R&E

2021

애엽 추출물의 대장암세포 증식 억제
효과와 텔로머레이스 활성의 관계
The interconnection between cancer cell apoptosis and telomerase inhibition of artemisia ar-
gyi extract

성아영 · 김시환 · 이나원 · 김세민

인천과학고등학교
INCHEON SCIENCE HIGH SCHOOL
목차

1. 서론

2. 연구과정 및 결과 2.1 애엽 추출물 제조

2.2 애엽 추출물 (DAM) 처리에
따른
세포 형태 (morphology) 변화
애엽 추출물의 대장암세포 증식
2.3 애엽 추출물 (DAM) 처리에
억제 효과와 텔로머레이스 활성의
따른
관계
The interconnection between cancer cell apoptosis and telomerase inhi-
bition of artemisia argyi extract 세포의 생존 능력 (viability)
측정
2.4 애엽 추출물 (DAM) 처리에
따른
telomere 길이 변화
2.5 Western blot 을 통한
3. 고찰 연구 요약 발현량 확인
3.1 Telomerase
고찰p21 발현 정도 비교
3.2 p53,
2.6
애엽 추출물의 대장암세포 증식 억제
효과와 텔로머레이스 활성의 관계
The interconnection between cancer cell apoptosis and telomerase inhibition of artemisia argyi extract

1. 서론
1. 서론

1. 연구의 필요성
• 암으로 인한 국내 사망률이 최대

• 암 치료가 어려운 이유 = 정상세포에 유해할 수 있기 때문으로 알려져 있음

• 정상세포에 무해하게 암을 치료할 수 있는 방법이 필요

Fig. 국내 사망률
1.2 Telomere 와 Telomerase

1. telomere
• 염색체 끝부분에 위치한 반복적인 DNA 부분

• 세포분열이 진행되며 telomere 의 길이 감소하다 소모되면

염색체 보호 기능 수행 불가
→세포분열 중단 , apoptosis 를 유도
→ 세포의 수명을 결정하는 역할을 함 .
2. telomerase
• RNA, 단백질로 구성된 telomere 역전사효소
→ RNA 서열을 주형으로 telomere 의 길이를 연장시킴 .

3. 암세포와 telomere, telomerase

• 정상세포 → telomerase 발현 X → 유한한 세포분열
• 암세포 → telomerase 발현 O, telomere 길이 유지
무한한 세포분열
연구 주제 설정

idea

어떤 물질 ?
정상세포에 무해하게 암세포 한약재 추출물 중 애엽 추출물이 암세포 증식
증식을 억제하는 암치료제 억제 효과가 높음 ( 구자비 외 , 2005 )

연구주제
대장암 세포주 HT-29 에 대한 애엽
추출물의 세포 독성 효과와 아폽토시스
어떤 기작 ? 유도 효과가 애엽 추출물의 암세포 억제 효과가 telomerase
입증됨 ( 이정민 외 , 2010) 활성 저하와 관련이 있을까 ?

암세포는 정상 세포와는 달리
아폽토시스와 telomere 감소가 높은
telomerase 발현으로 인한
관련성이 있음 (Zhang 외 , 1999; Lechel 외 ,
telomere 길이 유지
2005)
-> 지속적인 분열 가능
애엽 추출물의 대장암세포 증식 억제
효과와 텔로머레이스 활성의 관계
The interconnection between cancer cell apoptosis and telomerase inhibition of artemisia argyi extract

2. 연구 과정 및 결과
2.1 애엽 추출물 제조
2.2 애엽 추출물 (DAM) 처리에 따른 세포 형태 (morphology) 변화
2.3 애엽 추출물 (DAM) 처리에 따른 세포의 생존 능력 (viability) 측정
2.4 애엽 추출물 (DAM) 처리에 따른 telomere 길이 변화
2.5 Western blot 을 통한 Telomerase 발현량 확인
2.6 p53, p21 발현 정도 비교
초기 실험 설계

- 메탄올 용매 추출 및 감압농축
애엽 추출물 (DAM) 제조
- DMSO 에 희석

- 세포 culture 연습
애엽 추출물 (DAM) 처리에 따른
- 위상차 현미경 ( 도립 ) 을 통한 세포 관찰
세포 형태 (morphology) 변화 - 애엽 추출물의 암세포 억제 효과 확인
연구주제

애엽 추출물의 암세포 억제 효과가 telomerase

활성 저하와 관련이 있을까 ?
애엽 추출물 (DAM) 처리에 따른 - Colony forming assay
세포 생존 능력 (viability) 측정 진행하여 세포 생존률 측정

애엽 추출물 (DAM) 처리에 따른 - qPCR 진행하여 DNA 의

telomere 길이 변화 telomere 길이 측정
2.1 애엽 추출물의 제조

1) 건조된 애엽을 분쇄 후 분쇄물에 메탄올을 넣고 이틀간 상온에서 진탕 배양 (Shaking incubation) 하여 1 차

추출물 제조 .

2) 1 차 추출물을 185mm filter paper 와 깔때기를 이용해 여과 . → 2 차 추출물

3) 2 차 추출물을 50°C 에서 감압농축하여 methanol 을 모두 증발시켜 애엽 추출물 (AAM) 제조 .

4) AAM 을 syringe filter(0.2 ㎛ ) 를 사용하여 멸균 .

5) 세포주에 처리했을 때 DMSO 1% 가 되도록 AAM 을 희석 . → DAM

Fig. AAM 제조 Fig. AAM 제조 Fig. DAM 제조 Fig. 1ml 씩 분할해 보관한
DAM
2.2 애엽 추출물 (DAM) 처리에 따른 세포 형태 변화

1. 연구방법
1) 6well plate(30006, SPL, Korea) 에 HeLa 세포는 3.3×105 개 , HT-29 세포는 1.3×106 개 (30%) seeding.

2) 약 18 시간 이후 각 well 별로 DAM 농도가 각각 0, 25, 50, 100μg/mL 가 되도록 처리 .

3) 도립 위상차 현미경 (IX71, OLYMPUS, Japan) 을 이용하여 첫날 제외 1 일 3 회 , 7:30, 13:15, 23:30 에

관찰 ( 첫날은 추가적으로 16:30 에 관찰 .)
2.2 애엽 추출물 (DAM) 처리에 따른 세포 형태 변화

2. 연구결과
• HT-29 cell 의 colony 가 뚜렷하게 관찰됨 .

• HT-29 가 DAM 의 농도가 증가함에 따라 더 많은 비율의 죽은 세포가 관찰됨 .

2.2 애엽 추출물 (DAM) 처리에 따른 세포 형태 변화

2. 연구결과
• HeLa 는 colony 를 형성할 때 주위에 넓게 분포하여 자라며 개체 수가 충분히 많아지면 뭉쳐서 자람

• HeLa 는 세포 수의 변화 뚜렷하지 않고 세포의 모양이 불규칙하게 변화

2.3 애엽 추출물 (DAM) 처리에 따른 세포의 생존 능력 (viability) 측정

1. 연구 방법
1) 6well plate 의 각 well 에 300 개의 세포를 희석하여 seeding.

2) 24 시간 후 각 well 에 DAM(0, 25, 50, 100 μg/mL) 을 처리한 후 , 37°C 에서 5% CO2 가 유지되는
배양기에서 배양 .

3) 13 일 후 배지를 제거하고 Coomassie brilliant blue 용액 (50% methanol, 10% acetic acid, 0.25%
coomassie brilliant blue) 1mL 로 5 분간 염색 .

4) 형성된 colony 수 counting.

Fig. viability assay

2.3 애엽 추출물 (DAM) 처리에 따른 세포의 생존 능력 (viability) 측정

2. 연구 결과
• HT-29 와 HeLa 모두 DAM 농도가 증가할 수록 세포의 생존 능력은 감소

• Morphology 관찰에서보다 더 높은 민감도 →세포 밀도가 낮을 수록 더 큰 민감도를 나타냄

• 100 μg/mL 의 높은 농도에서는 1% 이하의 강력한 세포독성효과를 나타냄

Fig. 염색 후 형성된 colony 왼쪽 HeLa, 오른쪽 HT-29, (a)0 μg/mL(b)25 μg/mL(c)50 μg/mL(d)100 μg/mL
2.4 애엽 추출물 (DAM) 처리에 따른 telomere 길이 변화

1. 연구 방법
• Telomere 의 길이를 측정하기 위하여 qPCR 을 실시

real time
Cell culture DNA 추출
PCR
GenElute TM Mammalian kit Absolute Human Telomere Length
Quantification qPCR kit
2.4 애엽 추출물 (DAM) 처리에 따른 telomere 길이 변화

1. 연구 방법 -real time PCR

• DNA 가닥에 SYBR-green 이 결합
single strand 상태에서는 형광을 발현 X
double strand 상태에서는 형광을 발현

 실시간으로 형광의 양을 측정해 증폭된 DNA 의 양을 측정할 수 있음 .

2.4 애엽 추출물 (DAM) 처리에 따른 telomere 길이 변화

Fig. telomere 길이 qPCR DNA 증폭 결과

Fig. telomere 길이 qPCR Melt curve Fig. telomere 길이 qPCR Melt peak
2.4 애엽 추출물 (DAM) 처리에 따른 telomere 길이 변화

1. 연구 방법 -∆∆Cq Method

⦁ΔCq(TEL)=Cq(TEL, target DNA sample)-Cq(TEL, reference DNA sample)

⦁ΔCq(SCR)=Cq(SCR, target DNA sample)-Cq(SCR, reference DNA sample)
⦁ΔΔCq[=ΔCq(TEL)-ΔCq(SCR)
⦁reference DNA sample 에 대한 target DNA sample 상대적 Telomere 길이 =
⦁target DNA sample 의 chromosome 말단 1 개의 평균 telomere 길이 =935kb× /92
2.4 애엽 추출물 (DAM) 처리에 따른 telomere 길이 변화

2. 연구결과
• DAM 을 0, 25, 50 μg/mL 처리한 HT-29 와 HeLa 의 DNA 를
*
각각 추출하여 Comparative ∆∆Cq (Quantification Cycle Value)
Method 에 따라 분석 . *
• HT-29 의 초기 telomere 길이가 HeLa 에 비해 길다 * 는
특성을 가지고 있음 .

• HT-29 에서는 DAM 농도가 증가함에 따라 telomere

길이가 감소했지만 , HeLa 는 경향성을 보이지 않음 *.

Fig. DAM 처리 농도에 따른 telomere 길이 변화

 애엽 추출물 (DAM) 제조
추가 실험 설계 (1)- Western Blot
애엽 추출물 (DAM) 처리에 따른
세포 형태 (morphology) 변화
연구주제

애엽 추출물 (DAM) 처리에 따른

애엽 추출물의 암세포 억제 효과가 telomerase 세포 생존 능력 (viability) 측정
활성 저하와 관련이 있을까 ?

애엽 추출물 (DAM) 처리에 따른

telomere 길이 변화

작은 Cq 값의 차이로 telomere 길이의

차이가 크게 나타남

이중 검증

3 회 반복 실험을 통한 애엽 추출물 (DAM) 처리에 따른

Telomerase 발현량 확인
경향성 확인
(Western Blot)
2.4 애엽 추출물 (DAM) 처리에 따른 telomere 길이 변화

1. 연구 방법 -Western Blot
1. Cell culture 2. 세포 파쇄 , 단백질 추출

3. SDS-PAGE 4. Transfer

- Large Transfer Target

protein protein

+ Small

5. Blocking 6. 1st Ab 7. 2nd Ab

Substrate

Skim milk
2.5 Western blot 을 통한 Telomerase 발현량 확인

1. 연구 방법
1) HT-29 와 HeLa 에 DAM 을 농도 별로 처리한 후 24 시간 후 Cell scrapper 로 수거
2) 수거한 Cell 들을 3000 rpm, 4℃ 에서 원심분리하고 , RIPA buffer 50µl 로 용해한 세포 현탁 후 파쇄
3) 세포 용해액에 Bradford 용액 2mL 를 넣고 분광광도계를 이용해 단백질 정량
4) 단백질 20µg 을 전기영동하고 , Nitrocellulose membrane 으로 390mA 에서 1 시간 30 분 간 transfer
5) TBS 로 membrane 3 회 세척 후 , 실온에서 non-fat milk 로 40 분간 blocking
6) 단백질 항체는 3% bovine serum albumin 용액에 희석하여 상온에 3 시간 ,
2 차 항체는 non-fat milk 에 희석하여 상온에서 1 시간 반응
7) 항체 처리된 Nitrocellulose 막 세척 후 ECL 용액 처리
8) Chemidoc XRS 를 통해 화학적 발광 반응 사진 촬영
2.5 Western blot 을 통한 Telomerase 발현량 확인

Fig. cell harvest

Fig. 단백질 전기영동 과정

Fig. 세포 파쇄 과정
2.5 Western blot 을 통한 Telomerase 발현량 확인

Fig. 단백질 전기영동 후 transfer Fig. blocking

Fig. transfer Fig. chemidoc 사용과정

2.5 Western blot 을 통한 Telomerase 발현량 확인

2. 연구 결과
1) HT-29

DAM 을 처리하였을 때 , GAPDH 대비 telomerase

발현량이 감소 .

특히 DAM 의 농도가 50μg/mL 일 때 , 크게

감소 *.
*
DAM 을 처리하지 않았을 때 band intensity 가 HeLa
보다 높게 관찰됨을 통해 평균 telomerase 활성이
HeLa 보다 더 높다는 것을 입증 .
Fig. DAM 농도 변화에 따른 telomerase 활성량
2) HeLa

DAM 의 농도 변화의 따른 telomerase 발현 변화량

차이가 적고 , 경향성이 없음 .
추가 실험 설계 (2)

DAM 농도가 높을수록 24 시간 내에 빠르게 죽는

죽는 cell 많이 관찰 cell 관찰

HT-29 에서 DAM 농도가

높아짐에 따라
telomere 길이와 telom-
erase 발현량 감소
x
설명 불가 → 다른 요인 존재

빠른 세포
사멸을
설명할 수 있는
가능성 탐색

DAM 처리에 따른 세포 주기 저해로 인한 가능성과

p53, p21 발현량 측정 관련 단백질 선정
최영형 외 (2020), 정재현 외
(2000),
정원일 외 (2006)
2.5 p53 과 p21

1. p53

• Genome 의 돌연변이가 발생하지 못하도록 조절하는 암 억제

단백질 . G1 기 끝부분에 DNA 손상을 점검 후 세포사멸을
유도하거나 다른 단백질을 유도 .

• P53 이 정상적으로 작동하지 못하면 손상된 DNA 를 가진 세포가

세포분열을 진행하고 , 암이 유도됨 .

2. p21

• P21 은 cyclin-dependent kinase inhibitor 로서 G1 기와 S 기 사이 세포주기

진행을 저지시킴 . → 세포주기 진행 저지 , 손상된 DNA 교정 ,
종양 억제 기능 수행 .

