HLA VÀ ỨNG DỤNG

Trình bày: PGS.TS. Lê Xuân Hải

Trưởng khoa Miễn dịch
Viện Huyết học-Truyền máu Trung Ương
 Nội dung chính
 HLA là gì
 Di truyền HLA
 Vai trò HLA
 HLA và ghép
 Ứng dụng khác
 HLA = MHC
 HLA: Human Leukocyte Antigen (kháng
nguyên bạch cầu người)
 MHC: Major Histocombility Complex (phức
hợp hòa hợp tổ chức chính)
 Các locus gen HLA ở người
Chromosome

class class class

HLA-locus
145 144 873 2069 1016 1519 No. of allele
*
*
IMGT/HLA Database http://hla.alleles.org/nomenclature/stats.html

DP DQ DR Bổ thể B C A

HLA-lớp II HLA-lớp I
HLA-DR HLA-A
HLA-DQ HLA-B
HLA-DP HLA-C
 HLA có ở đâu
HLA lớp I HLA-G ?
- Nhau thai
- Ức chế miễn dịch

Tất cả các tế bào có nhân

HLA lớp I

HLA lớp II

Đại thực bào Lympho B Tế bào Đuôi gai

Quá trình xử lý và trình diện kháng nguyên
bởi phân tử HLA/MHC
HLA có tính đa hình KN lớn
(dựa trên kiểu hình phenotype)

250 221
188
200
150
76 85
100
32 42
50 10 18
0
DPA DPB DQA DQB DRB B C A
Vì sao HLA có tính đa hình cao?

 Xem xét 2 khả năng

 Tất cả các cá thể đều có hệ HLA giống
nhau.
 Mỗi cá thể có 1 hệ HLA khác nhau.
Nếu mọi cá thể đều có HLA giống nhau

Virus

MHC
Vì mọi người có HLA giống nhau

Chết do Chết do Chết do

hậu quả hậu quả hậu quả
của nhiễm của nhiễm của nhiễm
virus virus virus

Virus

MHC
Nếu mỗi cá thể có HLA khác nhau

Virus

MHC
Nếu mỗi cá thể có HLA khác nhau

Chết do
nhiễm
virus. Do
có type
HLA đặc
biệt

Virus

MHC
 Tính đa hình kháng nguyên HLA
nhằm bảo đảm mọi cá thể trong một loài
có tính nhạy cảm khác nhau với cùng
một tác nhân nhiễm trùng
 Di truyền HLA người

AB CD

AC AD BC BD
 100% cơ hội bố mẹ cho con hoặc con cho
bố mẹ phù hợp 50% HLA.
 25% cơ hội tìm được anh chị em ruột phù
hợp hoàn toàn HLA.
 50% cơ hội tìm được anh chị em ruột phù
hợp 50% HLA
 Thực tế phức tạp hơn
Mother Father

A/B C/D

A/C A/D B/C B/D A/R1 R2/C R2/R1

Possible children of parents with HLA haplotype A/B and C/D

R1=C-D recombination
R2=A-B recombination
 Người cho nào tốt nhất
100
% mảnh ghép Anh chị em phù hợp HLA

Người ngoài phù hợp HLA

50

Người ngoài có >2 HLA không phù

hợp
sống

0
1 2 3 4 5
Thời gian sống (năm)
 HLA và ghép
 Trong ghép tạng, HLA được coi là kháng
nguyên ghép.
 Vấn đề thải ghép (ghép tạng)
 Vấn đề ghép chống chủ (ghép tủy)
 Các loại ghép chính
 Ghép tự thân (autograft)
 Ghép đồng loài (allograft)
 Ghép khác loài (xenograft)
Các ứng dụng ghép đồng loài
 Thải ghép đồng loài do miễn dịch?
Mảnh ghép thải
trong 14 ngày

Dòng A Dòng B
mảnh ghép

Mảnh ghép B thải

trong 7 ngày

Mảnh ghép C thải

Dòng C Dòng B trong 14 ngày

Như vậy, thải ghép đồng loài mang 2 đặc tính quan
trọng của hệ miễn dịch - đặc hiệu và trí nhớ.
Những vị trí ưu ái miễn dịch
 Các vị trí mà ở đó mảnh ghép không hòa
hợp vẫn sống được. Ví dụ:
 Tiền phòng mắt
 Não

 Những nơi thiếu hệ lympho hoàn hảo.

