đổi ion để liên kết ion.
Tùy thuộc vào số nhóm chức
13
 DEAE Sephadex®,
Diethylaminoethyl Sephadex ®

Properties
•bead size: 40-125 μm (dry)
•pore size
~30,000 Da exclusion limit
•operating pH: 2 - 9
•Capacity: 3-4 meq/g ion exchange capacity

Compatibility: mode of use mixed weak and strong anion

exchange chromatography

14
 Sulfopropyl Sephadex ®

• bead size
40-125 μm (dry)
• pore size
200,000 exclusion limit (av. mol. wt.)
• operating pH
2 - 10
• capacity
2.0-2.6 meq/g ion exchange capacity
• compatibility
mode of use strong cation exchange chromatography

15
 Cách lựa chọn nhựa trao đổi ion
1/ Dựa vào độ bền của protein
-Nếu bền ở giá trị pH thấp hơn pI thì dùng cationit
-Nếu bền ở giá trị pH cao hơn pI thì dùng anionit
2/ Dựa vào kích thước phân tử protein
-Nhỏ hơn 10 000 Da, sử dụng nhựa có kích thước lỗ
nhỏ
-Từ 10000 Da đến 100 000 Da- loại tương đương
sepharose
3/ Lưu ý: Lựa chọn buffer phù hợp
16
Table 1. Buffers for cation exchange
chromatography
pH Substance Conc. Counter- pKa (25˚C)1
interva (mM) ion
l
1.4– 2.4 Maleic acid 20 Na+ 1.92
2.6–3.6 Methyl malonic acid Li+ , Na+ 3.07
20
2.6–3.6 Citric acid 20 Na+ 3.13
3.3–4.3 Lactic acid 50 Na+ 3.86
3.3–4.3 Formic acid 50 Li+ , Na+ 3.75
3.7–4.7 Succinic acid 50 Na+ 4.21
5.1–6.1 Succinic acid 50 Na+ 5.64
4.3–5.3 Acetic acid 50 Li+ , Na+ 4.75
5.2–6.2 Methyl malonic acid Li+ , Na+ 5.76
50
5.6–6.6 MES 50 Li+ , Na+ 6.27
6.7–7.7 Phosphate 50 Na+ 7.20
7.0–8.0 HEPES 50 Li+ , Na+ 7.56
17
7.8–8.8 BICINE 50 Na+ 8.33
 Lựa chọn đệm, chọn đúng
*Đối với anionit (DEAE) dùng :
-Tris, imidazole, pyridine
* Đối với cationit (CM) dùng đệm :
-axetat, citrat, phosphat
PH:
Đối với cationit PH= pI-1
Đối với anionit pH=pI+1
Sử dụng muối: NaCl và KCl.

18
 SỬ DỤNG Ở BƯỚC NÀO CỦA QUÁ TRÌNH
TINH SẠCH?

Quá trình trao đổi ion có thể sử dụng sau khi
kết tủa muối hoặc sau khi lọc gel.
-Nếu kết tủa muối thì cần thẩm tích trước khi
sắc ký
--Có thể dùng trực tiếp ngay sau khi lọc gel 19
 Table 2. Buffers for anion
exchange chromatography.
pH interval Substance Conc. (mM) Counter-ion pKa (25˚C)1

4.3–5.3 N-Methylpiperazine 20 Cl- 4.75

4.8–5.8 Piperazine 20 Cl-or HCOO- 5.33

5.5–6.5 L-Histidine 20 Cl- 6.04
6.0–7.0 Bis-Tris 20 Cl- 6.48
6.2–7.2 Bis-Tris propane 20 Cl- 6.65
8.6–9.6 Bis-Tris propane 20 Cl- 9.10
7.3–8.3 Triethanolamine 20 Cl- or CH3COO- 7.76

