MİKROSKOP ÇEŞİTLERİ

Arş. Gör. Dr. Yasemin ÇİÇEK

 Mikroskop: Gözle görülemeyecek kadar
küçük olan cisimleri mercekler
sistemiyle (objektif ve oküler)
büyüterek, materyalin görüntüsünü
düzgün bir şekilde göze yansıtan optik
bir alettir.
 Mikroskoplar aydınlatma kaynağı esas
alınarak ve oküler adedine göre
sınıflandırılır.

 Aydınlatma kaynağına göre;

Işık mikroskopları
Elektron mikroskopları.
Monoküler mikroskop Binoküler mikroskop

Trinoküler mikroskop
Işık Mikroskobu
 Hücreyi görmek ve tanımak üzere ilk
kullanılan araç ışık mikroskoplarıdır.

 Işık mikroskopları ışığın bazı

özelliklerinden yararlanılarak yapılmıştır.
Işığın Özellikleri
 Yansıma
 Kırılma
 Transmisyon ve absorbsiyon
 İnterferens
 Polarizasyon
 Difraksiyon
 Floresansı indükleme
Işık Mikroskobu

 Günümüzde kullanılmakta olan ışık

mikroskopları, genel olarak 0,4 µm (400 nm)
ile 0,7 µm (700 nm) arasındaki görünür dalga
boyundaki ışınları kullanırlar.

 Bu mikroskoplar mekanik ve optik olmak

üzere iki ana bölümden oluşur.
 Mekanik bölüm

 Mikroskop ayağı
 Preparat tablası
 Makro ve mikro vida
 Objektif tablası
 Tüp
 Optik bölüm
• Işık kaynağı
• Kondansör ve
diyafram
• Objektifler
• Oküler
 Mikroskobun büyütmesi şu
şekilde hesaplanır

 MİKROSKOP BÜYÜTMESİ= OKÜLER X OBJEKTİF

 (Örneğin oküler 5x, objektif 40x olan bir mikroskobun

büyütmesi = 5 X 40 = 200 olur.)
 Bununla birlikte, ışık mikroskopları hücre yapısının çok ince
ayrıntılarını göstermek için yeterince güçlü değildir, bunun
için rezolüsyon - bir mikroskobun, küçük mesafelere
ayrılmış objeleri ayırt etme kapasitesi – büyütmeden bile
daha önemlidir.

 Rezolüsyon , birbirine çok yakın iki cismin mercek

tarafından ayırt edilebilme kapasitesidir.

 Görüntüler istenildiği kadar büyütülebilir ancak bu şekilde

büyütme gözlenebilen detay düzeyini arttırmaz.
 Bir ışık mikroskobunun rezolüsyon sınırı
yaklaşık 0,2 mikrometredir, birbirine
bu mesafeden daha yakın olan iki cisim
birbirinden ayırt edilemez.
 Karanlık Alan Mikroskobu
 Normal ışık mikroskobundaki kondansör
yerine, karanlık saha kondansörü konmuştur.
 Bu özel kondansör, ışık kaynağından gelerek
objektife gidecek olan merkezdeki ışınların
geçişini engeller.(zemin karanlık)
 Kenarlardan geçen ışınlar, preparat
merkezindeki objeye yansıtılır.
 Öncesinde sadece karanlık bir alan şeklinde
görülürken, preparat yerleştirildiğinde oblik
ışınlar partiküller tarafından yön değiştirerek
objektife, okülere ulaşır. Bu yansımalar
karanlık alan içinde parlak aydınlık
görüntüler olarak algılanır.
 Bakterilerin hareketi ve incelenmesi
 Özellikle boyanmamış örneklerin
görüntülenmesinde yararlıdır.
 Tıpta spiroket gibi bakterilerin
ayırdedilmesinde önemli yer tutar.
Faz Kontrast Mikroskobu
 Hücrenin çeşitli kısımlarından geçen ışık miktarı birbirine çok
yakın olduğu için insan gözü bu farkı ayırt edemez.

 Işık mikroskobuna bazı optik kısımlar ilave edilerek hücrenin

çeşitli kısımlarından geçen ışık şiddeti arasındaki fark arttırılır.

 Bu şekilde oluşturulan mikroskoplara faz-kontrast mikroskopları

adı verilir.

 Faz kontrast sistemi mikroskobun ayırma gücünü artırmaz,

sadece hücrenin çeşitli kısımları arasındaki kontrastı artırır.
 Şeffaf örnekleri incelemek için
idealdir.

 Bakteri ve mikroorganizmalar ile

kendilerini çevreleyen sıvının ışınları
kırma indisi veya yoğunluklarının
birbirine yakın olması incelemeyi
zorlaştırır.

 Optik sistemlerle, ortama göre

yoğunluğu fazla olan
mikroorganizmaların yoğunlukları
biraz daha arttırılabilir.

 Böylece obje ile objeyi çevreleyen sıvı

ortam arasında bir zıtlık sağlanmış
olur.
 Canlı hücreleri görüntülemek için çok yaygın iki yöntem,
faz kontrast mikroskopisi ve
diferansiyel interferens-kontrast mikroskopisidir
(Orneğin icinden gecen ısık, faz değisimleri meydana getirir. Bu faz
değisimleri genlik farklarına donusturulur ve daha yuksek kontrast
olusturulmasına olanak verir).

 Her iki mikroskopide de, hücrenin farklı bölgeleri arasındaki

yoğunluk veya kalınlık farklılıklarını, sonuçtaki görüntüde
kontrast farklılıklarına dönüştüren optik sistemler kullanılır.
 Saydam yapılar ışığı çok az soğurduklarından, düşük kontrast
verirler. Ancak ışık bu yapılardan geçerken yavaşlar ve
çevresindeki sitoplazmadan geçen ışığa kıyasla faz değişikliği
olur.

 Faz kontrast ve diferansiyel interferans-kontrast mikroskopları,

bu faz farklılaşmalarını kontrast farklılaşmalarına çevirerek, canlı,
boyanmamış hücrelerin daha gelişmiş görüntülerinin elde
edilmesini sağlar.
Fluoresan Mikroskobu
 Bir obje üzerine gelen
ışınların, yansıdıktan
sonraki dalga boylarının,
ilk ışınların dalga
boyundan farklı 450-490 nm
arasındaki

olmasına fluoresan ışınları geçirir

denir.
510 nm altındaki
ışınları yansıtır,
İstemeyen fluoresan 510 nm üstündeki
sinyallerini ışınları geçirir
engeller.Sadece 520-560
nm dalga boyundaki
ışınları geçirir.
 Prensip: Bazı maddeler kısa dalga boyundaki
ışığı absorbe ederek uzun dalga boyunda ışık
olarak yansıtırlar.

 Floresan mikroskoplarda bu özellikten

yararlanılarak görüntü elde edilir.

 Floresan mikroskop ile 0,1 µm kadar olan

cisimler incelenebilmektedir.
 Bu mikroskoplarda, ışık kaynağı olarak
ultraviyole dalga boyunda ışık veren cıva buharlı
ampuller kullanılmaktadır.

 Görüntü elde edebilmek için bu ışınlarla

karşılaştığında floresans veren boyalar kullanılır.

 Floresan mikroskoplar , kullanılan ışığın dalga

boyunu seçmeye yarayan özel filtre serileriyle
donatılmıştır.
 Bu filtre serilerinden ilki
kaynaktan gelen ışığı tutar
ve sadece cismin boyandığı
floresan boyanın absorbe
edebileceği ışınları geçirir.

 İkinci filtre serisi ise cisimden

yansıyan ışınların çevreye
yayılmasını engeller ve
sadece cisimden gelen daha
yüksek dalga boyundaki
ışınları geçirir.
EPİTEL HÜCRELERİ
Konfokal Mikroskop
 Yüksek kontrastlı ve ayrıntılı görüntüler elde
etmek amacıyla, floresans mikroskopisini
elektronik görüntü analizleriyle kombine eder.

 Genellikle bir lazer ile sağlanan küçük bir ışık

noktası, incelenecek örnek üzerine, belirli
derinlikte odaklanır.

 Yayılan floresan ışık, video kamera gibi bir

detektör vasıtasıyla toplanır.
 Ancak, yayılan ışık detektöre ulaşmadan önce,
tam olarak, örneğin seçilen derinliğinden
gelen ışığın odaklandığı noktaya yerleştirilen
bir iğne deliği açıklığından (konfokal açıklığı)
geçmesi gerekir.

 Sonuç olarak, sadece odaklanılan düzlemden

gönderilen ışık detektöre ulaşabilir.
 İncelenen örneğin baştan sona
taranması ile, odaklanılan düzlemin,
standart floresans mikroskopisi ile elde
edilenden çok daha keskin iki-boyutlu
görüntüsü elde edilir.
 Diğer mikroskoplardan farkı, kesit
kalınlığı içinde farklı seviyelerde
netleşmeyi sağlayıp kesitten daha ince
optik kesitler alınmasını sağlamasıdır.
Multi-foton Eksitasyon
Mikroskopisi
 Canlı hücrelerin incelenmesinde
konfokal mikroskopiye alternatiftir.

 İncelenecek örnek, floresan boyanın,

eksitasyonu için aynı anda iki veya daha
çok foton soğurmasına uygun bir dalga
boyunda ışıkla aydınlatılır.
 İki fotonun aynı anda floresan boyayı uyarma
olasılığı, sadece, örneğin içerisine giren lazer
ışının odaklandığı noktada anlamlıdır, böylece
floresans yalnızca giren ışığın odaklanmış
olduğu düzlemden yayılır.

 Bu çok iyi sınırlanan eksitasyon sayesinde,

yayılan ışığın konfokal mikroskopisindeki gibi
bir iğne deliği açıklığından geçirilmesine gerek
olmadan, otomatik olarak üç-boyutlu
çözünürlük elde edilir.
Elektron Mikroskobu
 Elektron
mikroskobunda,
adından da anlaşıldığı
gibi ışınların yerini
elektronlar almıştır.

 Elektron mikroskobunun
genel planı da, prensip
itibariyle, ışık
mikroskobununkine
benzemekle beraber
ikisi arasında bazı
farklar vardır.
 1.fark, ışık kaynaklarındadır.

 Işık mikroskobunda, ışık kaynağı olarak,

güneş ışığı veya elektrik ışığı kullanılır.

 Elektron mikroskobunda ise ışık kaynağı bir

metal parçasıdır. Bu metal parçası ısıtılınca
elektron çıkarmaya başlar.
 2. fark kullanılan merceklerdedir.

 Işık mikroskobunda cam mercekler kullanılır.

 Elektron mikroskobunda ise manyetik bobinlerle

meydana getirilmiş manyetik alanlar kullanılır. Bunlara
manyetik mercekler denir.

 Manyetik mercekler tel bobinlerden yapılmıştır. Bu

bobinlerle manyetik alanlar meydana getirilir.
 3. fark olarak,

 Işık mikroskobundaki iki ucuna cam

mercekleri yerleştirilen tüp yerine

 Elektron mikroskobunda silindir şeklinde bir

sütunun (kolon) bulunuşudur.

 Bu sütunun içi vakum altında tutulur. Yani

havası boşaltılmıştır. Vakum elektron
akımlarının dağılmasını önler.
 4. fark olarak

 Işık mikroskobunda bulunan kondansör yerine

 Elektron mikroskobunda bir manyetik bobinin bulunmasıdır.

 Işık mikroskobunda ışık kaynağından gelen ışık

kondansörden geçerek objenin üzerine gelir ve birinci mercek
sistemi olan objektiften geçerek objenin büyük ve ters bir
görüntüsünü verir.

 Bu görüntü ikinci mercek sistemi olan okülerden geçerken biraz

daha büyür, fakat yine terstir. Gözle bu büyük ve ters görüntü
görülür.
 Elektron mikroskobunda ise ısınan metal parçasından çıkan
elektronlar bir akım teşkil ederek vakumlu sütun içinde ilerler.

 Elektronlar vakumlu bir ortamda düz bir yol izler ve ışık

özelliklerine sahiptirler. Titreşen partiküllerden yapılmışlardır.

 Birinci manyetik mercek bir kondansör gibi elektron akımını

objenin üzerine yollar.

 İkinci manyetik mercek objektif gibi davranır ve objenin büyük

ve ters görüntüsünü meydana getirir.

 Üçüncü manyetik mercek, oküler gibi, bu görüntüyü daha da

büyütür, fakat yönünü düzeltir. Yani ters görüntü düzelir.
Elektron Mikroskopu

İnsan gözünün ayırdetme gücü

0.1 mm
Işık mikroskobunun ayırdetme gücü
0.2 μm
Elektron mikroskobunun ayırdetme
gücü
0.1 nm dir.
Kullanım Alanları
 hücre içi organellerin yapıları
 organellerin hücre içindeki dağılımı
 organellerin diğer organeller ile
komşuluğu
 organellerin fonksiyonel ilişkileri
 çekirdeğin yapısı
 membran bütünlüğü
 membrandaki değişiklikleri
 dokuların organizasyonu
 matriks lifleri
 hücre matriks ilişkileri görülebilir.
 patolojik dokularda Taramalı EM’in
tanısal değeri vardır.
 İki tip elektron mikroskobu vardır ;

- SEM (Scanning Electron Microscope)

- TEM (Transmission Electron Microscope)
- SEM (Scanning Electron Microscope)
 Taramalı (scanning) elektron mikroskobunda
kesit yerine objeye total olarak bakmak, üç
boyutta morfolojik ayrıntıları görmek
mümkündür.
 Bu üç boyutlu görüntü kaplanmış doku
yüzeyine çarparak saçılan elektronların bir
dedektör ile toplanmasıyla oluşur.
- TEM (Transmission Electron Microscope)
 Geçirmeli (transmisyon) elektron mikroskobu
da ince kesitlerle hücrenin ince yapısının
incelendiği modellerdir.
 TEM’in çalışma prensibi kurşun sitrat-uranil
asetat ile boyanmış dokunun içinden geçen
elektronlarla etkileşimi esasına dayanmaktadır.
Oluşan görüntü siyah-beyaz ve iki
boyutludur.
Transmission Electron
Microscope
TEM
TEM
 SEM ile örneğin yüzey morfolojisi incelenirken,
 TEM’de örnek derinlemesine incelenmektedir.
 SEM’in örnek şekli hacimli ve büyükken,
TEM’inki ince film tarzındadır.
TEM-SEM
MİTOKONDRİ(TEM- SEM)
 TEM’in çalışma prensibi yumuşak dokuların incelenmesine
uygundur. Bu nedenle çoğunlukla patolojik doku biyopsilerinin,
mikrobiyolojik materyallerin, doku ve organ araştırmalarının
incelenmesinde kullanılır.
 SEM ise daha büyük boyutta ve sert materyal yüzeylerinin
incelenmesine olanak sağladığı için sanayi ağırlıklı olmak üzere
tıp ve diş hekimliği alanlarında da kullanılmaktadır
TEŞEKKÜRLER