 Các tế bào có bộc lộ phân tử FasL
 Mảnh ghép giác mạc hoặc sụn  có lớp
nhày bao phủ che lấp HLA
 Tinh hoàn  tinh hoàn có bộc lộ FasL
 Vai trò của FasL

Fas Fas L

Lympho T
Tinh hoàn
Cơ chế thải mảnh ghép đồng loại
IL-2, IFN-g, TNF

Th1 CTL CD8+

Lớp II
Lớp I
Đại thực bào
Tế bào ghép

ADCC
Khoảng 10% tế bào lympho của chúng ta có thể phản
ứng lại MHC ngoại lai
Cơ chế nhận diện KN ghép
Các xét nghiệm cần làm trước ghép

 Nhóm máu ABO: cần phù hợp

 Đọ chéo (Cross match):
 Lympho người cho  huyết thanh BN
 Lympho BN  Huyết thanh người cho

 Nuôi cấy hỗn hợp lympho (MLR)

 Tiền mẫn cảm (PRA)
 HLA typing
 Nuôi cấy lympho hỗn hợp
Nhận Cho
Tăng
+ sinh tế
bào
(chiếu xạ)

 Tế bào tăng sinh mạnh  độ không phù hợp cao.

 Tế bào tăng sinh yếu  độ không phù hợp thấp
 Tế bào không tăng sinh  100% phù hợp
 Giúp phát hiện bất cứ sự khác biệt kháng nguyên nào
giữa người cho và người nhận.
 Các phương pháp phát hiện KT
kháng HLA
 Các xét nghiệm sàng lọc:
 Luminex, flow PRA
 ELISA

 Vi độc lympho (tăng nhạy bằng AGH)

 Xét nghiệm thêm/Khẳng định: bằng xét

nghiệm kháng nguyên đơn (Luminex, flow PRA,
ELISA).
 Sàng lọc kháng thể
• Dựa trên nguyên lý tế bào
• Các xét nghiệm pha rắn: Các điểm có lợi
– Tăng độ nhạy và độ đặc hiệu
– Làm lượng lớn, tự động hóa, thời gian có kết quả
nhanh.
– Các phản ứng được ghi theo thang giá trị liên tục
• Các loại xét nghiệm miễn dịch pha rắn
– ELISA
• truyền thống
• DynaChip®
– Dựa trên nguyên lý hạt
• Luminex®
• flow cytometry
 ELISA
DynaChip®
ELISA
Các vi chip thủy tinh

Phiến xét nghiệm

Máy đọc phiến tự động

Máy phân tích DynaChip®
 Flow PRA® Luminex xMAP®
negative positive
1
2 2
Bead set Bead array
3
4
FL2
5 5
6
7
8

FL1

Scattergram

Fluoroanalyzer
 HLA typing (vi độc tế bào)
 Vi độc tế bào. Dùng xác định kiểu kháng nguyên phân
tử HLA trên tế bào
Ab kháng HLA1

+ bổ thể
Người cho Người nhận

Tế bào chết, bắt màu xanh

Vai trò của xét nghiệm HLA trong ghép

 Xác định mức độ hòa hợp tổ chức giữa người cho

và người nhận.
 Tìm được người cho phù hợp nhất.
 Là một biện pháp dự phòng thải ghép/ghép
chống chủ
 Thuật ngữ về HLA
Cấp độ kháng nguyên Cấp độ Allele
Dựa trên tính đặc hiệu huyết thanh Dựa trên trình tự DNA

HLA- A2 DRB1*0401
HLA- B7
HLA-Cw8
HLA-DR4 Locus Allele
HLA-DR52 Tương đương huyết thanh
HLA-DQ5 (nếu biết)

Một số kháng nguyên có thể Lưu ý: nhiều allele có thể cùng

được “chia” thành các kháng
nguyên liên quan mật thiết:
HLA-A9 chia thành =
HLA-A24
HLA-A23
có một kháng nguyên HLA:
DRB1*0401, *0402,
*0405, *0407 = DR4
Các kỹ thuật SHPT định tuýp HLA

