ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG

THƯ BẰNG TINH DẦU

Các nội dung chính

GIỚI THIỆU TINH DẦU PHƯƠNG PHÁP

1. Giới thiệu

◦ Ung thư là vấn đề ngày càng được quan tâm ở hầu hết các quốc gia trên thế
giới. Theo số liệu báo cáo về ung thư, năm 2012 thế giới có khoảng 14,1 triệu
trường hợp mới và khoảng 8,2 triệu ca tử vong do ung thư, dự đoán đến năm
2030 con số đó lên tới 13 triệu người.
2. Tinh dầu
◦ Tinh dầu là chất lỏng kỵ nước đậm đặc có mùi thơm đặc trưng được tạo ra bởi
các loại thực vật có mùi thơm.
◦ Dễ bay hơi
◦ Là chất chuyển hóa thứ cấp có hàm lượng thấp hơn trong các bộ phận khác của
thực vật.
◦ Tinh dầu từ nhiều loại thực vật có các thành phần chống ung thư
2. Cơ chế hoạt động
◦ Ngăn chặn chu kỳ tế bào,
◦ Apoptosis
◦ Sửa chữa DNA.
Tinh dầu làm giảm sự tăng sinh,
di căn và MDR của tế bào ung
thư.
2. Cơ chế hoạt động của tinh dầu

- Cảm ứng apoptosis : Tăng mức ROS ; Hiệu ứng trên Akt (protein ức chế
khối u) ; Tác dụng lên NF- κ B (yếu tố phiên mã (TF)) ; Tác dụng lên AP-1
(Activator protein-1) ; Lộ trình MAPK
- Bắt giữ chu kỳ tế bào
- Chống di căn và chống tạo mạch
- Tác dụng lên enzyme giải độc
- Điều chỉnh tín hiệu hư hỏng và sửa chữa DNA của tinh dầu
3.1. Nguyên liệu và pha chế tinh dầu

◦ Lá và thân của mỗi mẫu (mỗi mẫu 500 g) được chưng cất bằng thủy phân
trong thiết bị loại Clevenger trong 4 giờ, sau đó tinh dầu được tách ra và làm
khô bằng Na 2 SO 4 khan .
◦ Dầu thu được được bảo quản ở -5°C cho đến khi sử dụng.
 Phân tích GC/MS của tinh dầu
◦ Thành phần của dầu được xác định bằng sắc ký khí (GC) và sắc ký khí khối
phổ (GC/MS).
◦ Máy sắc ký khí Hewlett-Packard 6890 với hai đầu dò ion hóa ngọn lửa (FID)
hoặc với máy dò chọn lọc khối lượng Hewlett-Packard 5973 (GC/MS).
◦ Hai cột mao quản silica hợp nhất
◦ GC: 70 đến 220 °C, 3 °C/phút, duy trì ở 220 °C trong 15 phút.
◦ GC/MS: 250 °C, MS 230 °C.
◦ Khí mang: Helium.
◦ Tốc độ dòng khí mang: 30 cm/s.
 Dòng tế bào và nuôi cấy tế bào

◦ Các tế bào được nuôi cấy trong môi trường Roswell Park Memorial Institute
(RPMI) 1640 hoặc trong môi trường Modified Eagle's Medium (DMEM) của
Dulbecco được bổ sung Huyết thanh bào thai bò bất hoạt do nhiệt (FBS, 10%)
và penicillin 100 U/mL với 100 µg/mL streptomycin, và ủ ở 37°C với môi
trường 5% CO 2
 MTT : đánh giá độc tính trên dòng tế bào
◦ Tế bào được gieo vào các đĩa 96 giếng (2 × 10 4 tế bào/mL trong 200 µL môi trường)
được ủ qua đêm.

◦ Sau 24 giờ, EO (2,5–100 µg/mL), hòa tan trong Dimethylsulfoxide (DMSO) hoặc
Doxorubicin (25 µg/mL) được thêm vào từng giếng và ủ trong 24 giờ.

◦ Sau đó, 200 µL MTT (5 mg/mL trong PBS) được thêm vào từng giếng và ủ tiếp trong
3 giờ sau đó, sản phẩm formazan được hòa tan trong 150 µL DMSO và độ hấp thụ
được đọc trong máy đọc đĩa vi thể (Synergy H1 , Biotek, VT, EUA) ở bước sóng 570
nm.
 Xét nghiệm nhân bản
◦ Tế bào gieo vào đĩa 6 giếng môi trường RPMI.
◦ Ủ trong lò với môi trường CO2 trong 24 giờ.
◦ Tế bào xử lý bằng EO nồng độ này tương ứng.
◦ Môi trường ban đầu loại bỏ và thay thế bằng môi trường DMEM hoàn chỉnh.
◦ Nhuộm màu.
Xem xét sự tăng trưởng và số lượng tế bào sau xử lý và đánh giá tác động
của EO trên sự phát triển của tế bào ung thư
Xét nghiệm tế bào học dòng chảy

◦ Tế bào được nhuộm bằng dung dịch chứa 0,1 µM YO-PRO-1 và 1,5 µM PI, và
huỳnh quang
◦ Định lượng hàm lượng DNA được sử dụng để đánh giá sự phân mảnh DNA
nội bào và phân bố chu kỳ tế bào. Các tế bào được thu trong dung dịch thẩm
thấu chứa 0,1% triton X-100, 2 μg/mL PI, 0,1% natri citrate và 100 μg/mL
RNAse, và phương pháp tế bào học dòng chảy được sử dụng để xác định tính
huỳnh quang của tế bào .
Phân tích tế bào học dòng chảy cho apoptosis

◦ các tế bào được xử lý với nồng độ tinh dầu khác nhau và được ủ trong 48 giờ.
Sau đó, các tế bào được thu thập bằng cách trypsinization, rửa 2 lần bằng PBS
lạnh, huyền phù trong 100 μL dung dịch binding buffer và nhuộm bằng 5 μL
PI (dung dịch gốc 50 μ g/mL) và 5 μL Annexin-V được dán nhãn FITC trong
bóng tối trong 15 phút ở nhiệt độ phòng.
◦ Các tế bào được phân tích bởi Novocyte 2000 (ACEA Bioscatics Inc, USA).
Tỷ lệ nhuộm màu của Annexin-V+ /PI− (tế bào chết rụng), Annexin-V/PI− (tế
bào sống) và nhuộm Annexin-V+ /PI+ (tế bào hoại tử) được xác định sau khi
đánh dấu quần thể dương tính và âm tính.
Phân tích thống kê

◦ Đối với tất cả các thử nghiệm chúng ta lặp lại 3 lần với khoảng tin cậy > = 95
và giá trị p < 0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê.