、 Mtb 在细胞实验中诱导 SP110 的表达，

预测靶向 miRNA
 结核杆菌感染后的 CFU 变化

时间可考虑为结核杆菌感染
48H 后
结核杆菌感染后的细胞活力变化
结核杆菌感染后的流式细胞凋亡

THP-1

Propldlum iodlde

Annexin V
采取组织样本提取 RNA 做 qPCR 验证

别的文章取样量在结
核病人 38 左右，控
制组一样的数量
 采取组织样本免疫组化，注意，我这借鉴的图为小
鼠肺泡组织，最后取样组织显微镜形态可能不一样，
（别人做的数量为八次重复）

control tuberculosis
SP110
确定 SP110 在结核杆菌感染后的表达（ WB,QPCR ）上调

- + - + :BCG
在 THP-1 细胞中进行了表
达量验证，证实三种亚型中
SP110-b 表达量最高
二、 miRNA-6857 与 SP110 为靶向结合，
并反向调节 SP110 表达
通过数据库筛选确定五个靶向结合 miRNA
预测 MiRNA-6857-3P 和 SP110 3’UTR 的靶向结合位置， targetscan
 与 miRNA Mimic nagetive control+ psiCHECK-2-SP110-
vb-3′UTR 比 较 ， miR-4772-3p mimics+ psiCHECK-2-
SP110-vb-3′UTR 、 miR-4659b-5p mimics+ psiCHECK-2-
SP110-vb-3′UTR 的 R/F 值有所降低， P ＜ 0.05 ，具有

统 计 学 差 异 ； miR-6857-3p mimics+ psiCHECK-2-SP110-

vb-3′UTR 的 R/F 值明显降低， P ＜ 0.001 ，具有极显

著差异；
与 miRNA Mimic nagetive control+ psiCHECK-2-SP110-vb-
3′UTR-6857m 比， miR-6857-3pmimics+ psiCHECK-2-
SP110-vb-3′UTR-6857m 的 R/F 值降低， P ＞ 0.05 ，没
有统计学意义
 qPCR 确定 MiRNA-6857-3P 转染是否成功

8
m iR N A -6 8 5 7 e x p re s s io n

2
* ****

0
- + - + ： Mtb - + - + ： Mtb
control-inhibitor miRNA-3857-3P-inhibitor control-mimic miRNA-3857-3P-mimic
 control miRNA-3857-3P ： mimic control miRNA-3857-3P ： inhibitor

- + - + ： Mtb ： Mtb
- + - +

SP110 SP110
三、 Mtb 诱导 miRNA-6857 过表达，激活
PI3K-AKT-mTOR 通路抑制细胞自噬
确定 miRNA-6857-3P 表达差异性最大时候的 MOI 和时间
 miRNA-6857-3P 与通路 PI3K-AKT-mTOR 相关

BCG - + - + - + - +

Control-mimic + + - - + + - -
miRNA-6857-3P-mimic - - + + - - + +

P-I3k -123kDa

-56kDa
P-AKT
-55kDa
（未磷
酸）
P-mTOR -289kDa
-289kDa
p-P70S6K

RAW264.7 THP-1
PI3K-AKT-mTOR 磷酸化增强，趋势都一致
 Control miRNA-6857-3P-inhibitor miRNA-3857-3P-mimic

H37Ra: - + - + - +

-15-kda
LC3-I/II -13-kDa

P62 -62-kda

ACTB -42-kda
 LC3-II/I
8
**
6

2 ***

miRNA-6857-inhibitor 促进自噬， miRNA-6857-mimic 抑制自噬

确定 MiRNA-6857-3P-inhibitor MiRNA-6857-3P mimics 转染后免
疫荧光情况

H37Ra miRNA-6857-3P-inhibitor miRNA-6857-3P-mimic

确定 miRNA-6857-3P 抑制自噬
加入自噬诱导剂处理，加入 mTOR 抑制剂（ Rapamycin ），看自噬情况

miRNA-6857-3P-inhibitor miRNA-3857-3P-mimic

Rapamycin - + - - + -
:

-15-kda
LC3-I/II -13-kDa

P62 -62-kda

ACTB -42-kda
miR-6857 的过度表达阻断了 RAPA 和 3-MA 诱导的巨噬细胞自噬流量
 BCG BCG+miRNA-6857-mimic BCG+miRNA-6857-inhibitor

R
A
P
A

 免疫荧光中，， miR6857 模拟物减少了雷帕霉素诱导的 LC3 点

状点的数量，而 miR6857 抑制剂增加了点状点的数量
四、 miRNA-6857 通过细胞自噬调节巨噬
细胞抗菌作用
 CFU 的测量，以及三天后的 CFU MiRNA-6857-3P mimics 中细菌增加 MiRNA-
6857-3P-inhibitor 中细菌减少

免疫荧光证实 miRNA-6857-3P 促进结核杆

菌胞内生存，抑制自噬
miRNA-6857-
3P control

miRNA-6857-
3P mimic

miRNA-6857-
3P inhibitor
miRNA-6857-3P qPCR 结
果显示过表达质粒和敲除
质粒表达成功
CFU 的测量，以及三天后的 CFU MiRNA-6857-3P mimics 中细菌增加 MiRNA-
6857-3P-inhibitor 中细菌减少，两种细胞（ RAW264.7 和 THP-1 细胞）上验证

miRNA-6857 促进胞内细菌生长
五、 SP110 是结核分枝杆菌感染期间巨噬
细胞自噬和吞噬体成熟激活所必需的 ,
SP110 过表达可以消除了 miRNA-6857 过表
达介导自噬抑制活动，促进了胞内细菌的
生存
 构建 SP110 敲减质粒

SP110

10 ** ** control
8 H37Ra
siRNA-SP110+control
6
siRNA-SP110+H37Ra
4

0
RAW264.7 THP-1
 siRNA-control siRNA-SP110

rapa rapa

SP110 敲除后自噬减少
 BCG + + + + + + + +

pcDNA3.1-control + - - - + - - -

pcDNA3.1-SP110 - + + + + + + +

control mimic - - + - + - + -

miRNA-6857-3P mimic - - - + - - - +

P-I3k
P-AKT

P-mTOR

p-P70S6K
LC3 II/I
P62
PI3K-AKT-mTOR 磷酸化增强，趋势都一致
可参考此图修改为折线
图，更美观
CCK8 测量不同分组里面细胞
活力
BCG+mimic-miRNA-nc BCG+miRNA-6857-mimic BCG+miRNA-6857-mimic+pcDNA3.1-NC BCG+miRNA-6857-mimic+pcDNA3.1-SP110

加流式图