• PCR-SSP: dùng mồi đặc hiệu trình tự

• PCR-SSOP (luminex): dùng dầu dò
oligonucleotide đặc hiệu trình tự
• SBT: định tuýp dựa trên trình tự
• NGS: định tuýp dựa trên phương pháp giải
trình tự gen thế hệ mới (mới nhất)
 SSP và SSOP
• Hai phương pháp hay dùng nhất để định tuýp ở
mức độ kháng nguyên
• Khác nhau ở cách phát hiện các HLA
– SSP dùng các đoạn mồi nucleotide để khuếch
đại các allele hoặc các nhóm allele đặc hiệu.
– Sau khi khuếch đại đặc hiệu locuss, SSOP
dùng các đoạn đầu dò nucleotide để phát
hiện các trình tự DNA đặc hiệu riêng có cho
các allele hoặc nhóm allele.
• Cả hai đều có thể sử dụng để định tuýp ở mức
độ allele, nhưng điều này đòi hỏi mở rộng nhiều
đoạn mồi và đoạn đầu dò hơn đắt hơn
 SSP SSOP
5’ 3’
3’ 5’ 3’ 5’
Đoạn mồi gắn đặc hiệu và
Đầu dò gắn đặc hiệu và
xảy ra khuếch đại.
có thể được phát hiện
nhờ tín hiệu phát ra.
5’ 3’
3’ 5’
Đoạn mồi không gắn và không
xảy ra khuếch đại. Rửa

= đoạn mồi hoặc đầu dò

= DNA thử nghiệm Đầu dò không đặc hiệu và
tách ra trong lúc rửa
 Phát hiện bằng SSP

Cho các đoạn mồi mã hóa

Các amplicon gien ‘housekeeping” để làm
đặc hiệu nội chứng khuếch đại.
allele/nhóm
allele Các amplicon đặc hiệu allele
khác nhau về kích thước phân
Amplicon tử.
chứng
Gel thạch có cho EtBr do vậy
có thể nhìn thấy các amplicon
khi soi qua đèn chiếu.
Thức đo kích thước phân tử
 Reverse SSOP
• Support Platforms
Reporter – Nylon membranes
Amplified – Nitrocellulose strips
Strepavidin test DNA – Microtiter plates
Biotin – Luminex® beads
5’ 3’ – Microchips
• Reporter Molecules
3’ 5’ – Fluorescent labels
– Enzyme + substrate
Đầu dò
Reverse or indirect SSOP is the most common form of SSOP. In rSSOP,
the test DNA is labeled during amplification and tested against a set of
probes bound to a matrix.
Sequence Based Typing (SBT)

• Tested DNA is amplified with a

mixture of normal nucleotides and
fluorochrome labeled, dye
terminators (dideoxynucleotides).
• Dye terminators stop strand
elongation.
• Yield is a mixture of different
sized DNA fragments.
• Fragments are separated by
electrophoresis.
• Identified with fluorescence
detector in automated DNA
sequencer.
Một số ứng dụng khác HLA typing

 Xác định huyết thống

 Tìm trẻ lạc
 Xác định bị lẫn con khi mới sinh
 HLA typing có thể dùng để
+ Xác định quyền thừa kế theo huyết thống

A/B C/D E/F

A/C, A/D, B/C, B/D

 HLA typing có thể dùng để
+ Tìm trẻ lạc

A/B C/D E/F G/H

A/C, A/D, B/C, B/D E/G, E/H, F/G, F/H

 HLA typing có thể dùng để
+ Xác định bị lẫn con ở nhà hộ sinh

A/B C/D E/F G/H

A/C, A/D, B/C, B/D E/G, E/H, F/G, F/H

 HLA typing có thể dùng để
+ Xác định bị lẫn con ở nhà hộ sinh

A/B C/D E/F G/H

A/C, A/D, B/C, B/D E/G, E/H, F/G, F/H A/C, A/D, B/C, B/D
 Làm gì để tránh thải ghép?
 Chọn người cho phù hợp
 Phù hợp HLA
 Tiền mẫn cảm

