DENEY HAYVANLARI HİSTOLOJİSİ

Dr. Özlem ÖZBEY ÜNLÜ

19 Aralık 2015
SUNUMUN İÇERİĞİ
*Deney hayvanı nedir?

*Histolojiye giriş, dört temel doku

*Histoloji laboratuvarında kullanılan gereçler

*Histolojide çalışma yöntemleri

*Preparat hazırlama yöntemleri
*Boyama yöntemleri

*Preparatların yorumlanmasındaki problemler

*Mikroskop ve çeşitleri

*Farklı doku/sistemlere ait preparat örnekleri

 DENEY HAYVANI

Biyomedikal alanlarda (biyoloji,

tıp, veteriner hekimlik, ziraat, ilaç
sanayisi); hipotezi bilimsel kurallara göre
oluşturulmuş araştırmalarda ilaç,
madde, tedavi vb. etkinliklerin, canlı
organizmadaki sonuçlarının elde
edilmesi için kullanılan hayvanlardır.

Elde edilecek sonuçların,

hedeflenen canlının (genellikle insan)
problemlerine çözüm oluşturması
beklenir. Bu nedenle araştırıcının
deney hayvanları üzerinde temel
bilgiye sahip olması gerekir.
 İlk deney hayvanı kullanımına M.Ö.
400 yıllarında yazılan Corpus Hippocraticum
kitabında rastlanmıştır.
O dönemde hayvanlar üzerinde
yapılan incelemeler sadece anatomik yapıyı
belirlemeye yöneliktir.

Deneysel denilebilecek ilk

uygulamalar Galen tarafından
uygulanmıştır. Galen domuz ve köpeklerin
bazı organlarını vücudundan ayırarak, çeşitli
organların fonksiyonlarının nasıl olduğunu
görmeye çalışmıştır (ilk fizyolojik çalışmalar).
 Deney hayvanlarının (DH) deneylerde kullanılma
sıklığına göre sınıflandırılması
*DNA yapıları insana çok benzer.

EN ÇOK ORTA AZ ÖZEL DENEYLERDE *Fazla yer kaplamaz, üretilmeleri çok

KULLANILAN DÜZEYDE KULLANILAN KULLANILAN
KULLANILAN kolaydır ve çok sayıda ürerler.

FARE KOBAY KOYUN KURBAĞA *Gebelik süresi: 3-4 hafta

SIÇAN HAMSTER İNEK YILAN *Yavru sayısı: bir defada 8–12
TAVŞAN MAYMUN KEÇİ SİRKE SİNEĞİ *Sütten kesilme: 3-4 hafta (anne
DOMUZ AT DİĞER BAZI yeniden doğurganlığa kavuşur)
OMURGASIZLAR
*Üreme için belli bir mevsim
KEDİ TAVUK gözetmezler.

*Memeliler grubunun oldukça iyi

temsilcileri olup alınacak bir sonucun
insanlara da uygulanabilme olasılığı
yüksektir ve benzer etkiler gösterir.
 Histoloji, dokuların yapısını mikroskobik
düzeyde inceleyen bilim dalıdır.

Histoloji (Histo= Doku,

Logos= Bilim)
hücre
hücre doku organ organ sistemi organizma
(üriner sistem)

Hücre: Tüm canlı organizmaların yapısal birimidir.

Doku: Belirli bir fonksiyonu yerine getirmek üzere aynı

yönde farklılaşmış hücrelerin oluşturduğu birliğe denir.

*Yüksek organizasyonlu organizmalarda dört temel doku

kesin olarak ayırt edilebilir.
DÖRT TEMEL DOKU

*Epitel Doku
*Bağ ve Destek Doku
*Kas Doku
*Sinir Doku
EPİTEL DOKU BEZ E.
ÖRTÜ E.
*Vücudun iç ve dış yüzeyini örter.

*Damarsızdır.
DUYU E.
*Koruma, salgı yapma, duyu alma vs. görevleri vardır.

1-Örtü epiteli (tek, çok, yalancı çok katlı)

2-Bez epiteli (bir hücreli, çok hücreli-ekzokrin,endokrin)
3-Duyu epiteli (tad-koku alma, işitme, görme)
BAĞ VE DESTEK DOKU

*Temel bağ doku: Organların bir arada tutulmasını sağlayan dokudur.

*Kıkırdak doku: Esnek,dayanıklı,hafif sert dokudur.Omurgalılarda

kemik doku ile beraber iskeleti oluşturur (Hiyalin, elastik, fibröz).

*Kemik doku: İskeleti oluşturur, vücuda desteklik sağlar,iç

organlara tutunma yüzeyi oluşturur, mineral madde deposudur.

*Yağ doku: Organları darbelere karşı korur, yedek besin

deposudur, vücut ısısını korur.

*Kan doku: Çeşitli maddeleri taşıma,vücudu mikroplara karşı

koruma,vücut ısısını düzenleme, pıhtılaşma sağlar.
KAS DOKU

*Güç oluşumu ve hareket sağlanmasından sorumludur.

*Çizgili kas: İsteğimiz doğrultusunda çalışırlar.
*Düz kas: İsteğimiz dışında çalışırlar.
*Kalp kası: Çizgili kas olmasına rağmen isteğimiz
dışında çalışırlar.
SİNİR DOKU

*Uyartıları alma , iletme ve gerekli cevapları verme özelliği

olan hücrelerden (nöron) yapılmıştır.

(perikaryon)
 HİSTOLOJİ LABORATUVARINDA KULLANILAN GEREÇLER

ISITMA TABLASI/KARIŞTIRICI HASSAS TERAZİ

ETÜV

SU BANYOSU
SANTRİFÜJ
MİKROSKOP
pH METRE

MİKROTOM

PETRİ BUZDOLABI

SAF SU CİHAZI
LAM-LAMEL
BALON ERLEN

HUNİ
BEHER
MEZÜR
 PUAR
ÇEKER OCAK PİPET

PİSET CAM ŞİŞE

TÜP DENEY TÜPLERİ VE SPORLAR TÜP FIRÇALARI

TERMOMETRE
PENS MAKAS
 BİYOLOJİK MATERYAL İNCELEME YÖNTEMLERİ

1)İn vivo inceleme: Bu yöntemde hücre veya organizmalar,

yaşadıkları doğal ortam içinde incelenirler.

2)İn vitro inceleme: Organizmadan alınan parçalar incelenir.

Histolojide en sık kullanılan yöntem, ışık mikroskobu

ile incelenebilen preparatların hazırlanmasıdır.
 PREPARAT HAZIRLANMASI

Mikroskobik inceleme için

hücre ve dokulardan iki şekilde
preparat hazırlanır:

1-Geçici (taze) preparatlar

2-Kalıcı (daimi) preparatlar
 GEÇİCİ (TAZE) PREPARATLARIN HAZIRLANMASI
Canlıdan veya yeni ölenden alınan dokular mikroskop
altında hemen incelenir.

Amniyon sıvısı
Sperm

Kan Beyin-omurilik sıvısı

 KALICI PREPARATLARIN HAZIRLANMASI
İstenildiği kadar bekletilebilir. İki şekilde hazırlanır:

1-YAYMA PREPARATLAR (FROTİ)

2-KESİT PREPARATLAR
a-Parafin kesit tekniği
b-Dondurma kesit tekniği (kriyo kesitler)
1-YAYMA PREPARATLAR (FROTİ)
*Kan, kemik iliği
*lenf sıvısı,
*beyin omurilik sıvısı (BOS),
*sperm vb…

1-Yayma (lam üzerine bir damla)

2-Kurutma (oda ısısında)
3-Tespit (metil alkol)
4-Boyama (Giemsa, Pappenheim, Wright)
5-Kapatma

YAYMA
2-KESİT PREPERATLAR
a) Parafin kesit tekniği
1-Doku eldesi: Canlı (insan/deney hayvanı) ya da kadavradan
2-Tespit (fiksasyon): Otoliz veya bakteriyel lizisi önlemek
ve fizyolojik yapıyı korumak için (daldırma-perfüzyon).
*%10 Formalin, %4 Gluteraldehit, Bouin, Zenker en sık
kullanılan fiksatiflerdir.
 FİKSATİFLER
1-Ölüm sonrası bozulmaları önlemek için hücre
içine olabildiğince hızlı nüfus etmeli,

2- Hücre içeriğini bozulmadan çöktürmeyi,

3-Dokuyu daha sonra yapılacak işlemler sırasında

büzülmekten korumayı,

4-Dokuların boyalarla boyanabilmesini sağlarlar.

 Fikse edilecek dokunun tümü fiksatif içinde
kalmalıdır. Fiksatifin miktarı parça
büyüklüğünün 20-50 katı kadar olmalıdır.

 Tespit süresi fiksatifin geçiş hızına ve etki

biçimine bağlı olarak çok değişik olmakla
birlikte bu süre, fiksatifin parçanın her
tarafına girebilmesini ve parçanın yeterli
sertlik kazanmasını sağlayacak kadar
olmalıdır.

 Tespit genellikle oda sıcaklığında (20oC)

veya 4oC’de (buzdolabı) yapılmalıdır.
3-Yıkama: Dokudaki fiksatifin fazlasını giderir.

4-Sudan kurtarma: Yıkanan dokuların suyu

(Dehidrasyon) ALKOL ile alınır.

5-Saydamlaştırma: Dokulardaki alkol KSİLOL, Toluol,

Kloroform ile giderilir.

6-Parafine gömme: Ksilol, PARAFİN (60oC)

ile yer değiştirir.
7-Kesit alma: Mikrotom aracılığıyla lam üzerine kesit alınır.

1 mm = 1000 mikrometre (µm)

1 mikrometre = 1000 nanometre (nm)
1 nanometre = 10 angstrom (Ao)
8-Boyama:

1-Kimyasal
2-Ağır metal tuzları çöktürülerek
3-Histokimyasal
4-İmmünohistokimyasal
9-Kapatma: Entellan (yapıştırıcı) ve lamel kullanılır.
 8-Boyama:
1-Kimyasal: Asidik ya da bazik boyalar
*Asidik (Eozin, Oranj G, asit fuksin) boyalar

*Bazik (Hematoksilen,toluidin mavisi,metilen mavisi) boyalar

2-Ağır metal tuzları çöktürülerek: Gümüş, civa gibi

Gajal gümüşleme-gümüş
Golgi cox-civa
3-Histokimyasal: Çeşitli organik ve inorganik maddelerin
doku ve hücre içindeki varlığını ve yerleşimini belirlemeye
yarar.

Anyon, katyon, protein, lipid, polisakkaritler, enzim,

pigment, vitaminler gösterilebilir.

Bir seri kimyasal olaylar zincirinin ardından renkli

madde çöktürülerek şiddeti kabaca tayin edilebilir.
 HİSTOKİMYASAL METODLARA ÖRNEKLER

Demir: Prusya mavisi, dalakta/makrofajlarda

Lipidler: Dondurma kesit. Sudan black: siyah; oil red: kırmızı
DNA: Feulgen reaksiyonu, kırmızı reaksiyon verir
RNA: Toluidin veya metilen mavisi gibi bazik boyalar
Fosfatlar: Kemik dokusu için, gümüş nitrat solüsyonu
Polisakkaritler ve oligosakkaritler: Periyodik Asit Schiff
(PAS) (+) dir.
Enzimler: Dondurma kesitlerde, Alkalen fosfataz, Asit
fosfotaz, ATPaz vb…
Proteinler: İmmünohistokimyasal yöntemlerle gösterilirler
Demir-Prusya mavisi-dalak
Lipid-oil red sudan black

DNA-Feulgen rea.-testis spermatogonyum

Lassa RNA virüsü-karaciğer-toluidin mavisi

*Kemikleşme bölgesi
*Gümüş nitrat solüsyonu
*Kalsiyum fosfat
lokalizasyonu
 Bağırsak
Fırçamsı kenar ():
polisakkarit içeriği, PAS (+)
G: Goblet hücreleri

Böbrek-bazal membran/PT-fırçamsı kenar-PAS (+)

Böbrek
Gomori yöntemi
Alkalen fosfataz enzimi
lokalizasyonu
8-Boyama -Enzim
4-İmmünohistokimyasal -Floresan
a) Direkt yöntem
-Altın
partikülü

b) İndirekt yöntem
 DAB (Diamino Benzidin)-kahverengi

Mide kanseri-PCNA

AEC (Amino etil karbazol)-kırmızı

Meme kanseri-ER
 İmmünofloresan

HeLa hücreleri
Kırmızı: aktin
Mavi: nükleus
Yeşil: COX-4 (cytochrome c oxidase polypeptide 4)
 KESİT PREPARATLAR
b-Dondurma kesit tekniği (kriyo ya da
frozen kesitler)
Organ ya da doku
parçalarından hızla preparat elde
edilmesi gerektiği durumlarda veya
kriyomikrotom histokimyasal boyama metotlarında
bu yöntem kullanılır. Lipidler,
enzimler, vs. çalışılmasında etkilidir.
 PREPARATLARIN YORUMLANMASINDAKİ PROBLEMLER