• P21 전사 → 세포 주기 정지 , p21 전사 x → apoptosis 유도

2.6 p53, p21 발현 정도 비교

1. 연구 방법
• GAPDH, p53, p21 의 발현량 확인을 위해 전사된 RNA 길이를 측정 → Reverse transcription PCR 진행

Reverse Tran-
Cell culture RNA 추출
scription PCR
RNANucleoZOLkit TOPrealTM One-step RT
qPCR kit
2.6 p53, p21 발현 정도 비교

1. 연구 방법 -RNA 추출
1) HeLa, HT-29 세포를 각각 60mm culture dish(20060, SPL, Korea) 에 6.6×105 개 , 2.8×106 개 (40%) 를
seeding.
2) 24 시간 후 DAM(0, 25, 50μg/mL) 을 처리 .
3) 24 시간 후에 RNANucleoZOL(MN, Germany) 을 이용해 RNA 를 추출 .
4) nano drop 으로 정량 .
2.4 애엽 추출물 (DAM) 처리에 따른 telomere 길이 변화

1. 연구 방법 - Reverse TranscriptionPCR
• RT-PCR 은 역전사 PCR 로 RNA 를 이용해 진행하는 PCR 이다 .

• RNA 는 단일 가닥의 유전자 서열 가닥으로 , 그 자체는 PCR 반응으로 양을 늘릴 수 없는 구조를 가지고 있음 .

• 따라서 역전사를 통해 DNA 를 만들고 , 원래 RNA 와 상보적인 서열을 가지기 때문에 , cDNA 라고 부른다 .
2.6 p53, p21 발현 정도 비교

1. 연구 방법 -RT-PCR
TOPrealTM One-step RT qPCR Kit(Enzynomics, Korea) 를 이용해 RT qPCR 진행 .

p53:forward 5′-TAACAGTTCCTGCATGGGCGGC-3′, reverse 5′-AGGACAGGCACAAACACGCACC-3′

p21:forward 5′-CACTCCAAACGCCGGCTGATCTTC-3′, reverse 5′-TGTAGAGCGGGCCTTTGAGGC-3′
GAPDH:forward 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′, reverse 5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′
2.6 p53, p21 발현 정도 비교

2. 연구 결과
• DAM 의 처리 농도가 증가함에 따라 HT-29 와 HeLa 에서 모두 p53 의 발현량이 증가

• HT-29 는 p53 이 증가함에 따라 p21 의 발현량도 같이 증가하는 양상을 보임

• HeLa 는 p53 의 발현량은 증가했으나 p21 의 발현량 변화가 없음

→DAM 처리에 따른 빠른 세포 사멸이 p53 과 관련 있음을 확인

애엽 추출물의 대장암세포 증식 억제
효과와 텔로머레이스 활성의 관계
The interconnection between cancer cell apoptosis and telomerase inhibition of artemisia argyi extract

3. 결론 및 고찰
3.1. 고찰
3.2 결론
3.1 고찰

HT-29 와 HeLa 에서 변화 양상 차이
• 세포가 가진 telomere 길이와 telomerase 활성에 따른 DAM 에 대한 민감도 변화

• 주변 세포들에 의한 면역 효과

P53, p21 의 작용

• HT-29 에서 p53 에 의한 apoptosis, HeLa 에서는 p21 증가하지 않음 .

• p21 이 cell cycle arrest 를 유도

• p21 이 탈인산화 또는 caspase 3 에 의해 cleavage 되었을 가능성 .

3.2 결론

연구의 의미 - 암세포 치료제로 가능성 제시

• 애엽추출물 (DAM) 을 HT-29 와 HeLa 에 처리했을 때 처리 농도에 따른 telomere 길이와 telomerase
발현량 의 변화와 세포 내 p53 과 p21 발현량의 변화 차이를 밝혀낸 첫 번째 연구라는 점에서 의미가
있음 .

Telomerase 발현 억제하는 물질 암세포의 증식만 억제 할 가능성

애엽추출물
(DAM)
p53 의 발현을 증가시키는 물질 정상 세포에도 아폽토시스 유발 가능성

• 애엽추출물 (DAM) 을 암세포 치료제로 사용하기 위해서는 성분 분석을 통해 어떠한 성분이 Telomerase
발현 억제하는 물질인지 밝히는 것이 중요함 .
• 애엽추출물 (DAM) 이 실제로 정상 세포에 어떠한 영향을 미치는지 추가 연구가 필요함 .