 Đọ chéo

 Thuốc chống thải ghép

 Cách tính độ phù hợp HLA
 Cách 1:
 Trùng 1 HLA-A: 10%
 Trùng 1 HLA-B: 15%
 Trùng 1 HLA-DR: 25%
 Cách 2:
 Dựa vào số kháng nguyên HLA trùng trên tổng số
HLA quan tâm
 Ví dụ: 6/6, 5/6, 4/6, 3/6, 2/6, 1/6 và 0/6.
 Với ghép TBG tạo máu: tối thiểu phải là 4/6 (áp
dụng cho ghép TBG máu cuống rốn), tủy và máu
ngoại vi phải là 6/6 với độ phân giải cao.
 Các thuốc chống thải ghép
Dược chất Cơ chế tác dụng ứng dụng

corticosteroids, Kháng viêm, hạn chế Ghép tạng, quá mẫn,

prednisone huy động tế bào T và tế tự miễn
bào đơn nhân MNV

cyclosporine, Ức chế lympho T sản

tacrolimus xuất IL-2 Ghép tạng

Ức chế sự hoạt hóa

ripamycin Ghép tạng
lympho T bởi IL-2
 Các thuốc chống thải ghép

Dược chất Cơ chế tác dụng ứng dụng

azathioprine, 6-MP Chuyển hóa purine Ghép tạng

methotrexate Chuyển hóa folate Ghép tạng

cyclophosphamide, Alkyl hóa DNA, Bệnh tự miễn,

melphalan RNA và protein Ghép tạng

Tia xạ Làm giảm lympho Ung thư/ghép tủy

 Bệnh ghép chống chủ (GVHD)
 Khi mảnh ghép có chứa các lympho T trưởng
thành chúng sẽ tấn công tổ chức người nhận gây
ghép chống chủ.
 Là trở ngại chính khi ghép tủy.
 Các biện pháp phòng ghép chống chủ:
 Xử lý tủy xương để loại bỏ lympho T.
 Dùng tủy xương tự thân.
 Sử dụng máu cuống rốn.
Bệnh ghép chống chủ ở người
 Ghép chống leukemia

Allogeneic
BM cells

MHC

Normal T cells
cell Cancer

MHC

Graft vs
Graft vs
Host effect
Leukemia effect
 Các khía cạnh đạo đức?

 Nhu cầu ghép tạng quá lớn (tim, gan, thận,

phổi, tụy, da…)
 Quy mô gia đình nhỏ
 Vấn đề chết não
 Vấn đề lấy tạng từ người cho sống
 Vấn đề lấy tạng từ người chết não
 Vấn đề tôn giáo
 Vấn đề đạo đức
Khía cạnh đạo đức

Đem bán nội tạng!

 Khía cạnh đạo đức

 May mắn
thay ---
HLA có tính
đa hình
 HLA và mang thai
 Vấn đề
 Mẹ mang thai 9 tháng 10 ngày
 HLA của thai chỉ giống mẹ 50%

 Tại sao thai lại không bị đào thải sớm hơn

(sảy thai)?
 Tại sao đến kỳ thì sinh (đào thải)?
Tại sao thai không bị mẹ loại thải?

C/D
A/B

A/C, A/D, B/C, B/D

Về bản chất, thai là một mảnh ghép đồng loài

Dòng A Ghép Dòng B

đôi

Gây miễn dịch với

kháng nguyên từ
bố

Mảnh ghép da Thai vẫn sống

bị đào thải
 Tại sao thai không bị mẹ loại?
 Nhau thai có chức năng như một màng
lọc.
 Nó lọc các kháng thể kháng HLA.
 Trophoblast – lớp ngoài cùng của thai
không tiếp xúc trực tiếp với máu mẹ.
 Trophoblast không biểu hiện HLA hoặc
biểu hiện rất yếu.
 Tại sao thai không bị mẹ loại?
 Mẹ sinh hormone Progesteron có tác dụng
ức chế miễn dịch.
 Nhau thai có bộc lộ FasL
 Nạo phá thai nhiều lần có thể kích hoạt hệ
thống miễn dịch mẹ chống lại thai  vô
sinh do miễn dịch.
 Tóm lại
 Tại sao mảnh ghép đồng loài bị đào thải?
 Làm gì để chọn đúng người cho, người
nhận phù hợp?
 HLA
 Nuôi cấy hỗn hợp lympho (MLR)

 Ai là người cho tạng tốt nhất?

 Dùng thuốc gì để chống thải ghép?
 Vì sao mẹ không đào thải thai?
Hết