7.6–8.6 Tris 20 Cl- 8.07

20
 Table 2. Buffers for anion
exchange (cont.)
8.0–9.0 N-Methyldiethanolamine SO4 8.52
20

8.0–9.0 N-Methyldiethanolamine Cl- or CH3COO- 8.52

50

8.4–9.4 Diethanolamine 20 at pH Cl- 8.88

8.4
50 at pH 8.8
8.4–9.4 Propane 1,3-diamino 20 Cl- 8.88

9.0–10.0 Ethanolamine 20 Cl- 9.50

9.2–10.2 Piperazine 20 Cl- 9.73
10.0–11.0 Propane 1,3-diamino 20 Cl- 10.55

10.6–11.6 Piperidine 20 Cl- 11.12

21
 Choosing your ion-exchanger: know
your proteins

• Stability of proteins
- stable below pI value, use cation-exchange
- stable above pI value, use anion-exchanger
• Molecular size of proteins
- <10,000 mw, use matrix of small pore size
- 10,000-100,000 mw, use Sepharose equivalent grade
• Other specific requirements
-Inactivation of specific buffer types, then limit choice of
ionexchanger
22
23
24
25
26
 Câu hỏi
• Nguyên tắc của phương pháp?
• Các dạng sắc ký trao đổi ion?
• Mục đích của phương pháp dừng ở bước
nào của quá trình tinh sạch?
• Thao tác thực hiện quá trình.
• Có thể sử dụng bất kỳ loại nhựa nào với
dung dịch đệm không?

27
 3.3. Tính chọn lọc của nhựa trao đổi
ion

• Tính chọn lọc biểu hiện ở ái lực của nhựa với

các ion. Nhựa có thể trao đổi với ion này trong
dung dịch dễ hơn ion kia. Ái lực tương đối của
các ion với nhựa có thể sắp xếp thành dãy đối
với từng loại nhựa:

28
 a/ Nhựa sunfon:

• Trong dung dịch loãng ở nhiệt độ thường thì :

-ái lực của cation với nhựa tăng khi điện tích của
cation tăng: Na+<Ca 2+< Al3+
- Với các cation có cùng điện tích thì ái lực trao
đổi tăng khi bán kính của các ion tăng:
Li+<H+<Na+< NH4+< K+
Mg 2+< Ca2+< Sn2+< Ba2+

29
 b/ Nhựa có nhóm cacboxylic,
aminoaxetat
• Các loại nhựa này có nhóm chức có khả năng tạo phức với các
cation kim loại. Sự phụ thuộc cùng chiều của ái lực của nhựa với
các cation kim loại theo độ bền của phức các nhóm chức với ion
kim loại.
H+>Ca2+>Mg2+>Li+>Na+>K+>Rb+.
• Đối với các ionit nhóm chức aminoaxetat:
Fe2+>Mn2+>Ca2+>Mg2+>Ba2+>Sn2+Li+Na+>K+
• Đối với anionit bazơ mạnh:F-<OH-<Cl-<NO3-<Br-<I-<SO42-
• Đối với anionit bazơ yếu: F-< Br-<I-<NO3 -<SO4 2-<OH-

30
 MECHANISM OF ION-EXCHANGE
CHROMATOGRAPHY OF AMINO ACIDS
pH2

- + +
SO3 Na H3 N
COOH

Ion-exchange Resin

- +
SO3 H3 N
-
COO pH4.5
+
Na

31
 Các yếu tố ảnh hưởng tới vận tốc
trao đổi
• nhiệt độ,
• kích thước hạt,
• mức liên kết ngang,
• bản chất nhóm chức.

32
 6-Kỹ thuật sắc ký trao đổi ion

6.1. Cột trao đổi ion

• Người ta thực hiện trên cột có chứa ionit
• Ionit sau khi đã ngâm trương trong nước được đưa
vào cột cùng với nước để tránh bọt khí giữa các
hạt. Lượng ionit chiếm 2/3 thể tích cột. Cột thường
có kích thứớc: D:H= 1:810. Trên cùng đổ 1 lớp
bông thủy tinh dày 3-5 mm và một lớp bi thủy tinh
dày 1-2 cm để lớp ionit không bị xáo trộn.

33
 6.2. các giai đoạn

• -a/ Hấp thu ion của dung dịch phân tích trên
ionit:
• Để giữ cho toàn bộ ion trong dung dịch cần sử
dụng lượng ionit lớn hơn lượng tính toán. Nếu
cationit dạng axit yếu HR thì dung dịch chảy
qua có tính axit. Khi làm thay đổi pH sẽ làm
thay đổi khả năng trao đổi ionit

34
 Các giai đoạn (2)
• - giải hấp ion bị hấp thu
• Ion bị hấp thu được tách ra khỏi ionit bằng
dung dịch thích hợp như dung dịch axit ở nồng
độ khác nhau.
• - rửa ionit để loại trừ hết dung dịch giải hấp
nằm giữa khe hở của hạt ionit

35
 Các giai đoạn (3)
• - tái sinh ionit: Giai đoạn này đưa ionit về
dạng ban đầu bằng cách cho chảy qua cột
dung dịch HCl 2-4% , NaCl, đối với cationit
hoặc NaOH 2-4% đối với anionit
• - rửa ionit sau khi đã tái sinh: bằng nước cất
• * Có thể sử dụng nhiều cột và thực hiện liên
tục

36