Professional Documents
Culture Documents
DNA Ve Özellikleri
DNA Ve Özellikleri
İzolasyonu
DNA çift sarmal şeklinde birbirine sarılan
İki zincirden oluşur.
Nükleotid
Sarmal yapı insan için 4 bazın (harf) yan yana dizilerek 3.2 milyar bazdan oluşan 46 ciltlik bir
kitap serisi oluşturur. Bu seri bireyi oluşturan bilginin yazıldığı alfabeyi içerir.
Genetik Materyalin Özellikleri;
1- Kendini eşleme
2- Bilgi Depolama
3- Bilgiyi ifade edebilme
4- Vasyasyona sahip olabilme
DNA ısı ile denature ve renature olabilmektedir.
PCR ile DNA yapay olarak üretilebilmektedir
- DNA jel elektroforez ile boyutlarına göre ayrılabilmektedir
DNA İzolasyonu
DNA izolasyonu dokudan dokuya ve türden türe göre çok fazla değişiklik gösterse de genel
itibari ile izolasyon aşamalarını 6 kısma ayırmak mümkündür.
Bitkisel, bakteriyel ve sert dokulardan DNA izolasyonu için ilk önce hücrelerin
tamamen parçalanması gereklidir. Mortar ve pestle (havan) bu işlem için en çok kullanılan
cihazların başında gelir.
• Eğer DNA izolasyonu hemen başlanacaksa örneklerin doğrudan lizis tamponu içerisinde
ezilmesi uygundur.
• Örnekler -80’de saklanacaksa sıvı azot içerisinde ezilerek saklanması daha uygundur.
DNA İzolasyonu
2. Ezilmiş hücrelerin extraksyion tamponunda ısıtılması ( 60 Dak)
Ekstraksiyon Tamponu:
%2 (w/v) CTAB (Cetyltrimethyl-ammonium bromide)
1.42 M NaCl,
5mM Askorbik Asit,
CTAB: katyonik bir deterjan olup , polisakkarit ve
20 mM EDTA polifenollerin DNA’dan ayrılmasını sağlar.
Tris-HCl (pH:8)
%0.2 PVP 40. NaCl: Nükleik asit çöktürmesinde kullanılan değerli
1-2 damla β-merkaptoetanol katyondur.
Isıtma işlemi hücrelerin EDTA: DNazların kofaktörü olan Mg+2’ a bağlanarak, DNaz
tamamen lisiz edilerek enzimini inhibe eder.
proteinlerin
parçalanmasını ,yağların çözünür
hale getirilmesini ve daha çok Tris-HCl: Ortam pH’ sını tamponlamak amacıyla kullanılır.
DNA’nın serbest kalmasını sağlar
DNA İzolasyonu
3. Hücresel atıkların DNA’dan ayrılması (santrifügasyon)
Kloroform: yağların çözülerek, ara bir fazda hapsedilmesine ve faz ayrımına yardımcı olur
İzoamil alkol: DNA’nın içinde bulunduğu bir üstfaz oluşmasına sağlar, köpüklenmeyi önler
DNA İzolasyonu
5- DNA’nın alkol ile çöktürülmesi
• Spektrofotometreler, temel olarak sıvı örneğe belli bir dalga boyunda ışık gönderdikten
sonra bunun ne kadarının sıvı içerisinde absorbe edilmeden geçip gittiğini ölçer.
• Sıvının içindeki madde ne kadar fazla ise soğurulan ışığın miktarı o kadar fazla olur.
Gönderilen ve geçen ışık miktarının oranından, absorbans adı verilen optik yoğunluk
değeri (OD) ölçülür.
Nükleik asitler bir çok dalga boyunda absorbans gösterse de, maksimum soğurma yaptığı ışık
260 nm dalga boyundadır.
DNA İzolasyonu
6- DNA miktar ve kalitesinin ölçülmesi
• Nükleik Asit (DNA, RNA) örnekleri 260nm, Proteinler 280 nm dalga boylarında maksimum
absorbansa sahiptir.
• Bu iki dalga boyunda elde edilen absorbansların oranı bize ‘saflık’ derecesini verir.
• Benzer şekilde 230nm dalga boyunda elde edilen absorbanslar ‘Kontaminasyon’ olarak
kabul edilir.
• Nükleik Asitler için saflık değerini 260/280 oranı verir. Beklenen saflık değeri; DNA
ölçümleri için : ~ 1,8 RNA ölçümleri için : ~ 2,0 kabul edilir.
• "Saf" bir nükleik asit için 260/230 değerleri genellikle 1.8 - 2.2’dir.
DNA İzolasyonu
6- DNA miktar ve kalitesinin ölçülmesi
• Nükleik Asit (DNA, RNA) örnekleri 260nm, Proteinler 280 nm dalga boylarında maksimum
absorbansa sahiptir.
• Bu iki dalga boyunda elde edilen absorbansların oranı bize ‘saflık’ derecesini verir.
• Benzer şekilde 230nm dalga boyunda elde edilen absorbanslar ‘Kontaminasyon’ olarak
kabul edilir.
• Nükleik Asitler için saflık değerini 260/280 oranı verir. Beklenen saflık değeri; DNA
ölçümleri için : ~ 1,8 RNA ölçümleri için : ~ 2,0 kabul edilir.
• "Saf" bir nükleik asit için 260/230 değerleri genellikle 1.8 - 2.2’dir.
Kolon temelli DNA izolasyonu
• Hazır kit sistemleri parçalanmış hücrelerin silika jel içeren bir tüpten
geçirilmesine dayanmaktadır. Bu jel DNA’ya yapışarak katı fazlı bir
extrasksiyon yapar.