Mikroskopta inceleme aşamasına gelen kesitte canlı

dokuda gözlenmeyen bozulma, katlanma, boşluklar
oluşabilir.
Bütün bunlara “Artefakt” ya da “Preparasyon
Hatası” denir.
ok: bıçak izi/çizilme
f: katlantı
t: yırtık

yırtık

bıçak izi
 Ayrıca, üç boyutlu
yapıların iki boyutlu olarak
incelenmesi yorumlama
hatalarına neden olabilir.
Doku mimarisini iyi
bilmek bu aşamada çok
önemlidir.
MİKROSKOP
Temeli, doku bileşenleri ile ışık arasındaki etkileşime dayanır.
-Mekanik parçalar
-Optik parçalar (kondansör, objektif, oküler)

MAGNİFİKASYON: Büyütme oranı

REZOLÜSYON (ÇÖZÜNÜRLÜK)
MİKROSKOP ÇEŞİTLERİ
*Işık mikroskobu
*Faz-kontrast mikroskobu
*Diferansiyal interferans mikroskobu
*Polarizasyon mikroskobu
*Konfokal mikroskobu
*Floresan mikroskobu
*Elektron mikroskobu (EM)
Transmisyon (Geçirmeli) Elektron Mikroskobu (TEM)
Scanning (Taramalı) Elektron Mikroskobu (SEM)
Işık mikroskobu

Faz kontrast mikroskobu

Diferensiyal interferans mikroskobu

Transmisyon Elektron Scanning Elektron
Mikroskobu (TEM) Mikroskobu (SEM)
Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM)

Büyütme – 40X-600 000X TEMGA Ünitesi

Scanning Elektron Mikroskobu (SEM)

Büyütme: 25X-250 000X

TEK KATLI YASSI EPİTEL-BÖBREK TEK KATLI KÜBİK EPİTEL-TİROİD

ÖRTÜ EPİTELİ

TEK KATLI BASİT PRİZMATİK EPİTEL-MİDE

ÇOK KATLI YASSI EPİTEL-DERİ

YALANCI ÇOK KATLI

PRİZMATİK EPİTEL-TRAKEA
 BEZ EPİTELİ NÖROEPİTEL
(DUYU EPİTELİ)
GOBLET HÜCRESİ-TRAKEA
TAT TOMURCUĞU-DİL
 BAĞ DOKU
GEVŞEK ve DÜZENSİZ SIKI BAĞ DOKU-DERİ

DÜZENLİ SIKI BAĞ DOKU-TENDON

KAN
KEMİK İLİĞİ
 KIKIRDAK-KEMİK DOKU
KIKIRDAK

KEMİK
 KAS DOKU
ÇİZGİLİ KAS-EKSTREMİTE DÜZ KAS-SİNDİRİM SİSTEMİ

KALP KASI-KALP
 SİNİR DOKU-SİNİR SİSTEMİ
SEREBRUM MEDULLA SPİNALİS

SİNİR UZANTILARI SEREBELLUM

 KARDİYOVASKÜLER SİSTEM

DAMAR
KALP
 SOLUNUM SİSTEMİ
EPİGLOTTİS AKCİĞER-BRONŞİOL

AKCİĞER-ALVEOL
 SİNDİRİM SİSTEMİ
DUDAK DİL

MİDE
ÖZEFAGUS
BAĞIRSAK-DUODENUM REKTUM

KARACİĞER PANKREAS
 ÜRİNER SİSTEM
BÖBREK ÜRETER

MESANE
 LENFORETİKÜLER SİSTEM
DALAK TİMUS

LENF DÜĞÜMÜ
 ERKEK GENİTAL SİSTEMİ
TESTİS PENİS

EPİDİDİMİS DUKTUS DEFERENS

 DİŞİ GENİTAL SİSTEMİ
OVARYUM TUBA UTERİNA

UTERUS VAJİNA
 BEŞ DUYU SİSTEMİ
GÖZ İÇ KULAK BURUN

DERİ
DİL